CN114672480A - 植物乳杆菌凝胶珠及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海藻酸钠‑植物乳杆菌‑明胶的水凝胶珠的制备方法，包括以下步骤：1)、制备植物乳杆菌的菌液；2)、以海藻酸钠和明胶作为混合物，将混合物加入至无菌蒸馏水，然后搅拌至混合物溶解；3)、将步骤2)所得溶液置于室温下静置直至不再产生气泡，得ALG‑GE粘性混合液；4)、然后将步骤1)所得的菌液与步骤3)所得的ALG‑P‑GE粘性混合液混合；5)、将步骤4)所得的粘性益生菌悬浮液制备成海藻酸钠‑植物乳杆菌‑明胶水凝胶珠。本发明还同时提供了上述藻酸钠‑植物乳杆菌‑明胶的水凝胶珠在饮料中的应用。
Description
技术领域
本发明应用于饮料领域，该产品赋予饮料更健康的益生菌功效。本发明涉及益生菌凝胶珠的包埋技术，目的保护植物乳杆菌。
背景技术
消费者对健康饮食的意识和兴趣推动了功能性食品的发展。功能性食品具有促进健康益处和降低疾病风险的作用。益生菌是一种细菌，当摄入足够量时，由于肠道菌群的改善，可以给宿主带来健康益处。益生菌的剂量是决定益生菌效果的关键因素。食品每克至少含有107个菌落形成单位(CFU/g)，才能确保有足够的可利用细菌的数量在体内发挥功能作用。如何提高益生菌在胃肠道和食物系统中的存活率是一个科学挑战。作为微生物，益生菌必须在食物运输、储存过程中保持活力，并在胃消化后存活，然后通过足够的数量定植在肠道发挥其有益作用。然而，益生菌对外部环境因素(包括pH、过氧化氢、氧气、温度和储存和运输期间的机械力)和胃肠环境(胃pH、胆汁的存在等)敏感。不同的包埋技术，比如挤压技术、乳化技术、流化床、冷冻干燥、喷雾干燥和静电纺丝等已被开发用来包埋益生菌，以保持益生菌的长期生存能力。其中，挤压技术是一种简单、廉价、细胞活力高的包埋技术。
挤压技术的工作原理是通过喷嘴挤出含有微生物培养物的亲水胶体溶液，然后将其滴入交联剂中，亲水胶体溶液与交联剂接触瞬间转变为凝胶形成凝胶珠。水凝胶具有良好的机械强度和物理稳定性，是挤压技术的理想材料，比如食品加工过程中使用的海藻酸钠和纳米纤维素、乳清或卡拉胶混合物等。
从藻类中提取的海藻酸盐(ALG)是一种线性杂多糖，由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸组成，在钙离子或其他二价离子存在下形成水凝胶，具有无毒、成本低等优点。然而，海藻酸盐易受酸性环境的影响，并受到单价离子螯合剂的影响，使用合适的化合物可以有效地补偿这些限制。明胶(GE)是脊索动物结缔组织中的胶原蛋白的裂解产物。它是一种具有正负电荷、羟基和疏水基团的天然聚电解质。植物乳杆菌(L.plantarum)是一种兼性厌氧菌株，广泛应用于酸奶和饮料中。Yao等人(Microencapsulation of Lactobacillussalivarious Li01 for enhanced storage viability and targeted delivery to gutmicrobiota.Food Hydrocolloids,72,228–236.)用海藻酸钠与明胶包埋唾液杆菌，提高其在储藏期间的活性，并递送到肠道。由海藻酸钠和明胶制备的凝胶珠是益生菌良好的载体，扩大益生菌的应用。
Yao等人(Microencapsulation of Lactobacillus salivarious Li01 forenhanced storage viability and targeted delivery to gut microbiota.FoodHydrocolloids,72,228–236.)用海藻酸钠与明胶包埋唾液杆菌，该方法具体为：唾液杆菌冷冻储备液(0.2mL)接种在MRS液体培养基中(50mL)培养24h。3000rpm 4℃条件下离心10分钟，并由无菌生理盐水清洗两次。最后2mL生理盐水中含有109CFU/mL。将2ml唾液杆菌溶液加入到48ml海藻酸钠-明胶溶液，形成粘稠的益生菌悬浮液。然后通过静电微胶囊装置以9.5mL/min的流速喷洒该悬浮液(喷嘴为300μm)。将其喷入0.1M CaCl2溶液中硬化30min。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种稳定的益生菌凝胶珠胶，从而扩大益生菌的应用领域。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物乳杆菌凝胶珠(海藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠)的制备方法，包括以下步骤：
1)、制备植物乳杆菌的菌液；菌液的细胞浓度为1.0×1010～3.0×1010CFU/mL；
2)、以质量比为2.5～3.5:1的海藻酸钠(ALG)和明胶(GE)作为混合物，按照15～25g/1L的料液比，将混合物加入至无菌蒸馏水，然后搅拌至混合物溶解；
3)、将步骤2)所得溶液置于室温下静置直至不再产生气泡(溶液内部的气泡全部上浮表面后，将其刮除)，得ALG-GE粘性混合液；
说明：步骤2)的搅拌过程中会混入空气，此静置的目的是去除空气。
4)、然后将2.5～3.5mL步骤1)所得的菌液与50mL步骤3)所得的粘性混合液混合；
5)、将步骤4)所得的粘性益生菌悬浮液制备成海藻酸钠-植物乳杆菌-明胶(ALG-P-GE)水凝胶珠。
作为本发明的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠的制备方法的改进，步骤5)为：
将步骤4)所得的悬浮液加入(均匀滴加)至0.1M CaCl2溶液(250mL)中，样品硬化30±5min(即喷入完毕后，搅拌30min)；得海藻酸钠-植物乳杆菌-明胶(ALG-P-GE)水凝胶珠。
说明：悬浮液均匀滴加的时间约为10分钟；悬浮液均匀滴加至CaCl2溶液后，300rpm下搅拌30±5min自动形成颗粒状。
作为本发明的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠的制备方法的进一步改进，所述步骤2)中：
将混合物加入至无菌蒸馏水后，于50±5℃水浴中搅拌30±5min，从而使混合物溶解。
作为本发明的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠的制备方法的进一步改进，步骤2)为：
海藻酸钠(ALG)：明胶(GE)＝3:1的质量比；料液比为20g/1L。
说明：即，海藻酸钠(ALG)和明胶(GE)组成的混合物的总浓度为2％(w/v)。
作为本发明的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠的制备方法的进一步改进：步骤1)植物乳杆菌为益生菌菌株L.plantarum。
作为本发明的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠的制备方法的进一步改进，所述步骤1)为：将冷冻的植物乳杆菌原液(1mL)接种到100mL MRS肉汤培养基中，并在37℃培养箱中培养18h；通过在4℃和8000rpm下离心10min收集细菌细胞；将洗涤后的细胞重新悬浮在10mL无菌生理盐水中，细胞浓度为1.0×1010～3.0×1010CFU/mL。
说明：植物乳杆菌培养18h后，即可实现上述细胞浓度。
本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠在饮料中的应用。
本发明所述的益生菌凝胶珠为挤压法，将益生菌分别与海藻酸钠-明胶(ALG-GE)凝胶、海藻酸钠(ALG)混合。挤压到氯化钙溶液中形成凝胶珠，其中ALG-GE为实验组，ALG为对照组。
然后通过对益生菌的包埋率、电位、储藏稳定、温度稳定性、胃中存活率、肠道中的释放率、以及模拟饮料体系(pH为4.5和6.5)和蔗糖浓度(0、35、50、75％、100％)中益生菌的存货率，评价ALG-GE对益生菌的保护效果。
本发明具有如下技术优势：
(1)采用天然大分子物质ALG和GE来制备益生菌凝胶珠，原料易得，安全绿色无污染；
(2)利用步骤5)的方法来制备凝胶珠，制备方法简单，成本较低；
(3)能明显延长益生菌的贮藏期，提高耐热性质，抵抗胃酸能力同时达到在肠道大量释放的目的。
(4)对制备的益生菌凝胶珠用到模拟饮料体系中既可以保护益生菌的活力，又可以改善饮料的口感。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为植物乳杆菌的特性图；
图1中，A为植物乳杆菌的生长曲线，B为Zeta电位，C和D为不同放大倍数下的SEM图。
图2为凝胶珠的表观形貌图；
图2中，A为ALG，B为ALG-P，C是ALG-GE，D是ALG-P-GE；
每个小图中的左为整体形貌、右为局部形貌。
图3为凝胶珠的SEM形貌图；
图3中，上行为ALG,ALG-P,ALG-GE,ALG-P-GE的整体形貌，下行为ALG,ALG-P,ALG-GE,ALG-P-GE的局部形貌。
图4为凝胶珠的内部植物乳杆菌分布情况；
图4中，A是ALG-P的剖面图，B是ALG-P-G的剖面图。
图5为凝胶珠储藏和耐热性研究，其中上图为6天储藏稳定性研究，下图为不同温度下总的活菌数。
图6为存活率和释放研究；
图6中，A为胃中存活率随时间的变化。B为在肠中释放活菌数研究，C为在肠液中形貌的变化图。
图7为模拟饮料体系的研究，其中A为pH 4.5时益生菌的存活率，B为pH 6.5时益生菌的存活率，C为不同蔗糖浓度下益生菌的存活率。
图8为凝胶珠的一种制备流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明设定植物乳杆菌的分析条件如下：
(1)植物乳杆菌培养
植物乳杆菌L.plantarum(标记为P)购自山东中科嘉亿生物工程有限公司。
植物乳杆菌L.plantarum在含40％甘油的MRS肉汤中，温度为-80℃条件下保藏。为了选择最佳细胞收获时间，测定植物乳杆菌的生长曲线。将1mL的冷冻的植物乳杆菌原液接种至100ml的MRS肉汤中于37℃培养，每隔一小时取培养液测定吸光度，培养时间为24h。在提取200μL样品进行分析之前，通过搅拌使细胞悬浮液均匀。在600nm波长下监测样品的光密度(OD)值。
如图1A所示，随着生长时间的延长，植物乳杆菌的生长速率由缓慢增加到迅速增加，最后趋于稳定。0～6h开始，生长速度非常缓慢为滞后期。6～20h植物乳杆菌的数量迅速增加为对数期。20～24h植物乳杆菌的数量保持稳定为稳定期。对数期菌株具有良好的抗逆性。因此，后续试验均选择18h作为植物乳杆菌的收获时间。
(2)益生菌菌株电位测定
Zeta电位由Nano ZS激光粒度分析仪(英国马尔文)在25℃下测量。Zeta电位样品平行测量三次，取平均值。
(3)植物乳杆菌微观形貌分析
通过日立SU8010扫描电镜(SEM)观察植物乳杆菌的形貌。使用2％戊二醛溶液固定细胞4h，然后使用梯度浓度的乙醇进行脱水，最后使用临界点干燥法进行干燥。图像是在3kV的加速电压下以不同的放大倍数拍摄的。
(4)植物乳杆菌细胞疏水性研究
植物乳杆菌细胞的疏水性通过微生物粘附碳氢化合物(BATH)法测定(Rosenberg，1984)。植物乳杆菌的冷冻储备液(1mL)在100mL MRS肉汤中于37℃下培养18h。使用离心机在4℃下以8000rpm的转速将细菌离心10min，然后用灭菌的0.85％生理盐水清洗两次。将沉淀物细菌再悬浮于无菌生理盐水溶液中，使吸光度(OD600)达到0.62±0.01(A0)。取细菌悬液(3mL)和1mL二甲苯，旋涡振荡2min，然后静置30min。通过测量600nm(A1)处的吸光度来确定益生菌在溶剂中的细胞亲和力。通过方程式(1)计算细胞表面疏水性(Rate ofhydrophobicity)。
A0代表没有添加二甲苯植物乳杆菌的吸光度，A1代表添加二甲苯的植物乳杆菌的吸光度。
植物乳杆菌细胞的疏水性为56.9±0.1％，高于最低疏水性要求(40％)。细胞壁的疏水性取决于细菌表面非极性基团的数量，疏水性越强，益生菌粘附在肠道黏膜上的能力也越大，更容易在肠道黏膜中定植。疏水性的高低是影响益生菌发挥功效的一个重要因素，本发明的植物乳杆菌疏水性较好，可作为一种潜在的益生菌。
实施例1、海藻酸钠-植物乳杆菌-明胶(ALG-P-GE)水凝胶珠的制备方法，如图8所示，包括以下步骤：
1)、将冷冻的植物乳杆菌原液(1mL)接种到100mL MRS肉汤培养基中，并在37℃培养箱中培养18h。然后于4℃、8000rpm下离心10min收集细菌细胞。无菌生理盐水清洗2次，将洗涤后的细胞重新悬浮在10mL无菌生理盐水中，得到植物乳杆菌细胞浓度约为3×1010CFU/mL。
2)、将海藻酸钠(ALG)和明胶(GE)以3:1的质量比混合(搅拌混合)作为混合物，按照20g/1L的料液比，将混合物加入至无菌蒸馏水中；然后在50～52℃水浴中搅拌30min，以确保混合物(ALG、GE)完全溶解；
因此，海藻酸钠(ALG)和明胶(GE)组成的混合物的总浓度为2％(w/v)；
3)、将步骤2)所得溶液置于25℃下冷却30min，放置过程中去除浮在表面的气泡；30分钟后不再有气泡产生；形成粘稠混合液；
4)、将3mL步骤1)所得的菌液与50mL步骤3)所得的ALG-GE粘稠混合液搅拌混合30min，形成粘性益生菌悬浮液。
5)、悬浮液通过注射器(体积50mL，内径2cm)滴入至处于搅拌过程的0.1M CaCl2溶液(250mL)中，悬浮液的滴加时间约为10分钟。样品保持硬化30min(即悬浮液滴加完毕后，搅拌30min)；再抽滤2次(每次定性滤纸抽滤1min)，得海藻酸钠-植物乳杆菌-明胶(ALG-P-GE)水凝胶珠。
搅拌的转速为300rpm。
对比例1、海藻酸钠-植物乳杆菌(ALG-P)水凝胶珠的制备方法：
将实施例1的步骤2)改为：
将海藻酸钠2％(w/v，即20g/1L)加入至无菌蒸馏水中；然后在50℃水浴中搅拌30min，以确保ALG完全溶解；
其余等同于实施例1。
因此，
步骤3)所得命名为ALG粘稠混合液；
步骤4)所得的益生菌悬浮液，命名为ALG-P。
步骤5)最终所得为：海藻酸钠-植物乳杆菌(ALG-P)水凝胶珠。
将上述实施例1所得的海藻酸钠-植物乳杆菌-明胶(ALG-P-GE)水凝胶珠，以及对比例1所得的海藻酸钠-植物乳杆菌(ALG-P)水凝胶珠，分别进行以下实验：
实验1、植物乳杆菌的包封率
通过将2.0g水凝胶珠溶解于18.0mL 10％柠檬酸钠溶液中，转速100rpm搅拌40min，直到植物乳杆菌完全释放，测量ALG-P和ALG-P-GE水凝胶珠中植物乳杆菌。通过梯度稀释法将溶解的混合物(1mL)稀释至10-5。在37℃下在MRS琼脂上培养48h后，计算植物乳杆菌的数量。根据方程式(2)计算封装效率(EE)(Maleki,Khaledabad,Amiri,Asl,&Makouie,2020).
EE为包封效率(％)，N为从胶囊中释放的活细胞数(Log CFU/mL)，N0为用于包埋的初始活细胞数(Log CFU/mL)。
2种水凝胶珠的所得结果分别为：如表1所示，ALG-P-GE包埋率为97.7％，ALG-P包埋率为97.1％。因此，可得知：ALG与ALG-GE包埋效果接近。从图2中可以看出，ALG,ALG-GE呈现透明球形。而添加了植物乳杆菌之后，ALG-P,ALG-P-GE呈现乳白色球形。
表1、ALG,ALG-P,ALG-GE和ALG-P-GE凝胶珠的物理特性.
实验2、Zeta电位分析
Zeta电位由Nano ZS激光粒度分析仪(英国马尔文)测定。将ALG和ALG-GE(约1mL)放入测量室并测量之前进行涡旋。
如表1所示ALG和ALG-GE的Zeta分别为-9.49和-16.81mV。因此，可得知：与ALG相比，ALG-GE的电负性更强，说明ALG-GE较稳定。
实验3、扫描电子显微镜(SEM)观察
水凝胶珠在-20℃下预冷冻24h，然后冷冻干燥。样品固定在胶粘板上并涂上金。凝胶珠的整体形貌如图3所示。为了更清楚地观察珠子的剖视图，将胶囊切开并观察如图4所示。
如图3所示ALG-GE和ALG-P-GE凝胶珠保持饱满的蛋壳形状，而ALG和ALG-P表面收缩起皱。因此，可得知：ALG-GE的蛋壳状保护内部结构不与空气直接接触，这有利于植物乳杆菌的保护。
图4中ALG-P-GE的剖视图比ALG-P更平滑，这可能归因于ALG和GE之间的相互作用，形成致密的结构。
实验4、硬度和直径的测量
使用TA测量水凝胶珠的硬度。XT Plus纹理分析仪，配备圆筒测量探头(SMS P/36R)。以40mm/min的速度将水凝胶珠压缩至其原始高度的25％。珠子的直径是用钢尺计算的。
结果如表1所示，ALG,ALG-P,ALG-GE和ALG-P-GE四种水凝胶凝胶珠的硬度分别是：42.08，32.27，36.57和33.55g。因此，可获得以下总结性结论：与ALG和ALG-GE相比，ALG-P和ALG-P-GE的硬度分别降低了30.4％和9.0％。细胞加入后凝胶珠的硬度降低，说明凝胶珠的抗爆裂能力提高。据推测，L.plantarum和明胶对Ca2+的亲和力较低，这削弱了钙离子与凝胶交联的能力
实验5、6天储存和热处理后活菌的计数
L.plantarum,ALG-P和ALG-P-GE在4℃下储存6天。L.plantarum(1mL)分别在0、2、4和6天的时间取出，测量其中的活菌数，方法参照实验1中活菌数的计算方法。
通过分别在37、45、50、55和60℃下加热L.plantarum和ALG-P和ALG-P-GE5min，确定封装对L.plantarum细胞耐热性的影响。将密封的小瓶在冰水浴中冷却10min，进行活菌计数。
2种水凝胶珠的所得结果分别为：保存6d后，L.plantarum活细胞数量显著下降102.1CFU/mL。ALG-P和ALG-P-GE样品在贮存6d后，细胞活力分别下降101.5CFU/mL和101.4CFU/mL。因此，可得知：ALG-P-GE中存活的植物乳杆菌数量高于ALG-P。因此，相比较ALG-P，ALG-P-GE对贮藏期间植物乳杆菌具有较好的保护作用。
如图5所示：植物乳杆菌对温度敏感，ALG-P和ALG-P-GE的耐热性显著提高。在50℃热处理5min后，可以观察到植物乳杆菌下降105.7CFU/mL，ALG-P下降100.8CFU/mL。值得注意的ALG-P-GE中仅下降了100.2CFU/mL。因此，ALG-P-GE对植物乳杆菌的热保护效果最好。这可能是由于组成中存在明胶。由于明胶的缓冲能力改善了水凝胶珠的化学稳定性。
实验6、益生菌在模拟胃液中的存活率
测定了凝胶珠植物乳杆菌对模拟胃液(SGF)的体外抗性。通过将3g胃蛋白酶溶解于1000mL无菌水中制备SGF，并通过1M HCl将pH调节至2.0。将ALG-P和ALG-P-GE水凝胶珠(2g)添加到18mL SGF中，然后在37℃和100rpm转速模拟胃肠蠕动。在0、10、20、30、40min对活的植物乳杆菌进行评估。使用以下方程式(3)计算存活率(Survival rate，％)。
N是处理后的细胞数(Log CFU/g)，N0是处理前的细胞数(Log CFU/g)。
2种水凝胶珠的所得结果分别为：如图6A所示，随着在模拟胃液时间的延长，植物乳杆菌存活率呈下降趋势，ALG-P和ALG-P-GE样品的存活率分别达到97.2％和97.8％。因此，可得知：ALG-GE作为壁材提供物理屏障，具有较好的防护效果。与ALG相比，ALG-GE中形成的生物聚合物网络对分子扩散的阻滞作用更强。
实验7、益生菌在模拟肠液中的体外释放
在模拟肠液(SIF)中研究植物乳杆菌细胞从ALG和ALG-GE中的释放。使用6.8g/LKH2PO4、10g/L胰蛋白酶和1g/L胆盐(胆酸钠:脱氧胆酸钠＝1:1，w/w)制备SIF，并使用5MNaOH将pH调节至7.0。将ALG-P和ALG-P-GE水凝胶珠(2g)添加到18mL SIF中，然后在37℃和100rpm转速模拟肠蠕动。分别在1、2、3、4h测量一次释放的活细菌数。每小时用相机(日本东京尼康公司尼康DS5100)记录珠子的形态。
2种水凝胶珠的所得结果分别为：如图6B所示，在第一个小时内，植物乳杆菌细胞从ALG-P和ALG-P-GE水凝胶珠中快速释放。在接下来的两小时内，细胞的释放趋势变得缓慢。消化结束时，ALG-P和ALG-P-GE释放的细胞均高于109CFU/mL，表明大多数植物乳杆菌细胞在肠道消化过程中释放。因此，ALG-P和ALG-P-GE可以在SIF中实现植物乳杆菌细胞的快速释放。从图6C可以看出，2种水凝胶珠在SIF可以观察到形态的显著变化。在一个小时消化结束后，2种水凝胶珠形貌没有发生明显变化。在两小时后ALG-P和ALG-P-GE水凝胶珠膨胀并分解成许多小碎片。这可能是因为ALG-P和ALG-P-GE中的羧基在中性SIF中脱质子，分子间氢键减少，导致水凝胶珠溶解。
实验8、酸性溶液和糖溶液中存活率的评估
选择酸性溶液(pH为4.5和6.5)和不同含糖量的溶液(0％、35％、50％和75％，w/v)来模拟饮料系统，并检测水凝胶珠中的植物乳杆菌益生菌的存活率。以游离细胞作为对照样品。将水凝胶珠2g添加到含有pH为4.5或6.5液体(18mL)的试管中。每20min用平板计数法评估包埋益生菌的存活率，整个试验持续120min。存活率依据公式(3)计算。
构建了不同蔗糖浓度(0、35、50和75％，w/w)的糖溶液，以模拟不同的饮料系统。水凝胶珠在这些糖溶液中浸泡2h后，通过平板计数法评估胶囊化益生菌的存活率。存活率依据公式(3)计算。
2种水凝胶珠的所得结果：如图7A在pH 4.5下浸泡120min后，植物乳杆菌的存活数下降至9.29Log CFU。ALG-P和ALG-P-GE水凝胶珠在pH 4.5下浸泡120min后益生菌的存活数分别为10.31Log CFU和10.58Log CFU。很明显，ALG-P和ALG-P-GE水凝胶珠中植物乳杆菌活力高于游离的植物乳杆菌。图7B在pH值为6.5的溶液中也观察到类似现象。因此，ALG-P和ALG-P-GE可以保护益生菌不与酸性介质直接接触，并提高益生菌的活力。
图7C显示了ALG-P和ALG-P-GE凝胶珠在不同蔗糖浓度(0、35％、50％和75％)下的存活情况。当蔗糖浓度增加时，存活率略有下降，这是由于渗透压对细胞造成的应激所致。浸泡2h后，ALG-P和ALG-P-GE中益生菌的存活率仍然很高(超过95％)。因此，这些凝胶珠仍然适合在高蔗糖浓度的饮料中使用。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (8)
1.海藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、制备植物乳杆菌的菌液；菌液细胞浓度为1.0×1010～3.0×1010CFU/mL；
2)、以质量比为2.5～3.5:1的海藻酸钠和明胶作为混合物，按照15～25g/1L的料液比，将混合物加入至无菌蒸馏水，然后搅拌至混合物溶解；
3)、将步骤2)所得溶液置于室温下静置直至不再产生气泡，得ALG-GE粘性混合液；
4)、然后将2.5～3.5mL步骤1)所得的菌液与50mL步骤3)所得的粘性混合液混合；
5)、将步骤4)所得的粘性益生菌悬浮液制备成海藻酸钠-植物乳杆菌-明胶水凝胶珠。
2.根据权利要求1所述的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠的制备方法，其特征在于所述步骤5)为：
将步骤4)所得的悬浮液加入至0.1M CaCl2溶液250mL中，样品硬化30±5min，抽滤；得海藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠。
3.根据权利要求2所述的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠的制备方法，其特征在于所述步骤2)中：
将混合物加入至无菌蒸馏水后，于50±5℃水浴中搅拌30±5min，从而使混合物溶解。
4.根据权利要求3所述的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠的制备方法，其特征在于所述步骤2)为：
海藻酸钠：明胶＝3:1的质量比；料液比为20g/1L。
5.根据权利要求1～4任一所述的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠的制备方法，其特征在于：所述步骤1)植物乳杆菌为益生菌菌株L.plantarum。
6.根据权利要求5所述的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠的制备方法，其特征在于：所述步骤1)为：将冷冻的植物乳杆菌原液接种到MRS肉汤培养基中，并在37℃培养箱中培养18h；通过在4℃和8000rpm下离心10min收集细菌细胞；将洗涤后的细胞重新悬浮至无菌生理盐水中，控制细胞浓度为1.0×1010～3.0×1010CFU/mL。
7.如权利要求1～6任一方法制备而得的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠。
8.如权利要求7所得的藻酸钠-植物乳杆菌-明胶的水凝胶珠在饮料中的应用。
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