CN116268410A - 一种牡丹籽油双层乳液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种牡丹籽油双层乳液及其制备方法和应用，包括以下步骤：将蛋白质加入磷酸盐缓冲液中得A相蛋白质溶液；将多糖加入磷酸盐缓冲液中得B相多糖溶液；将A相与牡丹籽油混合，经过高速剪切乳化得到粗乳，然后通过高压均质，得到牡丹籽油单层乳液；将牡丹籽油单层乳液与B相混合，调节pH，高速剪切，得到所述牡丹籽油双层乳液。本发明方法制备得到的牡丹籽油双层乳液，其加工稳定性好、贮藏稳定性高，且其生物利用率得到显著提升，可应用在食品及药物领域。

Description

一种牡丹籽油双层乳液及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品、药物加工技术领域，尤其涉及一种牡丹籽油双层乳液及其制备方法和应用。
背景技术
牡丹籽油是从凤丹和紫斑牡丹籽中提取而来的一种木本植物油脂，含90%以上多不饱和脂肪酸。其中，α-亚麻酸的含量达40%以上。此外，还含有植物甾醇、角鲨烯、生育酚等活性成分。2011年我国卫生部将其批准为新资源食品。然而，牡丹籽油不溶于水，在加工贮运过程极不稳定，且生物利用率低。这些特点极大地限制了牡丹籽油在食品、药物及化妆品等行业的应用。因此，提高其稳定性和生物利用率是牡丹籽油开发过程中亟需解决的关键问题。
目前，乳化技术是提高稳定性和生物利用度的有效措施，在食品、药物及化妆品等领域广受关注。制备乳液通常需要添加乳化剂。常用的小分子乳化剂如磷脂、单甘脂、蔗糖酯、吐温、斯盘等可快速吸附于油滴表面，容易形成粒径较小的乳液。然而，这些小分子乳化剂只是在油滴表明形成一层薄薄的界面膜，形成的乳液机械强度低，物理稳定性差，易絮凝聚结，货架期短。专利CN115181605A公开了一种牡丹籽油乳液的制备方法。该方法所使用的乳化剂吐温20是化学合成物，存在毒副作用。制备的牡丹籽油乳液为单层乳液，存在稳定性差等缺点。虽然向乳液中添加TBHQ可以一定程度上改善其氧化稳定性，但化学合成抗氧化剂TBHQ的潜在毒性仍是限制其应用的主要问题。CN104920642B公开了一种牡丹籽调和油微乳液的制备方法，该方法中利用十聚甘油单肉豆蔻酸酯和十聚甘油五油酸作为表面活性剂，聚乙二醇为助表面活性剂。所使用的表面活性剂和助表面活性剂均为化学合成物，存在安全隐患。因此，现有牡丹籽油乳液同时存在稳定性差和潜在安全性问题。
相比之下，蛋白质类（大豆分离蛋白、酪蛋白酸钠、乳铁蛋白等）、多糖类生物大分子乳化剂（甜菜果胶、改性淀粉等）能在油滴表面形成一层稳定牢固的界面膜，且不存在任何食用安全性问题。蛋白质类乳化剂形成的乳液粒径一般小于多糖类乳化剂形成的乳液粒径，但是其易受pH值、温度、离子强度、冻融过程的影响，物理化学稳定性较低。而多糖类乳化剂在其浓度足够时，易形成更厚的界面膜，但当乳液中存在强氧化剂时，其形成乳液的化学稳定性更差。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种牡丹籽油双层乳液的制备方法，提高牡丹籽油的稳定性和生物利用度。
本发明还提供一种通过上述方法制备的牡丹籽油双层乳液，该牡丹籽油双层乳液突破了牡丹籽油水不溶的限制，且有高的游离脂肪酸的释放速率和释放量，生物利用率高；与牡丹籽油单层乳液相比，该双层乳液贮藏稳定性好，利于后续加工、运输与贮藏。
本发明还提供一种上述牡丹籽油双层乳液在食品和药物加工技术领域中的应用。
本发明中蛋白质类和多糖类生物大分子乳化剂形成乳滴的表面带电，通过静电斥力和空间位阻作用，使乳液具有更好的物理稳定性，延长货架期。充分利用蛋白质类乳化剂和多糖类乳化剂的优势将二者有机结合形成双层乳液，使其更容易应用于食品、医药的生产加工过程中。此外，采用此技术使包埋成分和外部环境之间的接触最小化，具有比游离的油脂具有更高的稳定性和生物利用度。
在现有发表的论文及公开的专利文献中，没有发现关于牡丹籽油双层乳液的制备研究，也未见牡丹籽油双层乳液在提高稳定性和生物利用度方面的研究。
本发明制备方法包括以下步骤：（1）将蛋白质加入磷酸盐缓冲液中得A相（蛋白质溶液）；将多糖加入磷酸盐缓冲液中得B相（多糖溶液）；（2）将A相与牡丹籽油混合，经过高速剪切乳化得到粗乳，然后通过高压均质，得到牡丹籽油单层乳液；（3）将牡丹籽油单层乳液与B相混合，调节pH，高速剪切，得到所述牡丹籽油双层乳液。本发明方法制备得到的牡丹籽油双层乳液，其加工稳定性好、贮藏稳定性高，且其生物利用率得到显著提升，可应用在食品及药物领域。
本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。
一种牡丹籽油双层乳液的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、将蛋白质加入磷酸盐缓冲液中得A相，A相为蛋白质溶液；将多糖加入磷酸盐缓冲液中得B相，B相为多糖溶液；
步骤S2、将A相与牡丹籽油混合，经过高速剪切乳化得到粗乳；
步骤S3、将粗乳高压均质得到牡丹籽油单层乳液；
步骤S4、将牡丹籽油单层乳液与B相混合，调节pH，高速剪切，得到所述牡丹籽油双层乳液。
上述方案中，所述步骤S1中蛋白质为β-乳球蛋白、乳清分离蛋白或大豆分离蛋白，蛋白质的浓度为0.5~2.5 wt%；多糖为果胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠，多糖的浓度为0.25~1.50 wt%；
所述步骤S2中A相与牡丹籽油的质量比为80:20~95:5，高速剪切条件为12000 rpm剪切3 min；
所述步骤S3中高压均质的压力为20~50 MPa，循环次数为2~5次；
所述步骤S4中牡丹籽油单层乳液与B相的质量比为40:60~60:40；高速剪切条件为8000 rpm剪切2 min；pH调节范围为2.5~4.0。
进一步的，所述蛋白质为乳清分离蛋白，乳清分离蛋白的浓度为1.0wt%。
进一步的，所述多糖为海藻酸钠，海藻酸钠的浓度为1.0wt%。
进一步的，所述A相与牡丹籽油的质量比为90:10。
进一步的，所述高压均质压力为40 MPa条件下循环3次。
进一步的，所述牡丹籽油单层乳液与B相的质量比为50:50。
进一步的，所述pH为3.5。
一种牡丹籽油双层乳液，根据所述的牡丹籽油双层乳液制备方法得到。
一种牡丹籽油双层乳液在食品、药物制备领域中的应用。
本发明方法利用蛋白质（β-乳球蛋白、乳清分离蛋白或大豆分离蛋白）及多糖（果胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠）在不同pH条件下所带电荷种类和数量不同的特点，通过静电相互作用使牡丹籽油的油滴表面形成厚且致密的双层界面膜结构。本方法操作简单，方便易行，涉及的蛋白质、多糖来源广泛，价格低廉，营养功能性好且可生物降解。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明方法简单、易于操作，所使用的蛋白质、多糖来源广、价格低，具有良好的营养价值和生物可降解性，安全性高；
2、本发明方法所得牡丹籽油双层乳液的贮藏稳定性、氧化稳定性好；
3、本发明所得牡丹籽油双层乳液，在肠消化中有更高的游离脂肪酸（FFA）释放量，更容易被人体吸收，生物利用度高。
附图说明
图1为本发明的制备流程图。
图2为多糖种类对牡丹籽油双层乳液的电位、粒径和外观及微观情况影响图，图中，WPI代表乳清分离蛋白，Pectin代表果胶，SA代表海藻酸钠，CMC-Na代表羧甲基纤维素钠，其中，图2（A）为壁材分子的带电性质，图2（B）为多糖种类对牡丹籽油双层乳液Zeta电位的影响，图2（C）为多糖种类对牡丹籽油双层乳液第0天外观的影响，图2（D）为多糖种类对牡丹籽油双层乳液粒径的影响，图2（E）为多糖种类对牡丹籽油双层乳液PDI的影响，图2（F）为多糖种类对牡丹籽油双层乳液第7天外观的影响，图2（G）为果胶对牡丹籽油双层乳液微观的影响，图2（H）为海藻酸钠对牡丹籽油双层乳液微观的影响，图2（I）为羧甲基纤维素钠对牡丹籽油双层乳液微观的影响。
图3为海藻酸钠浓度对牡丹籽油双层乳液的电位、粒径和微观情况影响图，其中，图3（A）为海藻酸钠浓度对牡丹籽油双层乳液Zeta电位的影响，图3（B）为海藻酸钠浓度对牡丹籽油双层乳液粒径的影响，图3（C）为海藻酸钠浓度对牡丹籽油双层乳液PDI的影响，图3（D）为海藻酸钠浓度为0.25%时对牡丹籽油双层乳液微观的影响，图3（E）为海藻酸钠浓度为0.5%时对牡丹籽油双层乳液微观的影响，图3（F）为海藻酸钠浓度为0.75%时对牡丹籽油双层乳液微观的影响，图3（G）为海藻酸钠浓度为1.0%时对牡丹籽油双层乳液微观的影响，图3（H）为海藻酸钠浓度为1.25%时对牡丹籽油双层乳液微观的影响，图3（I）为海藻酸钠浓度为1.5%时对牡丹籽油双层乳液微观的影响。
图4为牡丹籽油双层乳液的流变学特性图，图中，ME代表单层乳液，BE代表双层乳液，G'代表储能模量，G''代表损失模量,其中，图4（A）为单双层乳液黏度随剪切速率改变的变化图，图4（B）为单双层乳液储能模量和损失模量随角频率改变的变化图。
图5为牡丹籽油双层乳液的贮藏特性和氧化稳定性图，图中，ME代表单层乳液组，BE代表双层乳液组，TPSO代表牡丹籽油组，POV表示过氧化值，TBARS表示硫代巴比妥酸值，CI表示乳析指数。其中，图5（A）为牡丹籽油单双层乳液4℃贮藏时Zeta电位的变化，图5（B）为牡丹籽油单双层乳液4℃贮藏时粒径的变化，图5（C）为牡丹籽油单双层乳液4℃贮藏时PDI的变化，图5（D）为牡丹籽油单双层乳液4℃贮藏时乳析指数的变化，图5（E）为牡丹籽油及其单双层乳液4℃贮藏时过氧化值的变化；图5（F）为牡丹籽油及其单双层乳液4℃贮藏时硫代巴比妥酸值的变化；图5（G）为牡丹籽油单双层乳液25℃贮藏时Zeta电位的变化，图5（H）为牡丹籽油单双层乳液25℃贮藏时粒径的变化，图5（I）为牡丹籽油单双层乳液25℃贮藏时PDI的变化，图5（J）为牡丹籽油单双层乳液25℃贮藏时乳析指数的变化，图5（K）为牡丹籽油及其单双层乳液25℃贮藏时过氧化值的变化；图5（L）为牡丹籽油及其单双层乳液25℃贮藏时硫代巴比妥酸值的变化；图5（M）为牡丹籽油单层乳液4℃贮藏第30天时的外观和微观图，图5（N）为牡丹籽油双层乳液4℃贮藏第30天时的外观和微观图，图5（O）为牡丹籽油单层乳液25℃贮藏第30天时的外观和微观图，图5（P）为牡丹籽油双层乳液25℃贮藏第30天时的外观和微观图。
图6为FFA释放结果图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好的解释本发明，不用于限制本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
结合图1，本发明所述牡丹籽油双层乳液的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、将蛋白质加入磷酸盐缓冲液中得A相，A相为蛋白质溶液；将多糖加入磷酸盐缓冲液中得B相，B相为多糖溶液；
步骤S2、将A相与牡丹籽油混合，经过高速剪切乳化得到粗乳；
步骤S3、将粗乳高压均质得到牡丹籽油单层乳液；
步骤S4、将牡丹籽油单层乳液与B相混合，调节pH，高速剪切，得到牡丹籽油双层乳液。
所述蛋白质为β-乳球蛋白、乳清分离蛋白或大豆分离蛋白。
所述多糖为果胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠。
所述蛋白质的浓度为0.5~2.5wt%。
所述多糖的浓度为0.25~1.5wt%。
步骤S2中，将A相与牡丹籽油以质量比为80:20~95:5混合，优选的，A相与牡丹籽油的质量比为90:10。
步骤S2中，所述高速剪切条件为12000rpm剪切3min。
步骤S3中，所述高压均质的压力为20~50 MPa，循环次数为2~5次，优选的，高压均质压力为40 MPa，循环3次。
步骤S4中，将牡丹籽油单层乳液与B相以质量比为40:60~60:40混合，优选的，牡丹籽油单层乳液与B相的质量比为50:50。
步骤S4中，所述pH调节范围为2.5~4.0，优选的，pH为3.5。
步骤S4中，所述高速剪切条件为8000rpm剪切2min。
本发明方法利用蛋白质（β-乳球蛋白、乳清分离蛋白或大豆分离蛋白）及多糖（果胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠）在不同pH条件下所带电荷种类和数量不同的特点，通过静电相互作用使牡丹籽油的油滴表面形成厚且致密的双层界面膜结构。本方法操作简单，方便易行，涉及的蛋白质、多糖来源广泛，价格低廉，营养功能性好且可生物降解。
实施例1：蛋白质种类的考察。
分别按照下述3种条件制备牡丹籽油单层乳液：
1）取90g 1.0 wt%的β-乳球蛋白水溶液，加入10g牡丹籽油，12000r/min高速剪切3min后，得到牡丹籽油粗乳，将粗乳在40MPa条件下均质3次，得到牡丹籽油单层乳液；
2）取90g 1.0 wt%的乳清分离蛋白水溶液，加入10g牡丹籽油，12000r/min高速剪切3min后，得到牡丹籽油粗乳，将粗乳在40MPa条件下均质3次，得到牡丹籽油单层乳液；
3）取90g 1.0 wt%的大豆分离蛋白水溶液，加入10g牡丹籽油，12000r/min高速剪切3min后，得到牡丹籽油粗乳，将粗乳在40MPa条件下均质3次，得到牡丹籽油单层乳液。
本实施例制备的牡丹籽油单层乳液的电位、粒径和PDI如表1所示。
表1牡丹籽油单层乳液的电位和粒径
蛋白质种类 Zeta电位（mV） 粒径（nm） PDI（%）
β-乳球蛋白 -18.79±0.26 a 687.54±24.16 b 25.61±2.53 b
乳清分离蛋白 -37.86±0.38b 286.62±2.88c 24.92±1.85b
大豆分离蛋白 -38.38±0.42b 960.97±36.86a 38.36±1.13a
选择β-乳球蛋白、乳清分离蛋白和大豆分离蛋白作为牡丹籽油单层乳液的潜在乳化剂，结果如表1所示。Zeta电位是表征胶体分散体系稳定性的一个重要指标，当Zeta电位绝对值>30mV时，乳液由于足够的静电排斥力而稳定存在。用乳清分离蛋白和大豆分离蛋白稳定的牡丹籽油单层乳液的Zeta电位相当，接近-40mV，远高于β-乳球蛋白稳定的单层乳液，表明乳清分离蛋白和大豆分离蛋白对油滴聚集表现出极强的抵抗力。
粒径和PDI是表征胶体分散体系稳定性的另一个重要指标，单层乳液粒径足够小时越有利于在后续制备较小粒径的双层乳液，且PDI＜30%时也能表明胶体分散体系具有较高稳定性。在3种单层乳液中，当乳清分离蛋白用作乳化剂时，粒径和PDI最小。而大豆分离蛋白的PDI值大于30%，粒径分布不均匀。特别是β-乳球蛋白和大豆分离蛋白制备的牡丹籽油单层乳液的粒径在680nm以上，大豆分离蛋白稳定的单层乳液在放置7天后发生了分层现象，这表明大豆分离蛋白不具有乳化和稳定牡丹籽油的能力。因此，乳清分离蛋白被选为制备牡丹籽油单层乳液最合适的乳化剂。
实施例2：乳清分离蛋白浓度的考察。
分别按照下述5种条件制备牡丹籽油单层乳液：
1）取90g 0.5wt%的乳清分离蛋白水溶液，加入10g牡丹籽油，12000r/min高速剪切3min后，得到牡丹籽油粗乳，将粗乳在40MPa条件下均质3次，得到牡丹籽油单层乳液；
2）取90g 1.0 wt%的乳清分离蛋白水溶液，加入10g牡丹籽油，12000r/min高速剪切3min后，得到牡丹籽油粗乳，将粗乳在40MPa条件下均质3次，得到牡丹籽油单层乳液；
3）取90g 1.5wt%的乳清分离蛋白水溶液，加入10g牡丹籽油，12000r/min高速剪切3min后，得到牡丹籽油粗乳，将粗乳在40MPa条件下均质3次，得到牡丹籽油单层乳液；
4）取90g 2.0 wt%的乳清分离蛋白水溶液，加入10 g牡丹籽油，12000r/min高速剪切3min后，得到牡丹籽油粗乳，将粗乳在40MPa条件下均质3次，得到牡丹籽油单层乳液；
5）取90g 2.5wt%的乳清分离蛋白水溶液，加入10g牡丹籽油，12000r/min高速剪切3min后，得到牡丹籽油粗乳，将粗乳在40MPa条件下均质3次，得到牡丹籽油单层乳液。
表2 牡丹籽油单层乳液的电位和粒径
浓度（%） Zeta 电位（mV） 粒径（nm） PDI（%）
0.5 -36.40±0.73a 304.90±10.14b 24.61±1.11
1.0 -37.58±0.36b 287.17±6.84c 24.29±0.41
1.5 -37.45±0.46b 308.54±8.59b 25.46±0.91
2.0 -37.41±0.43b 307.60±5.08b 25.75±0.56
2.5 -37.51±0.61b 327.96±6.24a 25.48±1.12
不同浓度乳清分离蛋白对牡丹籽油单层乳液的电位和粒径影响，如表2所示。用0.5%乳清分离蛋白稳定的牡丹籽油单层乳液显示出相对较大的粒径、低的Zeta电位绝对值。这可能是由于乳清分离蛋白浓度低，不足以充分乳化和稳定牡丹籽油，使牡丹籽油又表现出大的颗粒尺寸。这些指标随着乳清分离蛋白浓度的增加而显著改善，当乳清分离蛋白浓度为1%时，牡丹籽油单层乳液的粒径减小至287nm，Zeta电位接近-38mV，表明适当增加乳清分离蛋白浓度可使单层乳液更稳定。
进一步增加乳清分离蛋白浓度（1.5~2.5%）并没有导致牡丹籽油单层乳液的Zeta电位和包封率显著增加，相反，颗粒粒径增加，甚至贮藏7天后出现不同程度的分层现象。
在牡丹籽油被充分乳化的情况下，应尽量减少乳清分离蛋白的量，否则过量的乳清分离蛋白可能与双层乳液中带相反电荷的聚电解质相互作用。因此，选择1%的乳清分离蛋白来稳定牡丹籽油。
实施例3：多糖种类的考察。
分别按照下述3种条件制备牡丹籽油双层乳液：
1）按照实施例2中2)制备牡丹籽油单层乳液，取50g牡丹籽油单层乳液，加入50g1.0wt%的果胶水溶液，300r/min搅拌2min后，用1M HCl调节pH 3.5，在8000 r/min混匀2min后得到牡丹籽油双层乳液；
2）按照实施例2中2)制备牡丹籽油单层乳液，取50g牡丹籽油单层乳液，加入50g1.0wt%的海藻酸钠水溶液，300r/min搅拌2min后，用1M HCl调节pH 3.5，在8000 r/min混匀2min后得到牡丹籽油双层乳液；
3）按照实施例2中2)制备牡丹籽油单层乳液，取50g牡丹籽油单层乳液，加入50g1.0wt%的羧甲基纤维素钠水溶液，300r/min搅拌2min后，用1M HCl调节pH 3.5，在8000 r/min混匀2min后得到牡丹籽油双层乳液。
本实施例制备的牡丹籽油双层乳液的电位、粒径和外观及微观情况如图2所示。
乳清分离蛋白和果胶、海藻酸钠和羧甲基纤维素钠这3种多糖的Zeta电位如图2（A）所示，3种多糖均为阴离子多糖，在pH 3~8时带负电，乳清分离蛋白是一种两性电解质，低于等电点带正电荷，高于等电点带负电荷。一方面，蛋白质的正电荷和多糖的负电荷越大，两者之间的静电吸引越强，形成的界面层越强。另一方面，蛋白质和多糖的电荷中和后剩余的静电荷的绝对值越高，制备的牡丹籽油双层乳液越稳定。在三种多糖中，海藻酸钠在pH 3~4时具有最大的负电荷绝对值，其次是羧甲基纤维素钠，果胶最小。理论上，海藻酸钠是最适合制备牡丹籽油双层乳液的外壁材料。
分别使用这3种多糖制备的双层乳液的物理性质、微观结构和外观形态如图2（B）-图2（I）所示。当海藻酸钠和羧甲基纤维素钠用作外壁材料时牡丹籽油双层乳液的粒径和PDI较小，如图2（D）和图2（E）所示。相较于采用果胶和海藻酸钠作为外层壁材，采用羧甲基纤维素钠时观察到明显的油滴，如图2（G）-图（I）。果胶稳定的双层乳液最大粒径为3295nm，PDI为48%，乳液液滴分布不均匀，储存7天后出现明显分层，如图2（D）、图2（E）和图2（F），且果胶的Zeta电位绝对值远小于和海藻酸钠，如图2（B）。因此，海藻酸钠是牡丹籽油双层乳液最合适的外壁材料。
实施例4：多糖浓度的考察。
分别按照下述6种条件制备牡丹籽油双层乳液：
1）按照实施例2中2)制备牡丹籽油单层乳液，取50g牡丹籽油单层乳液，加入50g0.25wt%的海藻酸钠水溶液，300r/min搅拌2min后，用1M HCl 调节pH 3.5，在8000 r/min混匀2min后得到牡丹籽油双层乳液；
2）按照实施例2中2)制备牡丹籽油单层乳液，取50g牡丹籽油单层乳液，加入50g0.50wt%的海藻酸钠水溶液，300r/min搅拌2min后，用1M HCl 调节pH 3.5，在8000 r/min混匀2min后得到牡丹籽油双层乳液；
3）按照实施例2中2)制备牡丹籽油单层乳液，取50g牡丹籽油单层乳液，加入50g0.75wt%的海藻酸钠水溶液，300r/min搅拌2min后，用1M HCl 调节pH 3.5，在8000 r/min混匀2min后得到牡丹籽油双层乳液；
4）按照实施例2中2)制备牡丹籽油单层乳液，取50g牡丹籽油单层乳液，加入50g1.00wt%的海藻酸钠水溶液，300r/min搅拌2min后，用1M HCl 调节pH 3.5，在8000 r/min混匀2min后得到牡丹籽油双层乳液；
5）按照实施例2中2)制备牡丹籽油单层乳液，取50g牡丹籽油单层乳液，加入50g1.25wt%的海藻酸钠水溶液，300r/min搅拌2min后，用1M HCl 调节pH 3.5，在8000 r/min混匀2min后得到牡丹籽油双层乳液；
6）按照实施例2中2)制备牡丹籽油单层乳液，取50g牡丹籽油单层乳液，加入50g1.50wt%的海藻酸钠水溶液，300r/min搅拌2min后，用1M HCl 调节pH 3.5，在8000 r/min混匀2min后得到牡丹籽油双层乳液。
本实施例制备的牡丹籽油双层乳液的Zeta电位、粒径和微观情况如图3。
0.25%海藻酸钠稳定的双层乳液具有最大的粒径和PDI和最小的Zeta电位绝对值图3（A）-图3（C），此时，添加的海藻酸钠浓度不足以完全覆盖液滴表面，一分子海藻酸钠吸附在多个液滴上，导致桥接絮凝和粒径增加。因此，可以观察到一些液滴聚集在一起，如图3（D），并且在储存7天后出现相分离。随着浓度增加，单层乳液中乳清分离蛋白层的正电荷逐渐被中和，使所得的双层乳液带负电，并且负电荷的绝对值随着海藻酸钠浓度的增加而相应增加如图3（A），粒径和PDI相应减小，如图3（B）和图3（C）。
当海藻酸钠浓度为1%时，双层乳液的Zeta电位达到最大值（-31mV），粒径（1291nm）和PDI（27%）最小，如图3（A）-图3（C），这表明海藻酸钠已完全包裹油滴的蛋白分子。相较于采用低浓度海藻酸钠，如图3（D）-图（F），或者高浓度海藻酸钠，如图3（H）和（I），当海藻酸钠浓度为1%时，可以观察到双层乳液显示出稳定和均匀的分散，如图3（G），说明1%的海藻酸钠能够在单层乳液中与乳清分离蛋白完全产生静电相吸附，形成固体带负电的稳定的双界面层。
因此，选用1%乳清分离蛋白和1%海藻酸钠作为内壁和外壁材料制备的双层乳液，Zeta电位、粒径和PDI分别为-31mV、1291nm和27%。
实施例5：牡丹籽油双层乳液的流变特性。
使用DHR-1流变仪，对按照实施例2中2)制备牡丹籽油单层乳液和将按照实施例4中4)制备牡丹籽油双层乳液的流变性能进行测定。表观粘度通过板直径为40mm、剪切速率为0.1~100S-1的稳态流动测量，所有动态测试均在线性粘弹性区域进行。弹性模量和损耗模量在板旋转频率为0.1～10rad/s、应变值为1%的情况下测定，结果如图4所示。
流变性能是评价乳液稳定性的重要指标。在高粘度下，乳液通常不易浮起或沉淀，并表现出良好的物理稳定性。如图4（A）所示，随着剪切速率的增加，单层和双层乳液的粘度都趋于降低，并显示出剪切变薄，因此两者都是非牛顿流体。在任何剪切速率（0.1-100 S-1）下，双层乳液的粘度都大于单层乳液，表明双层乳液比单层乳液更稳定。这主要是由于乳清分离蛋白和海藻酸钠之间的静电相互作用使油水界面层更加稳定。
储能模量（G'），也称为弹性模量，表示乳液网络结构的弹性行为；损失模量（G''）表示乳液网络结构的粘性行为。G'越低，乳液液滴之间的相互作用力越弱，在受到外力时变形越容易。单层和双层乳液的G'始终高于G''，并且它们没有交叉，如图4（B），表明这两种乳液都形成了以弹性为主的凝胶网络结构。在任何角频率下，双层乳液的G'都高于单层乳液，如图4（B），表明海藻酸钠的加入显著增强了单层乳液的粘弹性。一方面，随着海藻酸钠在油-水界面的加入，界面膜的厚度增加，液滴间的堆积变得更紧密，这使其更耐变形。另一方面，连续相中未吸附的海藻酸钠可以增加乳液粘度并有助于增强乳液凝胶结构。
实施例5：牡丹籽油双层乳液中蛋白质的二级结构。
将按照实施例2中2)制备牡丹籽油单层乳液、按照实施例4中4)制备牡丹籽油双层乳液以及乳清分离蛋白水溶液中乳清分离蛋白的二级结构分析。检测条件为：波长为190~250nm，带宽为1nm，间隔为0.5nm/s。检测结果如表3所示。
表3 乳清分离蛋白溶液、牡丹籽油单层乳液和双层乳液中蛋白质的二级结构（%）
α-螺旋 β-折叠 β-转角 无规则结构
WPI 28.73±1.02 a 17.90±0.20 b 19.63±0.59 c 35.27±1.46 a
ME 13.75±1.63 c 29.90±1.84 a 21.05±0.49 b 36.00±0.42 a
BE 17.27±0.76 b 28.57±0.65 a 24.47±0.35 a 31.57±0.55 b
表3中，WPI表示乳清分离蛋白，ME代表牡丹籽油单层乳液，BE代表牡丹籽油双层乳液。同一列数据标记不同字母代表具有显著性差异。
与乳清分离蛋白相比，单层乳液中蛋白质的α-螺旋含量降低了52.1%，β-折叠角和β-转角分别相应地增加了67.0%和7.2%。α-螺旋主要由肽链的氨基氢（NH-）和羰基氧（CO-）之间的氢键稳定，单层乳液中α-螺旋的减少可能归因于高压均质导致的氢键结构破坏。此外，高压均质过程产生热量，这也可能导致蛋白质二级结构的变化。与单层乳液相比，双层乳液中蛋白质的α-螺旋和β-转角含量分别增加25.6%和16.2%，随机卷曲含量相应减少12.3%，表明乳清分离蛋白的二级结构在通过静电相互作用与多糖结合后变得更加有序，更有助于抵抗外力作用。
实施例6：牡丹籽油双层乳液的贮藏和氧化稳定性。
将按照实施例2中2）制备牡丹籽油单层乳液、按照实施例4中4）制备牡丹籽油双层乳液以及牡丹籽油在4℃和25℃条件下贮藏30天，每5天定时取样，测其各项理化指标，以对牡丹籽油双层乳液的贮藏和氧化稳定性进行评价。
牡丹籽油组、单层乳液组和双层乳液组在4℃和25℃的贮藏时的物理化学参数的变化如图5。
单层和双层乳液的粒径和PDI都随着储存时间的增加而增加，而Zeta电位没有显著变化，如图5（A）-图5（C），图5（G）-图5（I）。单层乳液和双层乳液的粒径分别为初始粒径的2.9倍和2.3倍，在4℃下持续30天，双层乳液的粒度始终高于单层乳液。在25℃下，前10天，单层乳液的粒径和PDI小于双层乳液，但从15天开始观察到相反的现象。储存30天时，单层乳液的粒径达到28283nm，比初始单层乳液高99.7倍，并且存在严重的分层和明显的油滴聚集，如图5（O），表明单层乳液的分层和乳液破裂随着储存温度的升高而显著增加。相比之下，在25℃储存30天的双层乳液的粒径仅为4410 nm，是初始双层乳液的3.3倍，仍然显示出相对均匀的分散图5（P）。粘度是影响乳液稳定性的重要因素，海藻酸钠的高粘度有助于双层乳液的稳定性。因此，双层乳液比单层乳液具有更好的分散性和稳定性。
储存期间牡丹籽油及其单层和双层乳液的氧化指数变化如图5，在第0天，牡丹籽油组及单层和双层乳液组的POV值和TBARS值没有显著差异，表明乳化不会加速牡丹籽油的氧化。随着储存时间的增加，TPSO组及其单层乳液组和双层乳液组显示出不同程度的氧化，这可以通过POV值和TBARS值的增加来证实，如图5（E）、（F）、（K）和（L）。相比之下，单层乳液的氧化程度最高，双层乳液组的氧化度最低，由于乳液中油脂的比表面积较大，单层乳液组的POV值和TBARS值均高于TPSO组。此外，单层乳液组不太稳定，易于相分离，且一些牡丹籽油未完全包封，这种情况会加速牡丹籽油氧化。
与4℃相比，如图5（E）和图5（F），牡丹籽油组及其单层和双层乳液组在25℃下显著增加了氧化程度，如图5（K）和图5（L）。在25℃下储存30天后，单层乳液的POV值和TBARS值分别达到0.217和0.089 mmol/kgoil，分别比初始时间增加37.55%和279.27%。在相同条件下，双层乳液的POV值和TBARS值分别为0.192和0.056 mmol/kg oil，仅比初始值高17.98%和141.55%，表明与单层乳液相比，双层乳液具有显著增强的氧化稳定性。这是由于海藻酸钠和乳清分离蛋白间的静电相互作用形成了厚而致密的界面膜，这可以将牡丹籽油与氧气和其他加速氧化的因素分离，从而防止其氧化。此外，单层乳液的CI随储存时间增加而增加，而双层乳液保持不变；在两种温度下，双层乳液的CI显著小于单层乳液的CI，如图5（D）和图5（J）。因此，用乳清分离蛋白和海藻酸钠层层封装牡丹籽油，是防止其氧化的有效策略。
实施例7：牡丹籽油双层乳液的消化特性。
为了研究牡丹籽油组、物理混合组、和实施例4中4）得到双层乳液组中牡丹籽油在胃肠道中的消化情况，建立了口腔-胃-肠消化模型，以模拟人体消化道环境。其中，物理混合组和初级乳液组的牡丹籽油和蛋白质含量相同，但前者未经均质处理，而牡丹籽油组仅由牡丹籽油和磷酸盐缓冲液组成。游离脂肪酸（FFA）的释放通过pH-stat法计算，结果如图6所示。
在三组样品中，牡丹籽油组具有最慢的FFA释放速率，且模拟肠液消化180min后释放的FFA最少，低于20%，证实了仅牡丹籽油存在时具有较低的生物利用度。此外，物理混合组的FFA释放仅高于牡丹籽油组，这说明没有乳化剂或乳化剂难以充分乳化油的情况下，油脂可能漂浮在模拟消化溶液的表面上，不能与消化溶液完全接触，这反过来决定了甘油三酯的低分解率。
前20min双层乳液中FFA的释放速率最快，然后逐渐稳定。在肠道消化结束时（180min），双层乳液的FFA释放量为89.2%，绝大多数被消化，表明聚合物电解质层不会阻碍肠道对牡丹籽油的消化和吸收。与牡丹籽油和物理混合组相比，双层乳液组的脂肪酸释放速率和释放量显著增加，表明牡丹籽油制成双层乳液后其生物利用度得到显著提升。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种牡丹籽油双层乳液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、将蛋白质加入磷酸盐缓冲液中得A相，A相为蛋白质溶液；将多糖加入磷酸盐缓冲液中得B相，B相为多糖溶液；
步骤S2、将A相与牡丹籽油混合，经过高速剪切乳化得到粗乳；
步骤S3、将粗乳高压均质得到牡丹籽油单层乳液；
步骤S4、将牡丹籽油单层乳液与B相混合，调节pH，高速剪切，得到所述牡丹籽油双层乳液。
2.根据权利要求1所述的牡丹籽油双层乳液的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中蛋白质为β-乳球蛋白、乳清分离蛋白或大豆分离蛋白，蛋白质的浓度为0.5~2.5 wt%；多糖为果胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠，多糖的浓度为0.25~1.50 wt%；
所述步骤S2中A相与牡丹籽油的质量比为80:20~95:5，高速剪切条件为12000 rpm剪切3 min；
所述步骤S3中高压均质的压力为20~50 MPa，循环次数为2~5次；
所述步骤S4中牡丹籽油单层乳液与B相的质量比为40:60~60:40；高速剪切条件为8000rpm剪切2 min；pH调节范围为2.5~4.0。
3. 根据权利要求2所述的牡丹籽油双层乳液的制备方法，其特征在于，所述蛋白质为乳清分离蛋白，乳清分离蛋白的浓度为1.0 wt%。
4.根据权利要求2所述的牡丹籽油双层乳液的制备方法，其特征在于，所述多糖为海藻酸钠，海藻酸钠的浓度为1.0wt%。
5.根据权利要求2所述的牡丹籽油双层乳液的制备方法，其特征在于，所述A相与牡丹籽油的质量比为90:10。
6.根据权利要求2所述的牡丹籽油双层乳液的制备方法，其特征在于，所述高压均质压力为40 MPa条件下循环3次。
7.根据权利要求2所述的牡丹籽油双层乳液的制备方法，其特征在于，所述牡丹籽油单层乳液与B相的质量比为50:50。
8.根据权利要求2所述的牡丹籽油双层乳液的制备方法，其特征在于，所述pH为3.5。
9.一种牡丹籽油双层乳液，其特征在于，根据权利要求1～8任意一项所述的制备方法得到。
10.一种根据权利要求9所述的牡丹籽油双层乳液在食品、药物制备领域中的应用。
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