CN108853021B - 一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂及其制备方法 - Google Patents

一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂及其制备方法。该方法包括以下步骤：S1.将益生菌菌悬液与增稠剂、肠道辅助释放材料（即可以辅助益生菌在肠道中释放的材料）混合后，以二价盐离子诱导形成凝胶状内水相W1；S2.将油溶性乳化剂溶于食用油形成油相O，将油相O与内水相W1经高速剪切混合，得到油包水型初乳W1/O；S3.以胶体颗粒的悬浮液为外水相W2，向所述初乳W1/O中加入外水相W2，经中速剪切混合，得到W1/O/W2型双乳液结构的益生菌乳液制剂。本发明采用皮克林双乳液体系对益生菌进行保护性包埋，在充分保证益生效果的同时，使益生菌免受氧气和胃肠道环境的破坏，既可以耐受胃酸和胆盐的作用又能在肠道更好地定植，应用前景广阔。

Description

一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂及其制备方法。
背景技术
益生菌是一种活的微生物，在给予足够剂量时对宿主的健康起有益作用。它通过寄主于宿主细胞，促进宿主肠内微生态平衡，对宿主健康和/或生理功能产生有益作用，如能够改善胃肠道功能、调节肠道菌群、降低胆固醇、改善血脂以及提高免疫力等。以益生菌为原料制成的产品也就是通常所说的微生态制剂，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等均为益生菌制剂中具有代表性的菌种。
益生菌肠道益生作用的最低活菌数为7log/mg(mL)，这就要求益生菌产品在存储和机体消化过程中都保持稳定。但是，大多数益生菌属于兼性厌氧型，在存储过程中容易受到氧气的影响，且在环境pH值、温度的影响下益生菌的存储稳定性差；而后续益生菌经人体口腔摄入进入消化道时，经由酸性胃液、消化酶、胆盐作用后会进一步失活，导致最终定植于肠道中的活菌数通常低于理论上能够发挥生理作用的最小值。
然而，目前国内生产的益生菌制剂尚存在较多的不足，如产品质量不稳定、益生菌的存活率低，且多为固态制剂。为了改善益生菌产品的稳定性、改善产品外观及延长货架时间，目前研究最多的是微胶囊包埋技术以及衍生的多层包埋技术。在这两种技术的喷雾干燥过程中，益生菌的存活情况主要依赖于菌体浓度与种类、微胶囊壁材的种类和含量、喷雾干燥器出口的温度等，影响因素错综复杂、制备工艺繁复、难以避免部分菌体的死亡，胶囊在机体降解时间长，很难控制产品的质量标准。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂的制备方法。本发明开发出了一种新型负载益生菌的液体递送体系，在充分保证益生菌制剂益生效果的同时，解决了益生菌在常温存储和机体消化过程中容易失活的问题，提高了益生菌口服消化的稳定性，有利于益生菌在机体内更好地发挥生理活性作用。
本发明的第一个目的是提供一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂的制备方法。
本发明的第二个目的是提供一种使用上述制备方法所得到的益生菌液态制剂。本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.将益生菌菌悬液与增稠剂、肠道辅助释放材料混合后，以二价盐离子诱导形成凝胶状内水相W1；
S2.将油溶性乳化剂溶于食用油形成油相O，将油相O与内水相W1经高速剪切混合，得到油包水型初乳W1/O；
S3.以胶体颗粒的悬浮液为外水相W2，向所述初乳W1/O中加入外水相W2，经中速剪切混合，得到W1/O/W2型双乳液结构的益生菌乳液制剂。
本发明制备的益生菌液态制剂既可以耐受胃酸和胆盐的作用，又能在肠道更好地定植，具有肠道靶向控释性能，从而可以提高益生菌口服消化的稳定性，有利于益生菌在机体内更好地发挥生理活性作用。
本发明的方法中，益生菌可以是任何益生菌。
优选地，本发明的益生菌包括但不限于长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、德式乳杆菌或保加利亚乳杆菌。
本发明对食用油没有特殊限制，能满足食用的相关要求即可。
优选地，所述内水相W1中，增稠剂的质量百分比为0.01～2wt％。
更优选地，所述内水相W1中，增稠剂的质量百分比为0.5wt％。
优选地，所述增稠剂为具有离子诱导胶凝性质的增稠剂。
更优选地，所述增稠剂包括但不限于海藻酸钠、ι-卡拉胶或低甲氧基果胶(即酯化度(DE)小于50％的果胶)。
优选地，所述内水相W1中，肠道辅助释放材料的质量百分比为0.01～2wt％。
更优选地，所述内水相W1中，肠道辅助释放材料的质量百分比为0.5wt％。
本发明所述肠道辅助释放材料是指可以辅助益生菌在肠道中释放的材料。本发明发现，壳聚糖、果胶钙、聚丙烯酸树脂、直链淀粉、瓜尔豆胶、硫酸软骨素或海藻酸钠等材料可以较好地辅助益生菌在肠道中释放的材料。
优选地，所述肠道辅助释放材料包括壳聚糖、果胶钙、聚丙烯酸树脂、直链淀粉、瓜尔豆胶、硫酸软骨素或海藻酸钠中的一种或多种。
优选地，所述肠道辅助释放材料先以醋酸溶液预溶解，再用氢氧化钠调节pH值至中性。
优选地，所述醋酸溶液的浓度为0.1％～2％。
优选地，所述氢氧化钠的浓度为0.1～1mol/L。
优选地，所述二价盐离子为二价钙离子。
优选地，所述二价钙离子包括但不限于氯化钙、碳酸钙或硫酸钙。
优选地，所述二价盐离子的含量为0.01～2wt％。
更优选地，所述二价盐离子的含量为1wt％。
优选地，步骤S1中，所述内水相W1中益生菌的负载浓度≥7log/mL。
优选地，步骤S1中，所述益生菌菌悬液的制备方法为：将益生菌依次经活化、培养、离心分离后，获得菌体，将菌体悬浮于无菌水中制成益生菌菌悬液。
优选地，步骤S2中，所述油溶性乳化剂的添加量为油相O的1％～4％(v/v)。
更优选地，步骤S2中，所述油溶性乳化剂的添加量为油相O的1％～2％(v/v)。
优选地，所述油溶性乳化剂包括但不限于聚甘油蓖麻醇酸酯(PGPR)或司班20等油溶性乳化剂。
优选地，步骤S2中，所述油相O的制备方法为：向食用油中加入油溶性乳化剂，以300～700rpm磁力搅拌1～2h，即可得到油相O。
优选地，步骤S2中，所述油相O与内水相W1的体积比为1～5:1。
更优选地，步骤S2中，所述油相O与内水相W1的体积比为2～4:1。
优选地，步骤S3中，所述胶体颗粒包括但不限于细菌纤维素、玉米醇溶蛋白、高粱醇溶蛋白或微晶纤维素中的一种或多种。这些胶体颗粒具有乳液界面稳定作用。
优选地，步骤S3中，所述外水相W2中，胶体颗粒的质量百分比为0.5～4wt％。
更优选地，所述外水相W2中，胶体颗粒的质量百分比为0.5～2wt％。
优选地，步骤S3中，所述外水相W2与初乳W1/O的体积比为1:0.1～5。
更优选地，所述外水相W2与初乳W1/O的体积比为1:1～2。
更进一步优选地，所述外水相W2与初乳W1/O的体积比为1:1.5。
优选地，步骤S2中，所述高速剪切混合的条件为：转速为10000～15000rpm；剪切时间为2～4min。
优选地，步骤S3中，所述中速剪切混合的条件为：转速为8000～10000rpm；剪切时间为2～4min。
本发明人长期致力于益生菌液态制剂的加工研究，经过大量的研究和探索，得出了上述制备益生菌液态制剂的加工工艺，成功制备得到既可以耐受胃酸和胆盐的作用，又能在肠道更好地定植，从而提高益生菌口服消化稳定性，有利于益生菌在机体内更好地发挥生理活性作用的益生菌液态制剂。
相应地，使用上述的制备方法所制备得到的益生菌液态制剂，也在本发明的保护范围之内。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用皮克林双乳液体系对益生菌进行保护性包埋，在充分保证益生菌制剂益生效果的同时，将益生菌包埋双乳液内水相中，油膜和界面膜使它免受氧气和胃肠道环境的破坏，从而提高益生菌制剂的存储稳定性以及机体消化稳定性，有效解决了产品质量不稳定，有效活菌数不足，产品污染等问题。在消化过程中，界面膜和油相依次经胃、小肠消化从而实现益生菌在肠道中的程序性释放，在双乳液W1相中加入具有辅助肠道粘附作用的肠道辅助释放材料，可以促进益生菌在肠道定植。
本发明制备工艺简单，有效的降低了成本，对于保障益生菌产品安全、延长益生菌产品的货架期有重要意义。
附图说明
图1为包埋益生菌的双乳液样品图。
图2为包埋益生菌的双乳液微观结构图。
图3为包埋益生菌的双乳液CLSM图(油相用尼罗红染料染色，嗜酸乳杆菌用STYO 9染料，激发波长分别是483nm和553nm)。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例所用玻璃器皿、离心管、移液器吸头，以及所使用的悬浮液、溶液均在121℃下灭菌15min。
实施例1 一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂的制备方法
1、一种基于双乳液W1/O/W2结构的益生菌液态制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌悬液的制备：将益生菌嗜酸乳杆菌用MRS肉汤培养基进行活化，在37℃恒温培养箱培养12～18h后，将菌液离心分离，得到菌体，将菌体悬浮于无菌水，得到菌悬液；
(2)内水相W1的制备：以1％醋酸溶液预溶解壳聚糖，得到0.5wt％壳聚糖溶液；用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH值至中性，加入含有9log/mL嗜酸乳杆菌的0.5wt％海藻酸钠溶液，混合后，加入1wt％二价钙离子进行诱导，使之形成凝胶状内水相W1；
(3)油相O的制备：向99mL大豆油中加入1mL聚甘油蓖麻醇酸酯(PGPR)，以500rpm磁力搅拌1～2h，得到1％(w/v)聚甘油蓖麻醇酸酯，即为油相O；
(4)初乳W1/O的制备：将内水相W1与油相O按体积比为1：2.3的比例混合，以10000～15000rpm的转速高速剪切2～4min，得到初乳W1/O；
(5)外水相W2的制备：将0.25g的细菌纤维素加入到50mL的去离子水中，以10000～15000rpm的转速高速剪切20～30min，得到0.5wt％细菌纤维素悬浮液，即为外水相W2；
(6)W1/O/W2型双乳液制剂的制备：将初乳W1/O与外水相W2按体积比为1.5：1的比例混合，以8000～10000rpm的转速中速剪切2～4min，得到双乳液W1/O/W2，即为益生菌液态制剂。
实施例2实施效果
1、方法：
以悬浮于缓冲液中的嗜酸乳杆菌为对照组，包埋在实施例1双乳液W1/O/W2中的嗜酸乳杆菌为实验组。将嗜酸乳杆菌悬浮于不同pH值(pH 1.5、5.7、7.2、9.0)的外水相，以及将包埋在实施例1双乳液W1/O/W2中的嗜酸乳杆菌和不同pH值(pH 1.5、5.7、7.2、9.0)的外水相等比例混合，考察不同pH值对双乳液W1/O/W2中嗜酸乳杆菌的影响。pH值为1.5、9.0的处理组在混合后0、1、2、3h用稀释涂布平板法测定其活菌数，并计算存活率。pH值为5.7、7.2的处理组在混合后0、1、2、3d用稀释涂布平板法测定其活菌数，并计算存活率。
2、结果
表1存储在pH 1.5环境下游离组和包埋组的存活率
Figure BDA0001758511480000061
表2存储在pH 5.7环境下游离组和包埋组的存活率
Figure BDA0001758511480000062
表3存储在pH 7.2环境下游离组和包埋组的存活率
Figure BDA0001758511480000063
Figure BDA0001758511480000071
表4存储在pH 9.0环境下游离组和包埋组的存活率
Figure BDA0001758511480000072
由表1至表4的结果说明，对于菌体自身而言，在pH 5.5～6.0的培养条件下，嗜酸乳杆菌生长最快，活菌数最多。
在强酸强碱(pH 1.5、9.0)的体系中，游离的嗜酸乳杆菌很容易失活，处理1h后活菌数降为0。而包埋在实施例1双乳液W1/O/W2中的嗜酸乳杆菌在处理3h后分别有6.62±0.085、6.37±0.14log CFU/mL，其存活率远远大于游离组。这是因为双乳液W1/O/W2的两膜三相结构隔绝菌体免受酸碱环境的影响。
在pH 5.7、7.2条件处理下，嗜酸乳杆菌在处理3d后对照组分别减少了5.20、5.62log CFU/mL，实验组减少了3.55、3.66log CFU/mL，其存活率存在明显的差异，实验组的存活率远远大于对照组。说明，本发明的益生菌液态制剂能够大大减少益生菌的失活，使其在机体内能更好地发挥生理活性作用。
实施例3 一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂的制备方法
1、一种基于双乳液W1/O/W2结构的益生菌液态制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌悬液的制备：将益生菌长双歧杆菌用MRS肉汤培养基进行活化，在37℃恒温培养箱培养12～18h后，将菌液离心分离，得到菌体，将菌体悬浮于无菌水，得到菌悬液；
(2)内水相W1的制备：以1％醋酸溶液预溶解壳聚糖，得到2wt％壳聚糖溶液；用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH值至中性，加入含有9log/mL长双歧杆菌菌悬液的0.01wt％海藻酸钠，混合后，加入0.01wt％二价钙离子进行诱导，使之形成凝胶状内水相W1；
(3)油相O的制备：向大豆油中加入司班20，以500rpm磁力搅拌1～2h，得到2％(w/v)司班20，即为油相O；
(4)初乳W1/O的制备：将内水相W1与油相O按体积比为1：4的比例混合，以10000～15000rpm的转速高速剪切2～4min，得到初乳W1/O；
(5)外水相W2的制备：将玉米醇溶蛋白加入到去离子水中，以10000～15000rpm的转速高速剪切20～30min，得到2wt％玉米醇溶蛋白悬浮液，即为外水相W2；
(6)W1/O/W2型双乳液制剂的制备：将初乳W1/O与外水相W2按体积比为2：1的比例混合，以8000～10000rpm的转速中速剪切2～4min，得到双乳液W1/O/W2，即为益生菌液态制剂。
实施例4 一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂的制备方法
1、一种基于双乳液W1/O/W2结构的益生菌液态制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌悬液的制备：将益生菌嗜热链球菌用MRS肉汤培养基进行活化，在37℃恒温培养箱培养12～18h后，将菌液离心分离，得到菌体，将菌体悬浮于无菌水，得到菌悬液；
(2)内水相W1的制备：以1％醋酸溶液预溶解聚丙烯酸树脂，得到0.01wt％聚丙烯酸树脂溶液；用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH值至中性，加入含有8log/mL嗜热链球菌菌悬液的2wt％低甲氧基果胶，混合后，加入2wt％二价钙离子溶液进行诱导，使之形成凝胶状内水相W1；
(3)油相O的制备：向大豆油中加入聚甘油蓖麻醇酸酯，以500rpm磁力搅拌1～2h，得到4％(w/v)聚甘油蓖麻醇酸酯，即为油相O；
(4)初乳W1/O的制备：将内水相W1与油相O按体积比为1：5的比例混合，以10000～15000rpm的转速高速剪切2～4min，得到初乳W1/O；
(5)外水相W2的制备：将高粱醇溶蛋白加入到去离子水中，以10000～15000rpm的转速高速剪切20～30min，得到4wt％高粱醇溶蛋白悬浮液，即为外水相W2；
(6)W1/O/W2型双乳液制剂的制备：将初乳W1/O与外水相W2按体积比为5：1的比例混合，以8000～10000rpm的转速中速剪切2～4min，得到双乳液W1/O/W2，即为益生菌液态制剂。
实施例5 一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂的制备方法
1、一种基于双乳液W1/O/W2结构的益生菌液态制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌悬液的制备：将益生菌德式乳杆菌用MRS肉汤培养基进行活化，在37℃恒温培养箱培养12～18h后，将菌液离心分离，得到菌体，将菌体悬浮于无菌水，得到菌悬液；
(2)内水相W1的制备：以1％醋酸溶液预溶解壳聚糖，得到0.01wt％壳聚糖溶液；用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH值至中性，加入含有10log/mL德式乳杆菌菌悬液的0.5wt％低甲氧基果胶，混合后，加入0.01wt％二价钙离子溶液进行诱导，使之形成凝胶状内水相W1；
(3)油相O的制备：向大豆油中加入聚甘油蓖麻醇酸酯，以500rpm磁力搅拌1～2h，得到1％(w/v)聚甘油蓖麻醇酸酯，即为油相O；
(4)初乳W1/O的制备：将内水相W1与油相O按体积比为1：1的比例混合，以10000～15000rpm的转速高速剪切2～4min，得到初乳W1/O；
(5)外水相W2的制备：将微晶纤维素加入到去离子水中，以10000～15000rpm的转速高速剪切20～30min，得到0.5wt％微晶纤维素悬浮液，即为外水相W2；
(6)W1/O/W2型双乳液制剂的制备：将初乳W1/O与外水相W2按体积比为0.1：1的比例混合，以8000～10000rpm的转速中速剪切2～4min，得到双乳液W1/O/W2，即为益生菌液态制剂。
另外，实验发明，实施例1和实施例3～5的益生菌制剂作为液态制剂，在存储和消化之后，负载在双乳液中的益生菌相对于游离的益生菌存活率大大提高，由此双乳液有潜力成为益生菌的保护性递送体系。而且，在消化过程中，实施例1和实施例3～5益生菌制剂的界面膜在胃液中受到酸性环境的破坏释放W/O乳液，而油相经小肠中的脂肪酶消化后，释放出负载益生菌的水凝胶，该水凝胶最终在肠液中崩解释放益生菌，整个过程使得负载益生菌的双乳液程序性释放，从而让益生菌最终在肠道释放达到缓释的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将益生菌菌悬液与增稠剂、肠道辅助释放材料混合后，以二价盐离子诱导形成凝胶状内水相W1；
S2.将油溶性乳化剂溶于食用油形成油相O，将油相O与内水相W1经高速剪切混合，得到油包水型初乳W1/O；
S3.以胶体颗粒的悬浮液为外水相W2，向所述初乳W1/O中加入外水相W2，经中速剪切混合，得到W1/O/W2型双乳液结构的益生菌液态制剂；
其中，所述增稠剂为海藻酸钠或低甲氧基果胶；
所述肠道辅助释放材料为壳聚糖或聚丙烯酸树脂；
步骤S2所述高速剪切混合的条件为：转速为10000～15000rpm；剪切时间为2～4min；
步骤S3所述中速剪切混合的条件为：转速为8000～10000rpm；剪切时间为2～4min；
所述胶体颗粒包括细菌纤维素、玉米醇溶蛋白、高粱醇溶蛋白或微晶纤维素中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述内水相W1中，增稠剂的质量百分比为0.01～2wt％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述内水相W1中，肠道辅助释放材料的质量百分比为0.01～2wt％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述油溶性乳化剂的添加量为油相O的1％～4％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述油相O与内水相W1的体积比为1～5：1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述外水相W2中，胶体颗粒的质量百分比为0.5～4wt％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述外水相W2与初乳W1/O的体积比为1：0.1～5。
8.权利要求1～7任一所述的制备方法所制备得到的益生菌液态制剂。
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