CN114916675A - 一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠、制备方法和应用 - Google Patents
一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠、制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠，所述复乳凝胶珠包括外水相、油相和内水相，外水相设置在最外侧，内水相设置在内侧，油相设置在外水相、内水相之间。本发明通过将益生菌(如植物乳杆菌)、益生元包埋于复乳体系中，从而提高其贮藏存活率，并通过在乳液外层增加一层凝胶壳，进一步提高其环境耐受性和胃肠耐受性，从而增强植物乳杆菌的贮藏存活率和耐胃酸型，达到肠道靶向释放定植的目的。该方法所制得的产品中植物乳杆菌包载率大浓度为1011～1012cfu/g，突破传统干粉工艺，可直接应用于湿基食品中，且制作方法易操作，便于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，尤其是一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠、制备方法和应用。
背景技术
益生菌是一种能够改善人体肠道菌群平衡，对人类的健康和生理机能产生积极作用的微生物，具有提高人体免疫力、调节机体正常代谢、维持人体肠道菌群代谢平衡、保护消化系统等重要功能活性。其中，乳杆菌类是目前应用较为广泛的一类益生菌。然而，这类菌种在加工贮藏过程中会因环境因素而导致活菌数的下降。因此，如何保持菌活性，延长保质期是该领域的一个亟待解决的技术问题。
人体摄入益生菌相关产品的目的是使一定浓度的活性益生菌到达小肠并在小肠粘膜进行定植从而发挥其益生活性。植物乳杆菌作为一种重要的肠道益生菌，对维持人体肠道微生态稳定起到非常关键的作用。然而，植物乳杆菌对于环境胁迫极不耐受，温度、pH值、机械压迫和消化道酸性环境等均会降低植物乳杆菌的存活率，导致其益生活性急剧下降。FHO/WHO制定的正式标准是益生菌活菌的数量要不得少于106～107cfu/g。益生菌要想在人体内发挥其健康作用，达到益生功能，就必须维持其被人体摄入后的存活率。近年来，研究人员对利用微胶囊或微型颗粒包载植物乳杆菌的方法进行了大量的探索，然后利用冻干或喷雾干燥的方法制备相关产品。目前，国内的益生菌制剂是根据“饥饿存活”理论研制而成，通过干燥减少产品中的水分含量，从而延长其贮藏存活率。但植物乳杆菌对环境敏感，温度、湿度、光照等因素都会造成其存活率下降，因此这种方式在应用上存在一定的技术壁垒。有研究者利用内源乳化法即采用油包水的方式将植物乳杆菌、益生元和乳化剂包载后进行真空冷冻干燥，然而这种生产方式所得到的产品菌活力和酶活力低、复水性差且不利于人体吸收。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不同，提供一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠、制备方法和应用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠，所述复乳凝胶珠包括外水相壳层结构、含益生菌内水相和油相，所述外水相壳层结构由海藻酸钠、乳清分离蛋白和氯化钠制备而成，所述含益生菌内水相由益生菌浓缩液、低聚果糖和黄原胶制备而成，所述油相由中链甘油三酯和聚甘油蓖麻醇酸酯制备而成。
进一步地，所述凝胶珠中益生菌的存活率更高，包埋率最高为55.27％。
如上所述的提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠的保存方法，所述凝胶珠在4℃保存。
一种如上所述的水包油包水型复乳凝胶珠的制备方法，包括如下步骤：
(1)混合溶液I的配置：将海藻酸钠粉末溶解于蒸馏水中，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(2)混合溶液II的配置：将乳清分离蛋白粉末溶解于氯化钠水溶液中，4℃过夜水合；
(3)外水相溶液的配置：将混合溶液I与混合溶液II混合，制得外水相溶液；
(4)油相溶液的配置：向中链甘油三酯中加入聚甘油蓖麻醇酸酯，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(5)益生菌浓缩液的配置：将植物乳杆菌接种至121±1℃灭菌15-20min冷却后的MRS液体培养基中，恒温培养，重复传代培养，最后一次传代培养至稳定期；离心、弃上清液后加入生理盐水，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体，制得益生菌浓缩液后冷却，备用；
(6)混合溶液III的配置：将黄原胶粉末和低聚果糖粉末加入蒸馏水中，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(7)内水相溶液的配置：将步骤(5)制备的益生菌浓缩液与混合溶液III混合，制得内水相溶液；
(8)混合溶液IV的配置：将步骤(7)制备的内水相溶液与步骤(4)制备的油相溶液混合，制得混合溶液IV；
(9)混合溶液V的配置：将步骤(8)制备的混合溶液IV与步骤(3)制备的外水相溶液混合，制得混合溶液V；
(10)钙液的配置：将氯化钙溶于蒸馏水中，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(11)将步骤(9)制备的混合溶液V采集于注射器中，滴入步骤(10)制备的钙液中，反应后捞出并用水清洗，制得提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠。
进一步地，步骤(1)中，溶解于水后的海藻酸钠的质量分数为1％～5％，并将其于60℃～90℃磁力搅拌水浴锅中加热搅拌混合均匀，混合均匀时间为1～3h；
或者，步骤(2)中，氯化钠溶液的质量分数为0.3％～0.9％，乳清分离蛋白溶液的质量分数为1％～5％，在15℃～25℃下利用磁力搅拌混匀，混匀时间为1-2h，并在4℃冰箱内放置过夜充分水合。
进一步地，步骤(3)中，混合溶液I与混合溶液II在无菌条件下进行混合操作，混合溶液I：混合溶液II的质量比为2:3～5，用均质机在6000～10000rpm下进行混匀，混匀时间为2～6min；
或者，步骤(4)中，聚甘油蓖麻醇酸酯溶液的质量分数为1％～10％，在50℃～70℃水浴锅中利用磁力搅拌混匀，混匀时间为10～30min。
进一步地，步骤(5)中益生菌浓缩液的制备步骤如下：将益生菌接种于MRS培养基中37℃恒温培养24～48h，重复传代培养2～3次，最后一次传代培养至稳定期；进行离心，5000～10000rpm离心10～15min，弃上清液后加入等体积的生理盐水，生理盐水的质量分数为0.5％～0.85％，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体，即得益生菌浓缩液；
或者，步骤(6)中，混合溶液III中黄原胶的质量分数为1％～5％，低聚果糖的质量分数为1％～5％，在30℃～90℃水浴锅中利用磁力搅拌混匀，混匀时间为1～3h。
进一步地，步骤(7)中，内水相溶液中益生菌浓缩液与混合溶液III的质量比为1～10:100；
或者，步骤(8)中，油相溶液与内水相溶液的质量比为3～4:2，用均质机在5000～10000rpm下进行混匀，混匀时间为2～6min。
进一步地，步骤(9)中，混合溶液IV与外水相溶液的质量比为2～3:1，用均质机在5000～10000rpm下进行混匀，混匀时间为2～6min；
或者，步骤(10)中，氯化钙溶液质量分数为2～5％；
或者，步骤(11)中，将混合溶液V滴加至质量分数为2～5％的氯化钙溶液中，反应10～30min后捞出，并用水清洗。
如上所述的提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠在食品方面中的应用。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明通过将益生菌(如植物乳杆菌)、益生元包埋于复乳体系中，从而提高其贮藏存活率，并通过在乳液外层增加一层凝胶壳，进一步提高其环境耐受性和胃肠耐受性，从而增强植物乳杆菌的贮藏存活率和耐胃酸型，达到肠道靶向释放定植的目的。该方法所制得的产品中植物乳杆菌包载率大浓度为1011～1012cfu/g，突破传统干粉工艺，可直接应用于湿基食品中，且制作方法易操作，便于推广应用。
2、本发明方法采用乳化、胶凝技术制备乳剂型、凝胶珠型益生菌包载产品，可直接应用于湿态食品环境中，如奶茶、酸奶和水果饮料等制品。
3、本发明凝胶珠将益生菌和益生元包埋在内水相，有效提高了益生菌在胃液中的存活率，同时益生元可为贮藏期间的益生菌提供能量维持活性。采用聚甘油蓖麻醇酸酯作为乳化剂降低了混合体系中各组分的界面张力，并在乳滴表面形成具有一定粘弹性的油水界面膜，从而隔绝氧气，为益生菌提供适宜生存环境。与此同时，在内水相中加入黄原胶以增强复乳的长期稳定性。
4、本发明凝胶珠在外水相中加入天然多糖海藻酸钠，然后将包载益生菌-益生元的油包水乳液体系与乳清蛋白、海藻酸钠溶液进行二次均质，并通过与钙离子的螯合作用形成水包油包水型凝胶珠。内可有效抵抗胃酸的侵蚀，使较高含量的益生菌到达肠道内定植从而发挥益生活性。
5、本发明凝胶珠在外水相中加入乳清分离蛋白溶液作为外层油水界面乳化剂，保持乳状液的稳定性，乳清分离蛋白可赋予凝胶珠良好外观和质构特性，使其更加饱满圆润具有弹性，具有良好的市场应用前景和经济效益。此外，乳清分离蛋白具有人体所需必需氨基酸，可提高凝胶珠营养价值。
6、本发明基于乳化-凝胶技术对益生菌进行高效负载递送，产品不需要进行冷冻干燥，且制得的产品包载植物乳杆菌的有效浓度高；水包油包水型乳液凝胶珠外层的亲水壳层结构有助于提高益生菌抵御胃酸的破坏作用，从而提高存活率，实现益生菌的肠道靶向输送。目前国内在实用型兼具功能性凝胶珠的研究方面较为稀缺，利用复乳包埋益生菌和益生元并通过胶凝技术再次进行二次包埋是一种新颖的手段，所制得的产品可以直接应用于奶茶、咖啡、乳饮料等各类湿态食品中。因此，利用新型乳化、胶凝技术手段制造出口感、风味独特的益生菌产品，具有良好的经济效益和市场前景。
7、本发明方法采用“三相两膜”多重隔室化结构包载益生菌，可有效隔绝氧气、为益生菌提供适宜生长的微环境。
附图说明
图1为本发明复乳凝胶珠在模拟胃液中的存活率曲线；
图2为本发明复乳凝胶珠在4℃低温贮藏环境下的存活率曲线；
图3为本发明复乳凝胶珠内水相革兰氏染色后的结构示意图；
图4为本发明复乳凝胶珠的“三相两膜”隔室化结构微观示意图；
图5为本发明复乳凝胶珠的外观形貌示意图；
图6为本发明复乳凝胶珠的结构连接示意图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠，如图6所示，所述复乳凝胶珠包括外水相壳层结构1、含益生菌内水相2和油相3，所述外水相壳层结构由海藻酸钠、乳清分离蛋白和氯化钠制备而成，所述含益生菌内水相由益生菌浓缩液、低聚果糖和黄原胶制备而成，所述油相由中链甘油三酯和聚甘油蓖麻醇酸酯制备而成。
为了清晰地观察到本发明复乳凝胶球中植物乳杆菌的分布，利用革兰氏染色法将内水相中的植物乳杆菌进行染色，在光学显微镜下进行观察，如图3所示，植物乳杆菌染色后呈紫色的杆状，紧密的排列在一起，表明植物乳杆菌成功地包埋在凝胶球的内水相中。本发明的包载植物乳杆菌的水包油包水型复乳的微观结构如图4所示，由图可知，较大的油滴中包含有多个小液滴，表明水包油包水型复乳被成功制备出来，且乳液的液滴尺寸小于50μm。此外，乳液内部的水滴呈蓝色，归因于内水相中植物乳杆菌革兰氏染色后所致，进一步证明了植物乳杆菌被成功包载到复乳的内水相中。图5为本发明复乳凝胶珠的外观形貌示意图，由图可知，本发明复乳凝胶珠的外观呈乳白色的球形，直径约为4～8mm，表面光滑且具有弹性。图6为本发明复乳凝胶珠的微观结构示意图，该凝胶珠具有特殊的“三相两膜”的多重隔室化结构，其中1代表凝胶珠中由海藻酸钠与钙离子反应形成的类似“蛋盒”结构的亲水凝胶外壳，2代表包载有植物乳杆菌的内水相液滴，3代表由中链甘油三酯和聚甘油蓖麻醇酸酯制备而成油相。
较优地，所述凝胶珠中益生菌的存活率更高，包埋率最高为55.27％。
如上所述的提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠的保存方法，所述凝胶珠在4℃保存。
一种如上所述的水包油包水型复乳凝胶珠的制备方法，包括如下步骤：
(1)混合溶液I的配置：将海藻酸钠粉末溶解于蒸馏水中，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(2)混合溶液II的配置：将乳清分离蛋白粉末溶解于氯化钠水溶液中，4℃过夜水合；
(3)外水相溶液的配置：将混合溶液I与混合溶液II混合，制得外水相溶液；
(4)油相溶液的配置：向中链甘油三酯中加入聚甘油蓖麻醇酸酯，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(5)益生菌浓缩液的配置：将植物乳杆菌接种至121±1℃灭菌15-20min冷却后的MRS液体培养基中，恒温培养，重复传代培养，最后一次传代培养至稳定期；离心、弃上清液后加入生理盐水，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体，制得益生菌浓缩液后冷却，备用；
(6)混合溶液III的配置：将黄原胶粉末和低聚果糖粉末加入蒸馏水中，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(7)内水相溶液的配置：将步骤(5)制备的益生菌浓缩液与混合溶液III混合，制得内水相溶液；
(8)混合溶液IV的配置：将步骤(7)制备的内水相溶液与步骤(4)制备的油相溶液混合，制得混合溶液IV；
(9)混合溶液V的配置：将步骤(8)制备的混合溶液IV与步骤(3)制备的外水相溶液混合，制得混合溶液V；
(10)钙液的配置：将氯化钙溶于蒸馏水中，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(11)将步骤(9)制备的混合溶液V采集于注射器中，滴入步骤(10)制备的钙液中，反应后捞出并用水清洗，制得提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠。
较优地，步骤(1)中，溶解于水后的海藻酸钠的质量分数为1％～5％，并将其于60℃～90℃磁力搅拌水浴锅中加热搅拌混合均匀，混合均匀时间为1～3h；
或者，步骤(2)中，氯化钠溶液的质量分数为0.3％～0.9％，乳清分离蛋白溶液的质量分数为1％～5％，在15℃～25℃下利用磁力搅拌混匀，混匀时间为1-2h，并在4℃冰箱内放置过夜充分水合。
较优地，步骤(3)中，混合溶液I与混合溶液II在无菌条件下进行混合操作，混合溶液I：混合溶液II的质量比为2:3～5，用均质机在6000～10000rpm下进行混匀，混匀时间为2～6min；
或者，步骤(4)中，聚甘油蓖麻醇酸酯溶液的质量分数为1％～10％，在50℃～70℃水浴锅中利用磁力搅拌混匀，混匀时间为10～30min。
较优地，步骤(5)中益生菌浓缩液的制备步骤如下：将益生菌接种于MRS培养基中37℃恒温培养24～48h，重复传代培养2～3次，最后一次传代培养至稳定期；进行离心，5000～10000rpm离心10～15min，弃上清液后加入等体积的生理盐水，生理盐水的质量分数为0.5％～0.85％，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体，即得益生菌浓缩液；
或者，步骤(6)中，混合溶液III中黄原胶的质量分数为1％～5％，低聚果糖的质量分数为1％～5％，在30℃～90℃水浴锅中利用磁力搅拌混匀，混匀时间为1～3h。
较优地，步骤(7)中，内水相溶液中益生菌浓缩液与混合溶液III的质量比为1～10:100；
或者，步骤(8)中，油相溶液与内水相溶液的质量比为3～4:2，用均质机在5000～10000rpm下进行混匀，混匀时间为2～6min。
较优地，步骤(9)中，混合溶液IV与外水相溶液的质量比为2～3:1，用均质机在5000～10000rpm下进行混匀，混匀时间为2～6min；
或者，步骤(10)中，氯化钙溶液质量分数为2～5％；
或者，步骤(11)中，将混合溶液V滴加至质量分数为2～5％的氯化钙溶液中，反应10～30min后捞出，并用水清洗。
如上所述的提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠在食品方面中的应用。
具体地，相关的制备及检测如下：
实施例一：
一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠的制备方法，步骤如下：
S1、称取1g海藻酸钠粉末放入烧杯中，加入99g水配置质量分数为1％海藻酸钠溶液。放入80℃磁搅水浴锅中加热搅拌2h使质量分数为1％海藻酸钠水溶液充分溶解，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得混合溶液I。
S2、称取1g乳清分离蛋白粉末放入烧杯中，加入99g，质量分数为0.85％氯化钠溶液，配置质量分数为1％乳清分离蛋白溶液。在常温下磁搅2h使质量分数为1％乳清分离蛋白溶液充分溶解，并在4℃冰箱放置过夜使其充分水合，制得混合溶液II。
S3、在无菌条件下进行操作。质量比为混合溶液I:混合溶液II＝2:3，用均质机搅拌10000rpm进行混匀，混匀时间为5min，制得外水相溶液。
S4、称取1.2g聚甘油蓖麻醇酸酯放入烧杯中，加入28.8g中链脂肪酸酯中，配置质量分数为4％的聚甘油蓖麻醇酸酯溶液，混合均匀，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得油相溶液。
S5、将植物乳杆菌接种于MRS培养基中37℃恒温培养48h，重复传代培养3次，最后一次传代培养至稳定期。取50mL进行离心，5000rpm时长为10～15min，弃上清液后加入等体积的生理盐水，生理盐水的质量分数为0.85％，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体,制得益生菌浓缩液。
S6、称取2g低聚果糖、1g黄原胶分别加入到96g蒸馏水中，放入80℃磁搅水浴锅中加热搅拌1h使其充分溶解，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得混合溶液III。
S7、向溶液III中加入1mL益生菌浓缩液，混匀，制得内水相溶液。
S8、在无菌条件下进行操作。油相溶液:内水相溶液的质量比为3:2，用均质机搅拌5000rpm进行混匀，混匀时间为6min，制得混合溶液IV。
S9、混合溶液IV：外水相溶液的质量比为2:1，用均质机搅拌10000rpm进行混匀，混匀时间为6min，制得混合溶液V。
S10、将根据上述步骤制得的一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠进行模拟人工胃液测试。测试方法：胃电解质溶液的配制：准确称量0.6g NaHCO3，1.1g KCI和3.1g NaCl，然后用超纯水溶解并定容至1L，再用1mol/L的HCI溶液调节电解质溶液的pH为2.0，常温贮存备用。
模拟人工胃液的配制：将称取的质量为150.0mg的胃蛋白酶溶解于胃电解质溶液中，使其最终浓度为1mg/mL，4℃贮存，备用。
S11、将质量分数为2％的氯化钙溶于蒸馏水中，混合均匀，在121℃进行灭菌15min后冷却，备用，制得钙液。
S12、将混合溶液V采集于注射器中，滴入钙液中，反应10min后捞出，并用水清洗，制得提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠。
S13、称取10个凝胶珠放入模拟人工胃液，分别在37℃条件下振荡培养1h、2h、3h后捞出。将凝胶珠在生理盐水中剪碎，进行梯度稀释后涂布培养48h，计数单菌落数并计算植物乳杆菌存活率：
植物乳杆菌存活率＝模拟人工胃液处理后活菌数/模拟人工胃液处理前活菌数*100％。
对照例一：
一种凝胶珠的制备方法，步骤如下：
S1、称取1g海藻酸钠粉末放入烧杯中，加入99g水配置质量分数为1％海藻酸钠溶液。放入80℃磁搅水浴锅中加热搅拌2h使质量分数为1％海藻酸钠水溶液充分溶解，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得混合溶液I。
S2、称取1g乳清分离蛋白粉末放入烧杯中，加入99g，质量分数为0.85％氯化钠溶液，配置质量分数为1％乳清分离蛋白溶液。在常温下磁搅2h使质量分数为1％乳清分离蛋白溶液充分溶解，并在4℃冰箱放置过夜使其充分水合，制得混合溶液II。
S3、称取1.2g聚甘油蓖麻醇酸酯放入烧杯中，加入28.8g中链脂肪酸酯中，配置质量分数为4％的聚甘油蓖麻醇酸酯溶液，混合均匀，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得油相溶液。
S4、称取1g黄原胶，分别加入到98g蒸馏水中，放入80℃磁搅水浴锅中加热搅拌1h使其充分溶解，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得混合溶液III。
S5、将植物乳杆菌接种于MRS培养基中37℃恒温培养48h，重复传代培养3次，最后一次传代培养至稳定期。取50mL进行离心，5000rpm时长为10～15min，弃上清液后加入等体积的生理盐水，生理盐水的质量分数为0.85％，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体,制得益生菌浓缩液。
S6、向溶液III中加入1mL益生菌浓缩液，混匀，制得内水相溶液。
S7、在无菌条件下进行操作。质量比为混合溶液I:混合溶液II＝2:3，用均质机搅拌10000rpm进行混匀，混匀时间为5min，制得外水相溶液。
S8、在无菌条件下进行操作。油相溶液:内水相溶液的质量比为3:2，用均质机搅拌5000rpm进行混匀，混匀时间为6min，制得混合溶液IV。
S9、外水相溶液：混合溶液IV的质量比为2:1，用均质机搅拌10000rpm进行混匀，混匀时间为6min，制得混合溶液V。
S10、将根据上述步骤制得的一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠进行模拟人工胃液测试。测试方法：胃电解质溶液的配制：准确称量0.6g NaHCO3，1.1g KCI和3.1g NaCl，然后用超纯水溶解并定容至1L，再用1mol/L的HCI溶液调节电解质溶液的pH为2.0，常温贮存备用。
模拟人工胃液的配制：将称取的质量为150.0mg的胃蛋白酶溶解于胃电解质溶液中，使其最终浓度为1mg/mL，4℃贮存，备用。
S11、将质量分数为2～5％的氯化钙溶于蒸馏水中，混合均匀，在121℃进行灭菌15min后冷却，备用，制得钙液。
S12、将混合溶液V采集于注射器中，滴入钙液中，反应10min后捞出，并用水清洗，制得提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠。
S13、称取10个凝胶珠放入模拟人工胃液，分别在37℃条件下振荡培养1h、2h、3h后捞出。将凝胶珠在生理盐水中剪碎，进行梯度稀释后涂布培养48h，计数单菌落数并计算植物乳杆菌存活率：
植物乳杆菌存活率＝模拟人工胃液处理后活菌数/模拟人工胃液处理前活菌数*100％
对照例二：
一种凝胶珠的制备方法，步骤如下：
S1、称取1g黄原胶，分别加入到98g蒸馏水中，放入80℃磁搅水浴锅中加热搅拌1h使其充分溶解，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得混合溶液I。
S2、将植物乳杆菌接种于MRS培养基中37℃恒温培养48h，重复传代培养3次，最后一次传代培养至稳定期。取50mL进行离心，5000rpm时长为10～15min，弃上清液后加入等体积的生理盐水，生理盐水的质量分数为0.85％，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体,制得益生菌浓缩液。
S3、向溶液III中加入1mL益生菌浓缩液，混匀，制得内水相溶液。
S4、将根据上述步骤制得的一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠进行模拟胃液测试。测试方法：胃电解质溶液的配制：准确称量0.6gNaHCO3、1.1g KCI和3.1gNaCl，然后用超纯水溶解并定容至1L，再用1mol/L的HCI溶液调节电解质溶液的pH为2.0，常温贮存，备用。
模拟人工胃液的配制：将称取的质量为150.0mg的胃蛋白酶溶解于胃电解质溶液中，使其最终浓度为1mg/mL，4℃贮存，备用。
称取与实例一中的凝胶珠等质量、等浓度的内水相溶液放入模拟胃液，分别在37℃振荡培养1h、2h、3h后捞出。进行梯度稀释后涂布培养48h，计数单菌落数并计算植物乳杆菌存活率：
植物乳杆菌存活率＝模拟人工胃液处理后活菌数/模拟人工胃液处理前活菌数*100％
表1复乳凝胶珠包载植物乳杆菌在模拟胃液中的存活率
如表1和图1所示，对比实施例一和对照例一，在进行模拟胃液处理3h后测得水包油包水型复乳凝胶珠的存活率的结果表明，水包油包水型复乳凝胶珠样品中的植物乳杆菌，即实施例一，存活率为63.6％，较内水相中未添加低聚果糖的复乳凝胶珠中的植物乳杆菌，即对照例一，存活率为59.2％，存活率提高了4.4％。可知，本发明一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠制备方法，在内水相添加低聚果糖后进行模拟胃液处理，黄原胶粉末和低聚果糖粉末协同可提高植物乳杆菌的存活率。
对比对照例一和对照例二，进行模拟胃液处理2h后，本发明一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠制备方法所制的样品，即对照例一，存活率为68.8％，其存活率较未进行包埋的植物乳杆菌，即对照例二，存活率为0，存活率显著提高了68.8％可知，本发明的水包油包水型复乳凝胶珠显著提高了益生菌在胃肠道的耐受性，使其可以停留更长的时间，此外，添加益生元可在胃消化期间为益生菌提供能量维持活性，二者协同作用，提高了益生菌在胃中的存活率。实施例一中，复乳凝胶珠中植物乳杆菌的浓度为1.2×1012cfu/g，远大于106cfu/g，可以在人体内有效发挥益生作用。
实施例二：
一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠的制备方法，步骤如下：
S1、称取1g海藻酸钠粉末放入烧杯中，加入99g水配置质量分数为1％海藻酸钠溶液。放入80℃磁搅水浴锅中加热搅拌2h使质量分数为1％海藻酸钠水溶液充分溶解，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得混合溶液I。
S2、称取1g乳清分离蛋白粉末放入烧杯中，加入99g，质量分数为0.85％氯化钠溶液，配置质量分数为1％乳清分离蛋白溶液。在常温下磁搅2h使质量分数为1％乳清分离蛋白溶液充分溶解，并在4℃冰箱放置过夜使其充分水合，制得混合溶液II。
S3、在无菌条件下进行操作。质量比为混合溶液I:混合溶液II＝2:3，用均质机搅拌10000rpm进行混匀，混匀时间为5min，制得外水相溶液。
S4、称取1.2g聚甘油蓖麻醇酸酯放入烧杯中，加入28.8g中链脂肪酸酯中，配置质量分数为4％的聚甘油蓖麻醇酸酯溶液，混合均匀，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得油相溶液。
S5、将植物乳杆菌接种于MRS培养基中37℃恒温培养48h，重复传代培养3次，最后一次传代培养至稳定期。取50mL进行离心，5000rpm时长为10～15min，弃上清液后加入等体积的生理盐水，生理盐水的质量分数为0.85％，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体,制得益生菌浓缩液。
S6、称取2g低聚果糖、1g黄原胶分别加入到96g蒸馏水中，放入80℃磁搅水浴锅中加热搅拌1h使其充分溶解，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得混合溶液III。
S7、向溶液III中加入1mL益生菌浓缩液，混匀，制得内水相溶液。
S8、在无菌条件下进行操作。油相溶液:内水相溶液的质量比为3:2，用均质机搅拌5000rpm进行混匀，混匀时间为6min，制得混合溶液IV。
S9、混合溶液IV：外水相溶液的质量比为2:1，用均质机搅拌10000rpm进行混匀，混匀时间为6min，制得混合溶液V。
S10、将质量分数为2％的氯化钙溶于蒸馏水中，混合均匀，在121℃进行灭菌15min后冷却，备用，制得钙液。
S11、将混合溶液V采集于注射器中，滴入钙液中，反应10min后捞出，并用水清洗，制得提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠。
S12、将根据上述步骤制得的提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠进行贮藏测试。测试方法：将凝胶珠放入10％蔗糖溶液中，在4℃冰箱内保存，每隔72h将部分凝胶珠捞出。将凝胶珠在生理盐水中剪碎，进行梯度稀释后涂布培养48h，计数单菌落数并计算植物乳杆菌存活率：
植物乳杆菌存活率＝贮藏后活菌数/新制得的凝胶珠中活菌数*100％。
对照例三：
一种凝胶珠的制备方法，步骤如下：
S1、称取1g海藻酸钠粉末放入烧杯中，加入99g水配置质量分数为1％海藻酸钠溶液。放入80℃磁搅水浴锅中加热搅拌2h使质量分数为1％海藻酸钠水溶液充分溶解，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得混合溶液I。
S2、称取1g乳清分离蛋白粉末放入烧杯中，加入99g，质量分数为0.85％氯化钠溶液，配置质量分数为1％乳清分离蛋白溶液。在常温下磁搅2h使质量分数为1％乳清分离蛋白溶液充分溶解，并在4℃冰箱放置过夜使其充分水合，制得混合溶液II。
S3、称取1.2g聚甘油蓖麻醇酸酯放入烧杯中，加入28.8g中链脂肪酸酯中，配置质量分数为4％的聚甘油蓖麻醇酸酯溶液，混合均匀，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得油相溶液。
S4、称取1g黄原胶，加入到98g蒸馏水中，放入80℃磁搅水浴锅中加热搅拌1h使其充分溶解，在121℃进行灭菌15min后冷却，制得混合溶液III。
S5、将植物乳杆菌接种于MRS培养基中37℃恒温培养48h，重复传代培养3次，最后一次传代培养至稳定期。取50mL进行离心，5000rpm时长为10～15min，弃上清液后加入等体积的生理盐水，生理盐水的质量分数为0.85％，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体,制得益生菌浓缩液。
S6、向溶液III中加入1mL益生菌浓缩液，混匀，制得内水相溶液。
S7、在无菌条件下进行操作。质量比为混合溶液I:混合溶液II＝2:3，用均质机搅拌10000rpm进行混匀，混匀时间为5min，制得外水相溶液。
S8、在无菌条件下进行操作。油相溶液:内水相溶液的质量比为3:2，用均质机搅拌5000rpm进行混匀，混匀时间为6min，制得混合溶液IV。
S9、外水相溶液：混合溶液IV的质量比为2:1，用均质机搅拌10000rpm进行混匀，混匀时间为6min，制得混合溶液V。
S10、将质量分数为2％的氯化钙溶于蒸馏水中，混合均匀，在121℃进行灭菌15min后冷却，备用，制得钙液。
S11、将混合溶液V采集于注射器中，滴入钙液中，反应10min后捞出，并用水清洗，制得提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠。
S12、将根据上述步骤制得的提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠进行贮藏测试。测试方法：将凝胶珠放入10％蔗糖溶液中，在4℃冰箱内保存，每隔72h将部分凝胶珠捞出。将凝胶珠在生理盐水中剪碎，进行梯度稀释后涂布培养48h，计数单菌落数并计算植物乳杆菌存活率：
植物乳杆菌存活率＝贮藏后活菌数/新制得的凝胶珠中活菌数*100％。
对照例四：
一种凝胶珠的制备方法，步骤如下：
S1、将植物乳杆菌接种于MRS培养基中37℃恒温培养48h，重复传代培养3次，最后一次传代培养至稳定期。取50mL进行离心，5000rpm时长为10～15min，弃上清液后加入等体积，质量分数为8.5％的生理盐水，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体，在4℃冰箱内保存，每隔72h进行梯度稀释后涂布培养48h，计数单菌落数并计算植物乳杆菌存活率：
植物乳杆菌存活率＝测试后活菌数/新制得的菌液活菌数*100％
表2.复乳凝胶珠在4℃低温贮藏环境下的存活率
如表2和图2所示，对比实施例二和对照例三，本发明一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠制备方法，即实施例二，在4℃条件下贮藏30天后植物乳杆菌的存活率为79.7％，较内水相中未添加低聚果糖的复乳凝胶珠，即对照例三，存活率为66.8％，提高了12.9％。可知，在内水相添加益生元后植物乳杆菌的贮藏存活率显著增加，黄原胶粉末和低聚果糖粉末能够协同提高植物乳杆菌的贮藏存活率。对比对照例三和对照例四，在4℃条件下贮藏30天后，内水相中未添加低聚果糖的复乳凝胶珠，即对照例三，存活率较未进行包埋的植物乳杆菌，即对照例四，存活率为36.7％，存活率显著提高了29.9％。可知，水包油包水的复乳体系可以减少外界环境对植物乳杆菌的影响，从而增加植物乳杆菌的存活率。对比实施例二和对照例三、四，本发明一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠制备方法所制的样品，即实施例二，在4℃条件下贮藏30天后存活率为79.7％，较未进行包埋的植物乳杆菌，即对照例四，存活率为36.7％，存活率提高了43.0％。可知，本发明的一种水包油包水型复乳凝胶珠显著提高了益生菌的耐受性，使其可以存活更长的时间，且添加益生元在贮藏期间为植物乳杆菌提供能量维持活性，明显延长了植物乳杆菌的贮藏期。也可以看出，本发明方法中黄原胶粉末、低聚果糖粉末、包埋植物乳杆菌之间具有协同作用，能够协同提高植物乳杆菌的贮藏存活率。
实施例二中，本发明一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠制备方法的植物乳杆菌浓度为1.5×1012cfu/g，远大于106cfu/g，具有很高的食用价值。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (10)
1.一种提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠，其特征在于：所述复乳凝胶珠包括外水相壳层结构、含益生菌内水相和油相，所述外水相壳层结构由海藻酸钠、乳清分离蛋白和氯化钠制备而成，所述含益生菌内水相由益生菌浓缩液、低聚果糖和黄原胶制备而成，所述油相由中链甘油三酯和聚甘油蓖麻醇酸酯制备而成。
2.根据权利要求1所述的提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠，其特征在于：所述凝胶珠中益生菌的存活率更高，包埋率最高为55.27％。
3.如权利要求1或2所述的提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠的保存方法，其特征在于：所述凝胶珠在4℃保存。
4.一种如权利要求1或2所述的水包油包水型复乳凝胶珠的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)混合溶液I的配置：将海藻酸钠粉末溶解于蒸馏水中，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(2)混合溶液II的配置：将乳清分离蛋白粉末溶解于氯化钠水溶液中，4℃过夜水合；
(3)外水相溶液的配置：将混合溶液I与混合溶液II混合，制得外水相溶液；
(4)油相溶液的配置：向中链甘油三酯中加入聚甘油蓖麻醇酸酯，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(5)益生菌浓缩液的配置：将植物乳杆菌接种至121±1℃灭菌15-20min冷却后的MRS液体培养基中，恒温培养，重复传代培养，最后一次传代培养至稳定期；离心、弃上清液后加入生理盐水，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体，制得益生菌浓缩液后冷却，备用；
(6)混合溶液III的配置：将黄原胶粉末和低聚果糖粉末加入蒸馏水中，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(7)内水相溶液的配置：将步骤(5)制备的益生菌浓缩液与混合溶液III混合，制得内水相溶液；
(8)混合溶液IV的配置：将步骤(7)制备的内水相溶液与步骤(4)制备的油相溶液混合，制得混合溶液IV；
(9)混合溶液V的配置：将步骤(8)制备的混合溶液IV与步骤(3)制备的外水相溶液混合，制得混合溶液V；
(10)钙液的配置：将氯化钙溶于蒸馏水中，混合均匀，在121±1℃进行灭菌15-20min后冷却，备用；
(11)将步骤(9)制备的混合溶液V采集于注射器中，滴入步骤(10)制备的钙液中，反应后捞出并用水清洗，制得提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，溶解于水后的海藻酸钠的质量分数为1％～5％，并将其于60℃～90℃磁力搅拌水浴锅中加热搅拌混合均匀，混合均匀时间为1～3h；
或者，步骤(2)中，氯化钠溶液的质量分数为0.3％～0.9％，乳清分离蛋白溶液的质量分数为1％～5％，在15℃～25℃下利用磁力搅拌混匀，混匀时间为1-2h，并在4℃冰箱内放置过夜充分水合。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，混合溶液I与混合溶液II在无菌条件下进行混合操作，混合溶液I：混合溶液II的质量比为2:3～5，用均质机在6000～10000rpm下进行混匀，混匀时间为2～6min；
或者，步骤(4)中，聚甘油蓖麻醇酸酯溶液的质量分数为1％～10％，在50℃～70℃水浴锅中利用磁力搅拌混匀，混匀时间为10～30min。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中益生菌浓缩液的制备步骤如下：将益生菌接种于MRS培养基中37℃恒温培养24～48h，重复传代培养2～3次，最后一次传代培养至稳定期；进行离心，5000～10000rpm离心10～15min，弃上清液后加入等体积的生理盐水，生理盐水的质量分数为0.5％～0.85％，重复离心操作2次，得到活性菌泥，最后加入相应等体积的生理盐水悬浮菌体，即得益生菌浓缩液；
或者，步骤(6)中，混合溶液III中黄原胶的质量分数为1％～5％，低聚果糖的质量分数为1％～5％，在30℃～90℃水浴锅中利用磁力搅拌混匀，混匀时间为1～3h。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(7)中，内水相溶液中益生菌浓缩液与混合溶液III的质量比为1～10:100；
或者，步骤(8)中，油相溶液与内水相溶液的质量比为3～4:2，用均质机在5000～10000rpm下进行混匀，混匀时间为2～6min。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(9)中，混合溶液IV与外水相溶液的质量比为2～3:1，用均质机在5000～10000rpm下进行混匀，混匀时间为2～6min；
或者，步骤(10)中，氯化钙溶液质量分数为2～5％；
或者，步骤(11)中，将混合溶液V滴加至质量分数为2～5％的氯化钙溶液中，反应10～30min后捞出，并用水清洗。
10.如权利要求1或2所述的提高益生菌存活率的水包油包水型复乳凝胶珠在食品方面中的应用。
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