CN109486722A - 一株具有抗流感能力的粘膜乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有抗流感能力的粘膜乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明的粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)具有抗流感的作用，具体体现在：(1)显著改善流感小鼠体重下降程度；(2)显著改善流感小鼠血液指标；(3)显著改善流感小鼠的呼吸道感染炎症状况；(4)显著降低流感小鼠肺部病毒载量(即显著抑制流感病毒在流感小鼠体内的复制、增值)，因此，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)在制备预防和/或治疗流感的产品中，具有巨大的应用前景。

Description

一株具有抗流感能力的粘膜乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株具有抗流感能力的粘膜乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
流感常在秋冬季时大流行，主要由流感病毒诱发。流感病毒可分为甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒三种，人所患的流感主要是由甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的。一般动物流感病毒不会感染人，人流感病毒也不会感染动物，但是猪比较例外。猪既可以感染禽流感病毒，也可以感染人流感病毒，但主要还是感染禽流感病毒，不过，它们一旦感染禽流感病毒，就极易传染给人，引起人流感大流行，例如，1819-1920年发生的“西班牙流感”。
“西班牙流感”是世界历史上最严重的一次流感大流行，涉及范围广，临床发病率高达40％，并伴随多种类型的肺炎并发症，造成2000-4000万人的死亡，死亡人数远远超出第一次世界大战。因受科学技术条件的限制，当时人们未能分离出“西班牙流感”的致病原，直到1997年，美国科学家在《Science》上发表称1918年的流感病毒与猪流感病毒十分相似，是一种与甲型流感病毒(H1N1)密切相关的病毒。而随后的近一百年时间内，世界范围内仍爆发了多次流感大流行，造成不同程度的人员受难及经济损失。
可以说，从流感出现以来，就一直无法完全控制，呈现间断式爆发。而其无法完全控制的一个主要原因就在于，虽然，多数流感病毒不耐热，于56℃下加热30分钟即可灭活，在室温下传染性亦很快会丧失，但是，流感病毒的变异度极高，其中，变异最频繁的应属甲型流感病毒，每隔十几年便会发生一个抗原大变异，产生一个新的毒株，这种变化称作抗原转变/抗原的质变；在流感病毒亚型内也会发生抗原的小变异，主要是抗原氨基酸序列的点突变，称作抗原漂移/抗原的量变，从而使得人们无法拥有长期有效预防流感的疫苗。
医药领域对流感病毒的致病机理研究早已开展。动物实验研究表明，有多种致病通路可诱发呼吸道的感染，继而引起严重的呼吸系统疾病，而呼吸系统疾病引发的炎症主要集中在动物肺部，表现为肺炎形式，例如，组织病理学检查呼吸道感染小鼠肺部可发现小鼠肺泡结构被破坏，肺间隔断裂，肺泡上皮细胞坏死、脱落等病变；少部分小鼠肺组织可见肺间隔增宽；小鼠局部病变肺组织可见上皮细胞增生。
目前，世界卫生组织认为每年在流感流行高峰前期接种疫苗是最有效的预防手段。现阶段，已经上市的三价流感疫苗有灭活流感疫苗(TIV)和减毒活疫苗(LAIV)两种，由3种病毒组成，包含2种甲型流感病毒株和1种乙型流感病毒株。
而相关流感感染的药物治疗主要有两类西药，一类是神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦，其机理是通过作用在病毒表面的糖蛋白神经氨酸酶，使病毒颗粒无法侵害人体细胞；另一类是M2离子通道阻滞剂如金刚烷胺和金刚乙胺，此类药物是作用于质子通道M2蛋白，通过阻扰其蛋白离子通道以抑制甲型流感病毒的复制。
但是，疫苗注射不能长久有效保护机体不受病毒侵染，而药物治疗在杀死病毒的同时对中枢神经系统有副作用。
因此，仍然需要一种药物或治疗方式，既能够长久有效保护机体不受流感病毒侵染，也能够缓解流感的一些临床病症，同时，不会给患者中枢神经系统带来副作用。
近年，大量的研究表明，肠道微生物对于维持人体健康有着重要的作用，同时，益生菌在人类干预研究中对健康的影响包括改善儿童急性腹泻，缓解儿童牛奶过敏、特应性皮炎以及缓解人肠易激综合征，并且，益生菌可能通过肠道粘膜产生影响，通过抑制病原微生物的生长来平衡局部微生物群，进而增强局部和全身免疫反应，此外，益生菌还可能影响肠道内容物中微生物群的组成和活性；也已有报道指出，病毒引起的流感可影响肠道菌群结构，且特定益生菌可有效减轻急性轮状病毒胃肠炎的持续时间和严重程度。
因此，或许可从肠道微生物入手，尝试找到预防以及治疗流感的新药物或新方法，以克服现有治疗药物以及治疗方法副作用明显等的缺陷。
发明内容
为解决上述问题，本发明筛选出了一株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)。此粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)具有抗流感的作用，具体体现在：(1)显著改善流感小鼠体重下降程度；(2)显著改善流感小鼠血液指标；(3)显著改善流感小鼠的呼吸道感染炎症状况；(4)显著降低流感小鼠肺部病毒载量(即显著抑制流感病毒在流感小鼠体内的复制、增值)，因此，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)在制备预防和/或治疗流感的产品中，具有巨大的应用前景。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025，所述粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025已于2018年10月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60460，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025是从人体粪便中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示菌株为粘膜乳杆菌，命名为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025。
所述粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025的菌体呈短杆状；菌落为圆形粗糙、透明；于45℃生长，15℃不生长；37℃下在MRS液体培养基中培养12小时即达到稳定期，异型发酵，从葡萄糖产酸产气。
本发明提供了上述一株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025在制备预防和/或治疗流感的产品中的应用。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025的活菌数为不低于1×106CFU/mL。
本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述食品包含使用含有粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)CCFM1025的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025的固体饮料。
本发明提供了一种用于预防和/或治疗流感的产品，所述产品含有上述粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025的活菌数为不低于1×106CFU/mL。
本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述食品包含使用含有粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)CCFM1025的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025的固体饮料。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025按照占培养基总质量5～8％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗2～4次后用含100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液真空冷冻法冻干，得到粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025菌粉；所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的酶水解脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述保护剂包含100g/L的脱脂奶粉、30mL/L的甘油、100g/L的麦芽糊精、150g/L的海藻糖以及10g/L的L-谷氨酸钠。
有益效果：
本发明筛选出了一株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025，此粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025具有抗流感的作用，具体体现在：
(1)显著改善流感小鼠体重下降程度；
(2)显著改善流感小鼠血液指标；
(3)显著改善流感小鼠的呼吸道感染炎症状况；
(4)显著降低流感小鼠肺部病毒载量(即显著抑制流感病毒在流感小鼠体内的复制、增殖)，
因此，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025在制备预防和/或治疗流感的产品(如食品、药品或保健品等)中，具有巨大的应用前景。
生物材料保藏
一株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025，分类学命名为Lactobacillus mucosae，已于2018年10月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60460，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：不同组别流感小鼠的体重变化对比。
图2：不同组别流感小鼠的血液检测指标(中性粒细胞)对比。
图3：不同组别流感小鼠的血液检测指标(淋巴细胞)对比。
图4：不同组别流感小鼠的肺部组织病理学切片对比。
图5：不同组别流感小鼠的肺部病毒载量对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS平板(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H20 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温801ml/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
实施例1：粘膜乳杆菌的筛选及鉴定
1、筛选
以人体粪便为样本，将样本经预处理后，在20％左右甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL，以含有0.05％半胱氨酸的0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在加了0.05％半胱氨酸的MRS平板上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS平板上划线纯化，挑取单菌落转接至液体MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1025和菌株F1。
2、鉴定
提取CCFM1025、F1的基因组，将CCFM1025、F1的16S rDNA进行扩增和测序(上海生工生物工程股份有限公司)，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示菌株为粘膜乳杆菌，命名为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025和粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)F1。
实施例2：粘膜乳杆菌的培养
将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025接入MRS固体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，观察其菌落并在显微镜下对其菌体进行观察，发现其菌落为圆形粗糙、透明，其菌体为短杆状。
将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025接入MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h，制作生长曲线，发现其于37℃下培养12h达到稳定期，同时，观察发现其为异型发酵，可从葡萄糖产酸产气。
将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025接入MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)中分别于10、15、20、25、30、35、40、45、50℃下培养48h后观察其生长状况，20～35℃生长良好，45℃条件下依旧能够生长，但于15℃或低于15℃或50℃几乎不生长。
将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025接入MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，转入新鲜的MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)中，同样条件培养30h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，用30％蔗糖溶液重悬，冻存在-80℃待用。
实施例3：粘膜乳杆菌对流感小鼠体重的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠40只，随机分成5组，5组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌CCFM1025的粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、灌胃粘膜乳杆菌F1的粘膜乳杆菌干预组(F1)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余4组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验的5天中，每天灌胃前称重，连续记录五日体重变化，结果如图1所示。
由图1可知，攻毒后的第3天小鼠体重开始出现下降，第4天时体重下降最为明显(P<0.05)，与对照组(Control)相比，模型组(Model)体重下降超过10％，药物治疗组(Treatment)体重下降约5％，粘膜乳杆菌F1干预组体重下降5.5％左右，而粘膜乳杆菌CCFM1025干预组体重下降仅为3％。
说明本发明的粘膜乳杆菌CCFM1025可显著改善流感小鼠体重减轻症状。
实施例4：粘膜乳杆菌对流感小鼠血液指标的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠40只，随机分成5组，5组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌的粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、灌胃粘膜乳杆菌F1的粘膜乳杆菌干预组(F1)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余3组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，将取出的小鼠血液放置在抗凝管中，轻轻晃动，使血液于抗凝剂充分接触，随后送至动物医院进行血常规分析检测(流感病毒感染初期，大量天然免疫细胞，如中性粒细胞和淋巴细胞会参与防御过程，因此，血常规分析检测重点检测中性粒细胞和淋巴细胞变化)，结果如图2-3所示。
由图2-3可知，与空白组(Control)相比，模型组(Model)中性粒细胞显著升高，淋巴细胞显著降低，而其余四组则无显著变化。
说明本发明的粘膜乳杆菌CCFM1025同利巴韦林药物一样，对机体可起到相同的免疫调节功能。
实施例5：粘膜乳杆菌对流感小鼠呼吸道感染炎症的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠32只，随机分成4组，4组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林的药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌的粘膜乳杆菌干预组(CCFM)、灌胃粘膜乳杆菌F1的粘膜乳杆菌干预组(F1)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余3组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，空白对照组以及流感模型组(Control、Model)灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，立即取出小鼠左肺置于4％多聚甲醛中固定，固定后进行组织病理学切片，切片后对小鼠肺部组织病理学切片进行苏木精-伊红染色，通过职业技术人员对小鼠肺部组织病理学切片进行组织病理评分，结果如图4所示。
由图4可知，空白组(Control)小鼠肺部组织结构较完整，无炎症细胞浸润；模型组(Model)小鼠则出现大规模炎症表征，甚至充血情况；治疗组(Treatment)和粘膜乳杆菌干预组(CCFM)组小鼠肺部则轻度炎症细胞浸润，发生在支气管附近。
以上动物实验表明，流感感染可使小鼠患流感性肺炎，肺部被病毒侵染后，其组织结构被破坏，出现大量炎症浸润；而本发明的粘膜乳杆菌CCFM1025可缓解小鼠肺部炎症状况，减轻其肺炎病症，同流感常用药利巴韦林药物治疗组的效果相当。
实施例6：粘膜乳杆菌对流感小鼠肺部病毒载量的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠40只，随机分成5组，5组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌的粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、灌胃粘膜乳杆菌F1的粘膜乳杆菌干预组(F1)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余3组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，处死小鼠后，取小鼠右肺组织置于1mL的TRIZOL中，冻存于-80℃冰箱备用，提取时将右肺组织样品置冰上融化后，采用经DEPC处理的无菌研磨器研磨，加入200μL的氯仿，充分混匀后，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清500μL，加入等体积的异丙醇，混匀后，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清，加入75％的乙醇洗涤RNA一次，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清后，待酒精挥发干，加入40μL的DEPC处理水，溶解RNA，提取的RNA冻存于-80℃冰箱备用。
利用qPCR法测定病毒载量，以GAPDH为内参，采用经典的2-ΔΔt计算方法，以模型组作为对比处理数据，结果如图5所示。
由图5可知，药物治疗组(Treatment)小鼠肺部病毒载量为模型组的38.03％，而本发明的粘膜乳杆菌组干预组(CCFM1026)小鼠肺部病毒载量仅为模型组的16.30％。
以上实验表明，本发明发的粘膜乳杆菌CCFM1026可明显减低流感感染小鼠肺部病毒载量，存在显著性差异(P＝0.0022)，粘膜乳杆菌F1组和药物治疗组(Treatment)小鼠肺部病毒载量降低均存在显著性(P值分别为0.0309和0.0170)，这足以说明本发明的粘膜乳杆菌CCFM1025在抵抗病毒侵染方面效果优于流感药物治疗作用。
实施例7：含有粘膜乳杆菌CCFM1025的固体饮料的制备
具体步骤如下：
将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025按照占MRS培养基总质量5-8％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养12h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗2～4次后用100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬，保护剂和菌体按照质量比2:1混合；真空冷冻法冻干，得到粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025菌粉；
将含有1010CFU的粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025菌粉、麦芽糊精1g进行混合，得到富含粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025的固体饮料。
取10g此含有粘膜乳杆菌CCFM1025的固体饮料用20mL的生理盐水复溶，每只小鼠灌胃200μL，连续两周，可有效缓解流感小鼠症状，在治疗和/或预防流感有极好的效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
江南大学（扬州）食品生物技术研究所
<120> 一株具有抗流感能力的粘膜乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtcgaacgc gttggcccaa ctgattgaac gtgcttgcac ggacttgacg ttggtttacc 60
agcgagtggc ggacgggtga gtaacacgta ggtaacctgc cccaaagcgg gggataacat 120
ttggaaacag atgctaatac cgcataacaa tttgaatcgc atgattcaaa tttaaaagat 180
ggcttcggct atcactttgg gatggacctg cggcgcatta gcttgttggt agggtaacgg 240
cctaccaagg ctgtgatgcg tagccgagtt gagagactga tcggccacaa tggaactgag 300
acacggtcca tactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg ggcgcaagcc 360
tgatggagca acaccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaagctc tgttgttaga 420
gaagaacgtg cgtgagagca actgttcacg cagtgacggt atctaaccag aaagtcacgg 480
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggatttattg 540
ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtttgataa gtctgatgtg aaagcctttg gcttaaccaa 600
agaagtgcat cggaaactgt cagacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt 660
agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg 720
caactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
atgccgtaaa cgatgagtgc taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg ccgcagctaa 840
cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcttgcgcc aaccctagag atagggcgtt tccttcggga acgcaatgac 1020
aggtggtgca tggtcgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct tgttactagt tgccagcatt cagttgggca ctctagtgag actgccggtg 1140
acaaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca gatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggacgg tacaacgagt cgcgaactcg cgagggcaag ctaatctctt 1260
aaaaccgttc tcagttcgga ctgcaggctg caactcgcct gcacgaagtc ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccatga gagtttgcaa cacccaaagt cggtggggta acccttcggg gagctag 1437

Claims (10)

1.一株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)，其特征在于，所述粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)已于2018年10月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60460，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.如权利要求1所述的一株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)在制备预防和/或治疗流感的产品中的应用。
3.如权利要求2所述的一株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)在制备预防和/或治疗流感的产品中的应用，其特征在于，所述产品中，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)的活菌数为不低于1×106CFU/mL。
4.如权利要求2或3所述的一株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)在制备预防和/或治疗流感的产品中的应用，其特征在于，所述产品包含食品、药品或保健食品。
5.如权利要求2-4任一所述的一株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)在制备预防和/或治疗流感的产品中的应用，其特征在于，所述药品含有粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)、药物载体和/或药用辅料。
6.一种用于预防和/或治疗流感的产品，其特征在于，所述产品含有如权利要求1所述的粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)。
7.如权利要求6所述的一种用于预防和/或治疗流感的产品，其特征在于，所述产品中，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)的活菌数为不低于1×106CFU/mL。
8.如权利要求6或7所述的一种用于预防和/或治疗流感的产品，其特征在于，所述产品包含食品、药品或保健食品。
9.如权利要求6-8任一所述的一种用于预防和/或治疗流感的产品，其特征在于，所述药品含有粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、药物载体和/或药用辅料。
10.如权利要求6-9任一所述的一种用于预防和/或治疗流感的产品，其特征在于，所述食品包含使用含有粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)的固体饮料。
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