CN104053767A - 新的粘膜乳杆菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的粘膜乳杆菌菌株，其能够降低肠屏障通透性。该菌株尤其用于减轻肠屏障功能障碍。

Description

新的粘膜乳杆菌菌株
技术领域
本发明涉及新的粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)菌株及其用途，尤其是用于减轻肠屏障功能障碍。
背景技术
肠上皮充当防御屏障，以保护粘膜表面来抵抗肠腔内容物和外部环境。
由于细胞之间存在紧密连接(TJ)，肠上皮层具有低水平的通透性。紧密连接是细胞间的复合物，其功能是作为屏障来限制物质从肠腔到肠粘膜的转移。可以通过外部因素如一些肠道病原体或通过促炎症细胞因子(尤其包括TNF-α和IFN-γ)诱导这些复合物的损坏；这会导致增加的上皮细胞细胞旁通透性，其有助于各种肠道疾病，尤其包括肠易激综合征、慢性炎性肠疾病(克罗恩病(Crohn’s disease)或溃疡性结肠炎)和乳糜泻(综述参见(CLAYBURGH等人，Lab Invest，84，282-91，2004))。
已知各种益生乳酸菌通过不同的机制对肠上皮有保护作用(综述参见(OHLAND&MACNAUGHTON，American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology，298，G807-G19，2010)。然而，仅少数种类中的某些菌株被证明通过降低其通透性而改善上皮屏障功能。(RESTA-LENERT&BARRETT，Gastroenterology，130，731-46，2006)中报道，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)防止由TNF-α和IFN-γ诱导的上皮通透性的增加。(MIYAUCHI等人，J Dairy Sci，92，2400-8，2009)研究了4种乳杆菌(德氏乳杆菌(L.delbrueckii)的一种菌株、干酪乳杆菌(L.casei)的一种菌株、加氏乳杆菌(L.gasseri)的一种菌株和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)菌株OLL2838)对损伤的肠屏障功能和由TNF-α诱导的细胞旁通透性的作用。他们发现，鼠李糖乳杆菌OLL2838显著抑制了TNF-α诱导的细胞旁通透性的增加，而其它测试菌株均无显著作用。(DONATO等人，Microbiology，156，3288-97，2010)中表明鼠李糖乳杆菌菌株LGG减轻了TNF-α或IFN-γ对上皮屏障完整性的影响。(EUN等人，Apmis，119，49-56，2010)中表明干酪乳杆菌菌株DN114001(CNCM I-1518)也阻止了由TNF-α或IFN-γ诱导的上皮通透性的增加。Z.Zakostelska等人近期报道副干酪乳杆菌DN-114001(CNCM I-1518)的裂解物在体内加强了肠细胞屏障的完整性(ZAKOSTELSKA等人，2011。PlosOne6(11)。
首次从猪小肠分离得到粘膜乳杆菌，后来也自人肠道和阴道以及自狗、牛犊和马的肠道中分离得到。
Roos和其合作者首先表征其为一种物种(ROOS等人，Int J Syst EvolMicrobiol，50Pt1，251-8，2000)。在分类学上，粘膜乳杆菌与发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)密切相关。粘膜乳杆菌包含编码细胞表面蛋白的mub基因，该蛋白赋予了粘膜乳杆菌结合粘液的能力。Roos等人描述其为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、非孢子形成、非运动杆、生长于45℃而不是15℃。
粘膜乳杆菌中的一些菌株显示出具有抗微生物活性。Tzortis等人(TZORTZIS等人，J Appl Microbiol，96，552-9，2004)报道了，粘膜乳杆菌的菌株NCIMB41149在存在麦芽寡糖或麦芽糖的情况下生长时，对大肠杆菌(Echerichia coli)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhymurium)具有体外抑制活性，而在存在葡萄糖、异麦芽寡糖、龙胆二糖或纤维二糖的情况下不具有该活性。PCT申请WO2011/107960中描述了粘膜乳杆菌菌株DSM23409和DSM23408用于治疗或预防大肠杆菌感染的用途。
目前为止，未报道任何粘膜乳杆菌物种的菌株对肠屏障功能有影响。
发明内容
现在，本发明人鉴定了一种新的粘膜乳杆菌菌株，其除了抗微生物活性之外，还具有改善肠屏障功能的能力，尤其是通过减少肠上皮通透性。
本发明的一个主题是根据布达佩斯条约于2011年2月3日保藏于CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25rue du Docteur Roux，Paris)编号为I-4429的菌株。
CNCM I-4429菌株是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的微生物，非运动性，不形成孢子；细胞形状为大小1×2-4μm的杆状，分离时成对或以短链形式出现。
其具有抗微生物的性质，尤其强烈地抑制肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica)的生长。
其还具有减少肠屏障通透性的性质，换言之，保护或恢复上皮细胞旁的不透性，尤其是具有防止或恢复由TNF-α诱导的上皮细胞旁通透性的增加的性质。
本发明的主题还包括可通过诱变或通过遗传转化CNCM I-4429菌株获得的粘膜乳杆菌菌株。优选地，这些菌株保留了CNCM I-4429菌株在降低肠屏障通透性上的性质。其可以是突变了CNCM I-4429菌株内源基因中的一个或多个的菌株，例如以修改其一些代谢性质(如该菌株代谢糖的能力、其对于肠转运的耐受、其对酸度的耐受、其后酸化或其代谢物生产)。其也可以是用一种或多种目标基因遗传转化CNCM I-4429菌株所得到的菌株以使得可能如在所述菌株上赋予另外的生理特征或表达具有治疗性或疫苗兴趣的蛋白，其希望通过所述菌株的方法来施用。
这些菌株可以通过用于随机或定向诱变和乳杆菌的遗传转化的常规技术自CNCM I-4429菌株获得，如GURY等人(Arch Microbiol.，182，337-45，2004)或Velez等人(Appl Environ Microbiol.，73，3595-3604，2007)中所述的技术，或者被称为“基因组改组”的技术(Patnaik等人，Nat Biotechnol，20，707-12，2002；Wang Y.等人，J Biotechnol.，129，510-15，2007)。
本发明的一个主题还是一种用于获得能降低肠屏障通透性的粘膜乳杆菌菌株的方法，该方法包括诱变或遗传转化CNCM I-4429菌株的步骤。
本发明的一个主题还是用于从根据本发明的粘膜乳杆菌菌株获得能够降低肠屏障通透性的细胞组分的方法。所述的细胞组分尤其是从所述菌株的培养物获得的DNA制剂或细菌壁制剂。其也可以是培养物上清液或这些上清液的组分。
本发明的主题还是组合物，其包括根据本发明的粘膜乳杆菌菌株，或可通过诱变或遗传转化CNCM I-4429菌株而获得的粘膜乳杆菌菌株，或从所述菌株获得的细胞组分。
这些组合物尤其可以是乳酸发酵物，组合了根据本发明的粘膜乳杆菌和一种或多种其它的(可任选为益生的)乳酸菌菌株。可提及的乳酸菌菌株的举例包括乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)，尤其是保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌菌株(Streptococcus thermophilusstrain)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、干酪乳杆菌亚种副干酪菌株(Lactobacillus caseissp.paracasei strain)。
其也可以是食物产品，尤其是乳制品或药物或化妆品，其包括根据本发明的粘膜乳杆菌菌株，或通过诱变或遗传转化CNCM I-4429菌株而获得的粘膜乳杆菌菌株，或从所述菌株获得的细胞组分。
当所述菌株以活菌形式存在时，其优选以每克至少105cfu的比例存在，有利地每克产品至少106cfu，更有利地每克至少107cfu，甚至更有利地每克至少108cfu。
本发明的一个主题还是用于获得上述组合物的方法，其特征在于其包括：
-获得根据本发明的粘膜乳杆菌或可通过上述方法获得的粘膜乳杆菌菌株，或根据本发明的细胞组分，和
-将所述菌株或组分掺入到所述组合物中。
本发明的粘膜乳杆菌菌株、细胞组分和组合物可用于治疗或预防涉及肠屏障功能障碍的病况，尤其是与肠屏障通透性增加相关的病况。
具体实施方式
通过以下的进一步描述并参考阐述粘膜乳杆菌菌株CNCM I-4429的表征和性质的实施例可以更清楚地理解本发明。
实施例1-粘膜乳杆菌菌株CNCM I-4429的形态和发酵性质
形态
菌株CNCM I-4429的电子显微镜图像示于图1。菌株CNCM I-4429表现出扭曲的形状；其是扭曲的杆状菌。
碳水化合物代谢的分析：
在Bioscreen仪器(Oy Growth Curves Ab Ltd)上进行糖发酵分析。选择21种糖用于分析。将其列于表Ⅰ中。
用Bioscreen进行的分析历时24小时，在10秒振荡之后的每20分钟进行测量。进行2次分析，每次一式三份。为了避免分解代谢产物抑制葡萄糖的效果，对预培养使用具有半乳糖的培养基。
-预培养基MRS-半乳糖；
-培养基，含有1％待测糖的MRS
-在每个孔中；300μL的培养基和1％的预培养基
-24h期间内，10秒振荡之后每隔20分钟测量OD
空白是由不含细菌的MRS表示。
结果示于下述表I中：(+)表示存在生长，(+/-)表示适度生长和(-)表示没有生长。当OD值达到0.8或以上时，认为生长是阳性的。
结果：
粘膜乳杆菌菌株CNCM I-4429具有特定模式的糖代谢。该模式与鼠李糖乳杆菌或副干酪乳杆菌菌株完全不同。两种糖根本不能被代谢：松三糖和卫矛醇。
三种糖的代谢非常差且迟缓：半乳糖胺、肌醇和山梨醇。四种糖能代谢但迟缓：甘露醇、纤维素、山梨糖和果糖。
实施例2-粘膜乳杆菌菌株CNCM I-4429的粘液结合性质
与粘蛋白的粘附：
与来自卧孔菌素胃II型的粘蛋白(Sigma Aldrich)的粘附的分析通过“静态”和“动态”的2种方案进行，以研究生物被膜形成。
两种方案的制备的第一步和最后一步是相同的。粘蛋白以20mg/ml的浓度溶解于pH7的PBS中，然后将热灭菌的玻璃球(直径为6mm)淹没于粘蛋白溶液中，在37℃孵育1小时，并随后置于4℃过夜。次日将球体在pH为7的PBS中洗涤2次。
对于“静态”方案，将球体淹没于1ml的生长于MRS+葡萄糖/MRS+核糖中的粘膜乳杆菌过夜培养物中，并于37℃孵育4h，而在动态模型中，在开始前将每种菌株在37℃与玻璃球孵育1h。
用于研究生物被膜形成的动态模型由彼此连接的具有塑料管、连接器(PF0052)和配有onelead顶盖(PF0146)的短滴室(short drip chambers)(PF0047)(Industrie Borla S.p.A.，Moncalieri，意大利)的两个五路阀组(valvemanifold5-way)(Sarstedt S.R.L.，Verona，意大利)组成。所有组件预先浸泡在乙醇(50％)中消毒，并在无菌条件下装配为阀组。在所有的测试中，使用3个充满培养物的室和3个玻璃球。用水稀释MRS肉汤(Oxoid)(50％)并添加万古霉素(4μg/ml)，将其用作介质以获得24h到室中的连续流(通过重力)。通过使用外部水浴使室中的温度保持在37℃。随后将球体在无菌条件下去除(在动态模型中是2次：1h-T0之后和在孵育-T24结束时)，在生理盐水溶液中洗涤两次以去除非粘附细胞，浸没于1ml的生理盐水溶液中并涡旋1分钟以释放溶液中粘附的细胞。然后十倍稀释并将每个稀释的100μL分别涂布于含有MRS(Man，Rogosa，Sharpe)琼脂培养基的陪替平皿(Petriplate)上。
也从过夜培养物(对于静态方案)以及从存在于室中的介质-悬浮细胞(对于动态方案)制备十倍稀释物，以确定粘附的细胞数。在厌氧条件下将平皿于37℃孵育24h。
结果示于下述表Ⅱ：
表Ⅱ
粘膜乳杆菌菌株粘附到粘液(静态分析)
粘膜乳杆菌菌株粘附到粘液(动态分析)
这些结果表明，粘膜乳杆菌菌株CNCM I-4429与其它3种粘膜乳杆菌菌株相比，对粘液具有更高的粘附性。
与细胞单层的粘附：
进行2次对Caco2和HT29单层的粘附的评估，每次一式两份。该分析包括将粘膜乳杆菌(107cfu-108cfu)菌株与由500000细胞组成的细胞系单层孵育90分钟。预先将粘膜乳杆菌用荧光探针6CFDA染色30分钟。在孵育时间结束时，将细胞单层轻轻地洗涤并将粘附的微生物细胞裂解以量化荧光水平，并确定粘附到上皮的细胞数量。
结果示于下表Ⅲ：
表Ⅲ
HT-29细胞
CNCM I-4429 涂布10^8cfu 粘附的： 3.00E+05
Caco2细胞
CNCM I-4429 涂布：10^8cfu 粘附的： 4.00E+05
实施例3-粘膜乳杆菌菌株CNCM I-4429的抗微生物活性
“覆盖”(overlay)法描述于文献(CHARTERIS等人，J Food Prot，61，1636-43，1998；TOMINAGA&HATAKEYAMA，Appl Environ Microbiol，72，1141-7，2006)，将其用于测试。
将在含有葡萄糖的培养基中培养11h、18h和48h的粘膜乳杆菌CNCMI-4429的培养物离心，并将上清液的酸性pH(～pH4)用2M的NaOH调整至pH6.5。用这种方式将乳酸中和并解离以去除其毒性。“覆盖”测试在平皿上进行。所使用的培养基为软的脑心浸液-BHI(Difco)(0.7％琼脂)，用沙门氏菌的过夜培养物接种。当接种后的培养基表面干燥后，在每个平皿中打4个直径为5mm的孔。然后，将80μl的粘膜乳杆菌的无细胞上清液(调整pH的和用于对照的未调整pH的)置于每个孔中。
将平皿在厌氧条件下于37℃孵育24h。可视化结果并给平皿拍照。试验重复至少两次，通常为三次。
16小时培养物的代表性试验的结果示于图2：左侧和顶部是pH为4的粘膜乳杆菌上清液的肠炎沙门氏菌的生长的抑制；右侧和顶部是中和(pH6.5)的粘膜乳杆菌上清液的病原体生长抑制。底部是pH为4(左)和pH为6.5(右)的副干酪乳杆菌上清液的肠炎沙门氏菌的生长的抑制。
对于粘膜乳杆菌，抑菌圈的大小为：在pH4＝18mm，在pH6.5＝16mm。对于副干酪乳杆菌，抑菌圈的大小为：在pH4＝16mm，在pH6.5＝3mm。
这些结果表明，粘膜乳杆菌CNCM I-4429表现出对肠炎沙门氏菌病原体的强烈的生长抑制。
实施例4：粘膜乳杆菌菌株CNCM I-4429对肠道上皮细胞的跨上皮电阻
的作用
将菌株CNCM I-4429对肠道上皮细胞Caco2单层的跨上皮电阻的作用与不同的干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌株(其中包括干酪乳杆菌菌株DN114001(CNCM I-1518)和鼠李糖乳杆菌菌株LGG)的作用相比较，已知干酪乳杆菌菌株DN114001(CNCM I-1518)和鼠李糖乳杆菌菌株LGG都能减少肠上皮屏障的通透性(DONATO等人，2010和EUN等人，2010，引用同上)。
方法：
使用Caco2细胞。这些细胞能够在体外条件下形成单层。
细胞生长于最低限度伊戈尔氏(Eagle)培养基(由Dulbecco/Vogt DMEM改良的，Invitrogen)中，该培养基含有10％血清(BioWhittaker)、1％的氨基酸(Invitrogen)和1％的青霉素/链霉素(10000U/mL的青霉素，10000μg/mL的青霉素/链霉素(10000U/mL的青霉素，10000μg/mL的链霉素，Invitrogen)。细胞在潮湿氛围的培养箱中于5％的CO2下在37℃培养。
用不含钙和镁的PBS缓冲液每周两次洗涤细胞并用新鲜的培养基稀释。然后将细胞胰蛋白酶处理(Trypsine Invitrogen)。用台盼蓝排斥测试检测细胞活力。将四百万细胞置于特定的烧瓶中以产生75cm2的细胞培养物(TPP)。
用0.5ml的两个隔室内的培养基中的105个细胞接种Transwell平板(Sigma)中。
细菌在MRS培养基中于37℃平行培养16h。
细胞孵育6天后，当TEER>1300Ω时，将细菌与细胞接触。添加106cfu的待测细菌到Transwell室的顶隔室中并与细胞孵育24小时。对于在TNF-α存在时进行的试验，3小时后添加10ng/ml的细菌于Transwell室的底隔室。使用不添加细菌的Transwell室作为对照。
在Transwell室中用电压计Evom2(World Precision Instruments)于T0和T24时测量TEER。试验独立地重复3次。试验中TEER的评估表示为比率：
[用细菌处理的细胞的TEER24h/TEERt0]/[对照的TEER24h/TEERt0]。
结果：
结果示于图3和图4。
图3显示了在基础条件下待测细菌对细胞单层的跨上皮电阻的作用。图4显示了当用TNF-α去稳定后，其对细胞单层的跨上皮电阻的作用。L.c表示干酪乳杆菌菌株，L.c01是菌株CNCM I-1518；L.rh表示鼠李糖乳杆菌菌株，L.rh35是菌株LGG；L.m15表示粘膜乳杆菌CNCM I-4429；还有对照。
图3的结果表明，在基础条件下粘膜乳杆菌CNCM I-4429提高了约21％的跨上皮电阻。在相同的实验条件下，鼠李糖乳杆菌LGG提高了约31％，干酪乳杆菌CNCM I-1518提高了约13％。
图4的结果表明，当对比于基础条件时，用TNF-α去稳定化后，对照单层的跨上皮电阻降低了14％。相反地，在用粘膜乳杆菌CNCM I-4429孵育的细胞中，当对比于基础条件时，跨上皮电阻提高了约8％。在相同的实验条件下，鼠李糖乳杆菌LGG提高了约16％，干酪乳杆菌CNCM I-1518提高了约5％。
实施例5：粘膜乳杆菌菌株CNCM I-4429对肠道上皮细胞单层中的ZO-1
分布的作用。
ZO-1是细胞内紧密连接支架蛋白，其在紧密连接的完整性和TJ上皮的不透性中发挥重要作用。
在基础条件下或用有或没有与乳杆菌预孵育的TNF-α处理之后(如实施例4所述)，通过免疫荧光研究实施例4中所使用的Caco2细胞单层中ZO-1的分布。将粘膜乳杆菌CNCM I-4429对ZO-1亚细胞分布的作用与干酪乳杆菌菌株L.c21的作用相比较，其中干酪乳杆菌菌株L.c21对跨上皮电阻的提高无作用(图4)。
结果示于图5：A：在基础条件下的Caco2细胞单层；B：用TNF-α处理的Caco2细胞单层；C：存在L.c21时用TNF-α处理的Caco2细胞单层；D：存在CNCM I-4429时用TNF-α处理的Caco2细胞单层。
在基础条件下，ZO-1主要分布在细胞膜上；TNF-α的处理诱导了ZO-1的解体，如所显示的弥散的胞质内结构。这些结构也存在于用L.c21孵育的TNF-α处理的细胞中，而用CNCM I-4429孵育的TNF-α处理的细胞显示了与在基础条件下的细胞几乎相同的ZO-1的分布模式。
PCT/RO/134表

Claims (7)

1.一种以编号I-4429保藏于CNCM的粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)菌株。
2.一种获得能降低肠屏障通透性的粘膜乳杆菌菌株的方法，其特征在于其包括诱变或遗传转化CNCM I-4429菌株的步骤。
3.一种获得能降低肠屏障通透性的细胞组分的方法，其特征在于所述细胞组分获取自权利要求1所述的粘膜乳杆菌。
4.一种组合物，其包括权利要求1所述的粘膜乳杆菌菌株，或通过权利要求2所述的方法所获得的粘膜乳杆菌菌株，或通过权利要求3所述的方法获得的细胞组分。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于其是食品。
6.一种获得权利要求4和5所述的组合物的方法，其特征在于其包括获得权利要求1所述的粘膜乳杆菌菌株，或通过权利要求2所述的方法所获得的粘膜乳杆菌菌株，或通过权利要求3所述的方法获得的细胞组分，并将所述菌株或组分掺入到所述组合物中。
7.如权利要求1所述的粘膜乳杆菌菌株或如权利要求4所述的组合物，其用作治疗或预防由肠屏障功能障碍所引起的病症的药物。
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