CN112899194A - 一株短双歧杆菌及其培养方法和用途 - Google Patents

一株短双歧杆菌及其培养方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株短双歧杆菌及其培养方法和用途，该短双歧杆菌的分类命名为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)grx05，其已于2021年1月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.21589，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明提供的短双歧杆菌，不仅对大多数抗生素敏感，且还具有较好的耐胃酸和耐胆盐能力，进而可以降低其潜在的风险，使其具有较为广阔的用途前景。

Description

一株短双歧杆菌及其培养方法和用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，本发明涉及一株短双歧杆菌及其培养方法和用途。
背景技术
益生菌(Probiotics)是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥对肠道有益作用的活性有益微生物的总称。然而，随着抗生素的广泛使用，甚至滥用，导致益生菌对有些抗生素产生耐药性及其耐药基因，而该耐药基因存在转移到其它肠道菌群和致病菌的潜在可能，若其它肠道菌群和致病菌具有上述耐药基因，则可能不会受到抗生素的影响，从而严重危害宿主的健康。
目前，益生菌主要包括乳酸菌、双歧杆菌、乳球菌，其中，双歧杆菌在食品药品中具有不可替代的作用，现有的大量研究表明双歧杆菌具有调整肠道菌群、免疫和防治腹泻等益生功能，尤其是短双歧杆菌。可食用的益生菌制品中主要包含有短双歧杆菌，该短双歧杆菌由于具有耐胃酸和耐胆汁能力，因而可长时间定植于人体内。
然而，从现有的乳制品和药品中分离得到的短双歧杆菌对一些抗生素(例如卡那霉素、链霉素、巴龙霉素和新霉素等)具有耐药性，且耐胃酸和耐胆盐能力也不是较好，从而导致含有上述短双歧杆菌的乳制品和药品的功效受到较大的影响。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的目的就是提供一株短双歧杆菌及其培养方法和用途。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一个方面，本发明提供了一株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)grx05，所述短双歧杆菌已于2021年1月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.21589，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在本发明的一些实施方案中，所述短双歧杆菌的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一些实施方案中，所述短双歧杆菌是从健康母乳中分离得到的。
在本发明的一些实施方案中，所述短双歧杆菌对选自以下的抗生素敏感：利福平、氨苄西林、万古霉素、环丙沙星、头孢唑林、头孢唑林、青霉素和氯霉素。
在本发明的一些实施方案中，所述短双歧杆菌在pH为2.5的胃酸液中处理3h后的活菌存活率不小于90％。
在本发明的一些实施方案中，所述短双歧杆菌在浓度为0.1％w/v的胆盐中处理3h后的活菌存活率不小于70％，其中，w/v表示重量比总混合物的体积。
在本发明的一些实施方案中，所述短双歧杆菌对选自以下的致病菌具有抑制作用：枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌和假单胞菌。
第二个方面，本发明提供了一株上述任一实施方案中所述的短双歧杆菌的培养方法，所述培养方法包括如下步骤：
将短双歧杆菌grx05接种于MRS培养基中，并在厌氧条件下培养。
第三个方面，本发明提供了上述任一实施方案中所述的短双歧杆菌在制备益生菌制品中的用途。
在本发明的一些实施方案中，所述益生菌制品为发酵乳、乳饮料、活菌制剂、发酵果蔬饮料、奶粉或米粉。
本发明提供的实施方案，至少具有如下有益效果：
1)本发明提供的短双歧杆菌，不仅对大多数抗生素敏感，且还具有较好的耐胃酸和耐胆盐能力，进而可以降低其潜在的风险，使其具有较为广阔的用途前景。
2)本发明提供的上述短双歧杆菌的制备方法，该方法简单，可以快速获得本发明的短双歧杆菌。
3)本发明提供的上述短双歧杆菌在制备益生菌制品中的用途，含有该短双歧杆菌的益生菌制品具有较低的潜在风险，并能够降低益生菌的摄入成本，提升益生菌摄入体验及提高消费者的身体素质。
除了上面所描述的本发明解决的技术问题、构成技术方案的技术特征以及由这些技术方案的技术特征所带来的有益效果外，本发明提供的短双歧杆菌及其培养方法和用途所能解决的其他技术问题、技术方案中包含的其他技术特征以及这些技术特征带来的有益效果，将在具体实施方式中作出进一步详细的说明。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1培养所得的短双歧杆菌grx05的菌落形态图；
图2为本发明实施例1培育所得的短双歧杆菌grx05的系统进化树图。
关于生物材料保藏的说明
本发明涉及下列已在于中国普通微生物菌种保藏管理中心(中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)进行保藏的生物材料：
短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)grx05，其保藏编号为CGMCCNO.21589，保藏日期为2021年1月4日。
具体实施方式
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
实施例1：菌株的筛选
1、样品采集
采集样品前，对健康志愿者的乳头进行严格的卫生处理，然后收集10mL左右母乳置于无菌离心管中，然后保存于-80℃超低温冰箱中。
2、菌株分离
1)菌株初筛
分别将富集培养后和直接梯度稀释后的的母乳样品分别倾注于MRS-Y1和MRS-Y2液体培养基中，于厌氧袋中37℃培养24～48h至长出单个菌落，挑选具有双歧杆菌典型形态如白色或乳白色的特征单菌落。
2)菌株复筛
将初筛所得到的的菌种划线接种于含溴甲酚紫的MRS-G1和MRS-G2固体培养基中，厌氧培养48h，长出单菌落后，于显微镜下观察菌体形态，将选取的具有典型双歧杆菌和乳杆菌形态的菌株进行后续实验。
图1为本实施例培养所得的菌株的菌落形态图。
从来源于母乳的样品中共分离出69个菌株，经纯化后在改良MRS培养基和普通MRS培养基上菌落形态呈白色且表面光滑；经革兰氏染色后，筛选后得到24株革兰氏阳性菌，其编号和名称如表1所示。
在上述菌株初筛和复筛过程中所使用的培养基组成如下：
改良MRS液体培养基的组成如下：
蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温801.0g/L，莫匹罗星锂盐50mg/L(灭菌后添加)，半胱氨酸盐酸盐的浓度为500mg/L(灭菌后添加)，水。
改良MRS固体培养基的组成如下：
蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，琼脂14.0g/L，吐温801.0g/L，莫匹罗星锂盐50mg/L(灭菌后添加)，半胱氨酸盐酸盐的浓度为500mg/L(灭菌后添加)，水。
普通MRS液体培养基的组成如下：
蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温801.0g/L，水。
普通MRS固体培养基的组成如下：
蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，琼脂14.0g/L，吐温801.0g/L，水。
3、菌株的鉴定
1)分别测定筛选的24种菌株的16S rRNA基因序列，将菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的基因序列进行同源性比较，并从分子生物学水平上确定该菌的种属，具体测定结果如表1所示。
结果发现，本发明的短双歧杆菌grx05的16S rRNA与目前已知的其它所有短双歧杆菌的相应序列均不完全相同，其中，有些短双歧杆菌与本发明的短双歧杆菌grx05同源性可达99.41％，进而可以说明本发明的短双歧杆菌grx05是一株以往未被分离得到的新短双歧杆菌。
2)利用细菌基因组DNA提取试剂盒(购买自天根生化科技(北京)有限公司，型号为DP302)提取上述24种菌株基因组DNA，将提取的菌株基因组DNA作为16S rDNA-PCR的模板进行扩增，其中，乳杆菌引物为通用引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT)，双歧杆菌引物为特异性测序引物(Bif164-f：GGGTGGTAATGCCGGATG；PbiR2：GACCATGCACCACCTGTGAA)；扩增的产物进行电泳(120V，30min)以获得纯化的菌株。
将上述纯化的菌株进行基因测序，并将测序结果通过BLAST程序与GenBank基因库进行在线比对。
通过NCBI Blast比对，并结合菌株镜检形态和来源，初步确定22株乳杆菌和2株双歧杆菌，具体请参见表1。其中，24种菌株包括12株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)，8株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，1株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，1株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，1株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，1株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和1株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)。
根据上述比对结果，下载短双歧杆菌的fasta格式序列文件，将下载的序列文件导入Mega 5软件进行序列比对，并根据比对结果构建系统进化树，如图2所示。
表1
菌株编号 中文名称 拉丁文名称 来源 同源性％
M7 副干酪乳杆菌 Lactobacillus paracasei 母乳 99.46
M15 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 母乳 98.51
M28 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 母乳 97.31
M33 副干酪乳杆菌 Lactobacillus paracasei 母乳 98.80
M48 副干酪乳杆菌 Lactobacillus paracasei 母乳 98.94
M49 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 母乳 98.72
M53 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 母乳 97.73
M55 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 母乳 97.61
M60 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 母乳 96.90
M64 副干酪乳杆菌 Lactobacillus paracasei 母乳 99.78
M65 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 母乳 98.56
M70 副干酪乳杆菌 Lactobacillus paracasei 母乳 97.92
M71 副干酪乳杆菌 Lactobacillus paracasei 母乳 98.68
M79 副干酪乳杆菌 Lactobacillus paracasei 母乳 99.35
M80 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 母乳 97.76
M84 副干酪乳杆菌 Lactobacillus paracasei 母乳 99.15
M87 干酪乳杆菌 Lactobacillus casei 母乳 98.08
M91 发酵乳杆菌 Lactobacillus fermentum 母乳 98.56
M93 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 母乳 98.10
M101 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 母乳 98.11
M103 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 母乳 98.67
M113 植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum 母乳 98.85
grx05 短双歧杆菌 Bifidobacterium breve 母乳 99.41
S16 两歧双歧杆菌 Bifidobacterium bifidum 母乳 99.53
4、短双歧杆菌grx05的核苷酸序列测定
对上述短双歧杆菌进行PCR扩增，扩增条件所采用的引物为：
上游引物Bif164-f：gggtggtaatgccggatg，10μM，2μL/50μL；
下游引物Pbi R2：gaccatgcaccacctgtgaa，10μM，2μL/50μL；
对上述扩增后的产物进行测序，得到短双歧杆菌grx05的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
实施例2：短双歧杆菌grx05的耐酸和耐胆盐能力
1)耐酸能力的测试
菌体悬浮液的配制：将筛选得到24种菌株分别进行厌氧培养活化后，按3％的接种量分别接种到MRS-Y1液体培养基(培养双歧杆菌)和MRS-Y2液体培养基(培养乳杆菌)中，37℃厌氧培养24h后，6000×g离心10min收集菌体，向菌体中加入灭菌的PBS缓冲液，得到菌体悬浮液，其中，菌体悬浮液中的OD600为1.0。
胃液的配制：分别取0.5g NaCl和0.3g胃蛋白酶溶解于去离子水中，用1.0mol/L的盐酸调pH至3.0，加去离子水至100mL，0.22μm滤器过滤除菌，4℃冰箱冷藏备用。
取1.0mL的菌体悬浮液接种至9.0mL、pH 2.5的胃液中，37℃厌氧培养3h，分别在0h和3h利用平板计数法测定活菌数，以计算存活率(％)，结果如表2所示。
Figure BDA0002939063010000071
表2
Figure BDA0002939063010000072
Figure BDA0002939063010000081
从表2可知，从来源于母乳的样品中分离出的22株乳杆菌均具有一定的耐酸能力，其中，除菌株M33以外，其余杆菌表现出较好的耐酸能力；2株双歧杆菌存活率均大于70.00％，其中，本发明的短双歧杆菌grx05菌株的存活率可达94.35％。
2)耐胆盐能力测试
胆盐培养基配制方法：称取一定量的胆盐于MRS液体培养基中，使其胆盐浓度(w/v)为0.1％，调节pH至6.5±0.2，121℃灭菌15min，冷却备用。
将筛选得到24种菌株分别进行厌氧培养活化后，按3％的接种量分别接种至含0.1％胆盐的MRS-Y1(培养双歧杆菌)和MRS-Y2(培养乳杆菌)培养基中，37℃厌氧培养，分别在0h和3h用平板计数法测定活菌数，以计算存活率(％)，结果如表3所示。
Figure BDA0002939063010000082
表3
Figure BDA0002939063010000083
Figure BDA0002939063010000091
由表3可知，乳杆菌M53，M60，M71，M113培养3h后活菌数大于1×106CFU/mL，其中菌株M53存活率最高，达到了45.72％；其余乳杆菌菌株存活率均小于1％，进而能够表明来源母乳的乳杆菌菌株的耐胆盐能力较弱。在2株双歧杆菌中，本发明的短双歧杆菌grx05的耐胆盐能力最强，可达到75.54％。
实施例3：菌株对致病菌的抑制作用
选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌和假单胞菌6种致病菌作为指示菌，采用牛津杯法测定菌株对致病菌的抑制作用，测定结果如表4所示。
在平板底部倾倒薄层琼脂，该琼脂中加入本发明实施例分离所得的菌株；将致病菌于LB液体培养基中37℃培养24h，取0.1mL的致病菌菌液涂布于30mL LB固体培养基表面；在水平放置的平板中均匀地放置灭菌的牛津杯，吸取0.2mL待测菌菌悬液于牛津杯中。将平板放置3-4℃冰箱中扩散24h，然后在37℃中培养24h，测量抑菌圈大小，每个菌株重复三次。
表4
Figure BDA0002939063010000092
注：+表示为抑菌圈直径<5mm；
++表示为抑菌圈直径介于5mm和10mm之间；
+++表示为抑菌圈直径介于10mm和15mm之间；
++++表示为抑菌圈直径>15mm。
从母乳中分离出的鼠李糖乳杆菌和双歧杆菌对沙门氏菌、大肠杆菌和假单胞菌均具有明显的抑制效果，抑菌圈直径均大于15mm。其中，菌株M113还对蜡样芽胞杆菌有一定的抑制能力，抑菌圈直径介于5mm和10mm之间，可以有效抑制肠道内病原微生物的生长。
实施例4：菌株对抗生素药性的测试
参照CLSI抗微生物药物敏感试验执行标准，本实施例对筛选到的7株菌株和LGG(鼠李糖杆菌GG株)进行耐药性测试，测试结果如表5所示。
表5
Figure BDA0002939063010000101
注：S表示敏感；
I表示中介；
R表示耐药。
由表5可知，不同样品来源的同种菌株在耐药性方面存在差异。其中4株乳杆菌对头孢类，利福平和氯霉素敏感，菌株M71同时对氨苄西林，青霉素，克拉霉素和四环素敏感，具有良好的安全性。2株双歧杆菌对万古霉素，头孢类和氯霉素敏感，同时短双歧杆菌grx05对利福平、氨苄西林、万古霉素、环丙沙星、头孢唑林、头孢唑林、青霉素和氯霉素敏感。与婴幼儿准用菌株LGG相比，本发明提供的短双歧杆菌grx05对抗生素敏感的种类更多。
综上所述，本发明提供的短双歧杆菌，不仅对大多数抗生素敏感，且还具有较好的耐胃酸和耐胆盐能力，进而可以降低其潜在的风险，使其具有较为广阔的用途前景。
实施例5
本实施例提供了一种发酵乳的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
将4～7％的蔗糖溶于沸水中，待其冷却至60～70℃加入12％的脱脂乳粉溶解均匀后均质，95～105℃灭菌10min，接种正常发酵剂和2％的短双歧杆菌grx05，在30～37℃培养至凝乳，转移至4℃进行后熟，得到发酵乳。
实施例6
本实施例提供了一种乳饮料的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
将4～7％的蔗糖溶于沸水中，待其冷却至60-70℃加入12％的脱脂乳粉溶解均匀后均质，95～105℃灭菌10min，接种2％的短双歧杆菌grx05，在32～37℃培养，得到乳饮料。
实施例7
本实施例提供了一种活菌制剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
将短双歧杆菌grx05进行大规模培养，将培养物进行冷冻干燥。
实施例8
本实施例提供了发酵果蔬饮料的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
将果蔬与水1:1～5混合，打浆，95～105℃灭菌10min，冷却至32～37℃，接种2％的短双歧杆菌grx05，发酵12～48小时；
离心，得发酵果蔬汁，添加稳定剂，均质，得到发酵果蔬饮料。
另外，本发明提供的短双歧杆菌grx05还可以用于制备配方奶粉、米粉等食品中。例如，将短双歧杆菌grx05进行大规模培养，将培养物进行冷冻干燥，按照活菌数>106CFU/g添加至配方奶粉、米粉等食品中。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 澳优乳业(中国)有限公司
<120> 一株短双歧杆菌及其培养方法和用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 679
<212> DNA
<213> 短双歧杆菌grx05(Bifidobacterium breve)
<400> 1
cgtcgggaac atgtcaagcc caggtaaggt tcttcgcgtt gcatcgaatt aatccgcatg 60
ctccgccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt tctttgagtt ttagccttgc ggccgtactc 120
cccaggcggg atgcttaacg cgttagctcc gacacggaac ccgtggaacg ggccccacat 180
ccagcatcca ccgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg 240
ctttcgctcc tcagcgtcag taacggccca gagacctgcc ttcgccattg gtgttcttcc 300
cgatatctac acattccacc gttacaccgg gaattccagt ctcccctacc gcactcaagc 360
ccgcccgtac ccggcgcgga tccaccgtta agcgatggac tttcacaccg gacgcgacga 420
accgcctacg agccctttac gcccaataat tccggataac gcttgcaccc tacgtattac 480
cgcggctgct ggcacgtagt tagccggtgc ttattcgaaa ggtacactca acacaaaatg 540
ccttgctccc taacaaaaga ggtttacaac ccgaaggcct ccatccctca cgcggcgtcg 600
ctgcatcagg cttgcgccca ttgtgcaata ttccccactg ctgcctcccg taggagtctg 660
ggccgtatct cagtcccaa 679

Claims (10)

1.一株短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)grx05，其特征在于，所述短双歧杆菌已于2021年1月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.21589，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的短双歧杆菌，其特征在于，所述短双歧杆菌的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的短双歧杆菌，其特征在于，所述短双歧杆菌是从健康母乳中分离得到的。
4.根据权利要求1所述的短双歧杆菌，其特征在于，所述短双歧杆菌对选自以下的抗生素敏感：利福平、氨苄西林、万古霉素、环丙沙星、头孢唑林、头孢唑林、青霉素和氯霉素。
5.根据权利要求1所述的短双歧杆菌，其特征在于，所述短双歧杆菌在pH为2.5的胃酸液中处理3h后的活菌存活率不小于90％。
6.根据权利要求1所述的短双歧杆菌，其特征在于，所述短双歧杆菌在浓度为0.1％w/v的胆盐中处理3h后的活菌存活率不小于70％，其中，w/v表示重量比总混合物的体积。
7.根据权利要求1所述的短双歧杆菌，其特征在于，所述短双歧杆菌对选自以下的致病菌具有抑制作用：枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌和假单胞菌。
8.如权利要求1-7任一项所述的短双歧杆菌的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括如下步骤：
将短双歧杆菌grx05接种于MRS培养基中，并在厌氧条件下培养。
9.如权利要求1-7任一项所述的短双歧杆菌在制备益生菌制品中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述益生菌制品为发酵乳、乳饮料、活菌制剂、发酵果蔬饮料、奶粉或米粉。
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