CN109554360A - 一种利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法 - Google Patents

一种利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，包括：配制培养基，灭菌，接入活化后的木醋杆菌或红茶菌，静态培养；清洗细菌纤维素膜，将洗净的膜搅碎制备细菌纤维素匀浆液；将海藻酸钠溶液与细菌纤维素匀浆液按照重量比2：1‑200:1混合，加入1％～2％琼脂、0.6％～2.0％壳聚糖、0.3％～0.5％明胶、2％～3％卡拉胶以及1％～3％黄原胶等其中的一种或几种，得到海藻酸钠复合材料溶液；称取氯化钙粉末配制成1.5％～4.5％(w/v)的氯化钙溶液；步骤4：称取活性干酵母粉与生理盐水配成30wt％～60wt％的菌悬液，将海藻酸钠复合材料溶液与菌悬液按照重量比90：10～95：5混合，取此悬液逐滴滴入到氯化钙溶液中固定化酵母细胞。本发明能很好的支持细胞的繁殖增长，其次孔隙率高，有利于生物催化及产物的分离。

Description

一种利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，特别是涉及一种利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，可用于对于菌体本身有毒底物或有害产物的生物转化或是高价值的天然香料生产亦或是环境治理等。
背景技术
固定化细胞的方法应用于发酵工业可以达到反复利用，连续操作，节约成本以及简化产物分离纯化等优点。目前常用的固定化方法为吸附法、共价结合法、包埋法，交联法四大类。包埋法比其他方法具有较好的优势。而海藻酸钠-氯化钙包埋是一种常见包埋方法，海藻酸钠(sodium alginate，AL)是一类天然高分子多糖类,对微生物无毒害作用，且此方法简单又条件温和。过高海藻酸钠的浓度会影响固定化细胞的机械强度、传质效率；其次现有的海藻酸钙凝胶球制成的固定化酵母在含多价阴离子(磷酸盐，柠檬酸盐，硫酸盐等)或较高溶度的电解质溶液中以及随着菌体的繁殖易变软，甚至溶解；细菌纤维素(bacterial cellulose，BC)是一种主要由细菌发酵生成的网状多孔纳米级的高分子聚合物，由β－D－葡萄糖通过β－1，4－糖苷键连接成的直链分子，也被称为β－1，4－葡聚糖。BC具有独特的三维网状结构和大量的孔隙，具有高亲水性、高机械性能、高化学稳定性和热稳定性，可以和其他材料结合，为复合材料提供高纯度、高生物相容性、高机械强度、高持水性、高透气性的载体，是良好的细胞和酶固定化载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的新方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一种利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，包括：
步骤1：配制培养基，灭菌，接入活化后的木醋杆菌或红茶菌，静态培养5～10天；
步骤2：用1～2％的NaOH溶液清洗步骤1所得的细菌纤维素膜，用0.5～1％的乙酸浸泡0.5-1h，用蒸馏水清洗，将洗净的膜搅碎制备细菌纤维素匀浆液；
步骤3：配制重量比为2％～4％海藻酸钠溶液，将海藻酸钠溶液与细菌纤维素匀浆液按照重量比1:2-200:1混合，得到海藻酸钠复合材料溶液，称取氯化钙粉末配制成1.5％～4.5％(w/v)的氯化钙溶液；
步骤4：称取活性干酵母粉与生理盐水配成质量浓度为30％～60％的菌悬液，将海藻酸钠复合材料溶液与菌悬液按照重量比90：10～95：5混合，取此悬液逐滴滴入到氯化钙溶液中固定化酵母细胞。
进一步地，所述的步骤1中的培养为25℃～30℃恒温生化培养箱培养。
进一步地，所述的木醋杆菌或红茶菌为筛选的具有高活性木醋杆菌以及红茶菌。
进一步地，所述的步骤1中木醋杆菌的培养基含有葡萄糖或甘露醇2％～6％，胰蛋白胨0.1％～1.0％，酵母提取物0.1％～5％,pH值为3～7。
进一步地，所述的步骤1中的红茶菌的培养基含有白砂糖2％～20％，绿茶提取物1％～10％，胰蛋白胨0％～10％，酵母提取物0％～5％和无机盐0％～5％。
进一步地，所述的用1～2％的NaOH溶液清洗步骤1所得的细菌纤维素膜的具体步骤包括：在1～2％的NaOH溶液中80℃水浴或者煮沸细菌纤维素膜至透明。进一步地，所述步骤2中的“将洗净的膜搅碎制备细菌纤维素匀浆液”的具体步骤包括：将洗净的细菌纤维素膜用料理机打碎，用100～300目滤布过滤，得到细菌纤维素匀浆液。
进一步地，所述的步骤3中配制海藻酸钠溶液时用60～80℃水浴搅拌溶解。
进一步地，所述步骤3中的海藻酸钠溶液中含有1％～2％琼脂、0.6％～2.0％壳聚糖、0.3％～0.5％明胶、2％～3％卡拉胶以及1％～3％黄原胶中的至少一种。
更进一步地，所述的步骤3包括：配制质量比为2％～4％海藻酸钠溶液，将海藻酸钠溶液与细菌纤维素匀浆液按照重量比1:2-200:1混合，加入重量比为1％～2％琼脂、0.6％～2.0％壳聚糖、0.3％～0.5％明胶、2％～3％卡拉胶以及1％～3％黄原胶等其中的一种，得到海藻酸钠复合材料溶液，称取氯化钙粉末配制成1.5％～4.5％(w/v)的氯化钙溶液。
更进一步地，所述的壳聚糖分子量为1.95×104～6.00×104。
进一步地，所述的活性干酵母粉为酿酒活性干酵母粉或是面包活性干酵母粉或是经从斜面活化后培养至生长对数期后期的菌体。
进一步地，所述的步骤4中称取活性干酵母粉与生理盐水配成质量浓度为30％～60％的菌悬液后，旋涡震荡10min。
进一步地，所述的固定化的时间为1～3h。固定化时间根据菌体要求，可为25℃～30℃，形成直径为1～2mm的固定化小球。
进一步地，所述的利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法还包括：将所得固定化酵母细胞进行清洗，4℃保藏或使用。
更进一步地，所述的清洗为无菌生理盐水洗涤3次。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以海藻酸钠和琼脂、壳聚糖、明胶、卡拉胶、黄原胶和细菌纤维素膜为载体，采用海藻酸钠复合物凝胶包埋，进行AL-琼脂-BC，AL-壳聚糖-BC，AL-BC等互为填充的复合材料包埋，通过SEM扫描电镜发现AL-BC复合载体表面与生物细胞界面上有较好的相容性，表明此材料表面有利于细胞粘附，能很好的支持细胞的繁殖增长，其次孔隙率高，有利于生物催化及产物的分离。
本发明以海藻酸钠与琼脂、壳聚糖、明胶、卡拉胶、黄原胶和细菌纤维素膜为原料制备复合固定化载体，其机械强度比单独用海藻酸钠更高，孔隙率更大，菌体细胞不仅能被固定在材料内，还能保持较高的生物活性，提高后期产物分离的效率。本发明可用于对于菌体代谢产物的提取分离及可重复循环利用的生物反应器的制备。
本发明采用的海藻酸钠和琼脂、壳聚糖、明胶、卡拉胶、黄原胶和细菌纤维素膜为载体皆是天然多糖化合物，或为天然纳米材料，具有高纯度、高生物相容性，易被微生物分解，对生物和环境都很安全。载体材料的孔隙密集，且能很好的支持细胞的繁殖增长形成细胞桥，有利于生物催化。
本发明得到的固定化菌体可用于生物催化。本发明制备得到基于海藻酸钠复合材料的固定化菌体可以多次使用。
附图说明
图1是实施例1中的实施方法获得的复合载体固定化酵母电镜图；
图2是实施例1中的实施例方法获得的固定化细胞循环转化5次细胞活性变化；
图3是实施例1-3中的实施例方法转化一次细胞活性比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明所用的各原料、试剂均为市售产品。
实施例1
一种利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，具体步骤为：
1)培养木醋杆菌生产细菌纤维素：
a)菌体的活化
配制固体斜面培养基：分别称取4g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨，2g琼脂，加入100mL蒸馏水配制成含葡萄糖4wt％，酵母膏0.5wt％,蛋白胨0.5wt％，琼脂2wt％的固体培养基，用柠檬酸调pH至5.0,121℃灭菌20min；120℃灭菌20min；
将斜面木醋杆菌(ATCC23770)转接在多个固体斜面培养基上，28℃培养5d，得到活化的木醋杆菌，放置4℃冰箱内保存，以备使用。
b)种子液的制备
配制液体种子培养基:分别称取1g葡萄糖、0.125g酵母膏、0.125g蛋白胨加入25mL蒸馏水配制成含葡萄糖4wt％，酵母膏0.5wt％,蛋白胨0.5wt％的液体种子培养基，用柠檬酸调pH至5.0,121℃灭菌20min；
将活化后的木醋杆菌按转接至上述液体种子培养基中，30℃，120r/min下振荡培养24h，得到木醋杆菌的种子培养基。
c)静态发酵
配制液体发酵培养基:分别称取3.75g甘露醇、0.45g酵母膏、0.75g蛋白胨加入150mL蒸馏水配制成含甘露醇2.5wt％，酵母膏0.3wt％,蛋白胨0.5wt％的液体发酵培养基；柠檬酸调pH至5.0,121℃灭菌20min。
将上述种子培养基中的菌体，按6％(V/V)接于150mL液体发酵培养基中(避免接入纤维丝)30℃恒温生化培养箱静态培养7天。
2)细菌纤维素膜的清洗
将所得的细菌纤维素膜浸泡在1wt％的NaOH溶液中煮沸1h至膜成透明状态，取出用0.5wt％的乙酸浸泡0.5h中和，用蒸馏水反复清洗至中性。将洗净的膜用料理机搅碎制备细菌纤维素匀浆液，用200目滤布滤去部分水分，至浆液仍能流动，但静置5min表面无明显水层界面。
3)固定化凝胶球的制备
配制2wt％、3wt％、4wt％的海藻酸钠溶液，用80℃水浴搅拌溶解，与上述细菌纤维素膜浆液(BC浆液)分别按质量比为2:1、3:1、4:1的比例混合，得到海藻酸钠复合材料溶液，称取0.75g、1.5g、2.25g氯化钙粉末溶于50mL水中配制成1.5％、3.0％、4.5％(w/v)的氯化钙溶液，121℃，灭菌15min。
4)称取3g高活性酿酒酵母干粉(广西丹宝利酵母有限公司)与生理盐水配成30wt％的菌悬液，旋涡震荡10min分散细胞。取海藻酸钠复合材料溶液与菌悬液按照质量比为9:1混合，用无菌注射器吸取10g此悬液分别逐滴滴入到1.5wt％、3.0wt％、4.5wt％氯化钙溶液中，静置固定化酵母细胞2小时，固定化温度为28℃，形成直径为1～2mm的固定化小球。无菌蒸馏水洗涤3次，得到固定化酵母细胞，投入含30mL的转化培养基(转化培养基组成：K2HPO4 7g/L，MgSO4·7H2O 7g/L，甘油10g/L，肉碱0.1g/L，CaCl2 1g/L)，转速为250rpm，设定30℃转化48h。检测固定化细胞的生物活性(以产物生成量表示，以游离细胞生物活性为对照)，转化完成后，将发酵液过滤出来，气相检测GDL含量，固定化酵母无菌蒸馏水洗净投入新的培养基进行新的一轮转化，如此循环转化5次，得到总的GDL产量。
参照表1，当海藻酸钠的溶度为2％时，与BC浆液的配比为3:1，滴入3％的氯化钙中的固定化酵母的γ-癸内酯的产率效果最好，产量比对照组的产量高36.3％；当海藻酸钠的溶度为3％时，与BC浆液的配比为3:1，滴入4.5％的氯化钙中的固定化酵母的γ-癸内酯的产率效果最好，产量比对照组的产量高34.64％；当海藻酸钠的溶度为4％时，与BC浆液的配比为2:1，滴入3％的氯化钙中的固定化酵母的γ-癸内酯的产率效果最好，产量比对照组的产量高43.24％。总体分析可知，4％的海藻酸钠，3:1的海藻酸钠与BC膜浆液配比，滴入3％的氯化钙中形成固定化酵母生产γ-癸内酯的效果较好。
由图1复合载体的SME图可知；此复合载体能较好的支持细胞生长，由图2可知，各固定化组循环使用5次GDL总产量结果。
表1是实施例1中的实施方法进行了固定化酵母细胞转化蓖麻油酸生成γ-癸内酯的生物转化试验获得的固定化细胞活性的分析表。
表1
实施例2
重复实施例1中步骤1)和2)。
配制3％的海藻酸钠和2％的卡拉胶复合溶液，121℃，灭菌15min。与上述细菌纤维素膜浆液(BC浆液)按重量比50:1的比例混合，得到海藻酸钠复合材料溶液。称取1.5g氯化钙粉末溶于50mL水中配制成3.0％(w/v)的氯化钙溶液；称取高活性酿酒酵母干粉(广西丹宝利酵母有限公司)与生理盐水配成30％的菌悬液，旋涡震荡10min分散细胞。取海藻酸钠复合材料溶液与菌悬液按质量比为90:10混合，用无菌注射器吸取10g此悬液逐滴滴入到3.0％的氯化钙溶液中，静置固定化酵母细胞2小时。无菌蒸馏水洗涤3次，得到固定化酵母细胞，投入含30mL的转化培养基(同实施例1)中，转速为250rpm，设定30℃转化48h。检测固定化细胞的生物活性(以产物生成量表示，以游离细胞生物活性为对照)，转化完成后，将发酵液过滤出来，气相检测GDL含量。
实施例3
重复实施例1中步骤1)和2)。
配制3％的海藻酸钠和2％的壳聚糖(壳聚糖分子量为1.95×104～6.00×104)复合溶液，121℃，灭菌15min。与上述细菌纤维素膜浆液(BC浆液)按重量比100：1的比例混合，得到海藻酸钠复合材料溶液。称取1.5g氯化钙粉末溶于50mL水中配制成3.0％(w/v)的氯化钙溶液；称取高活性酿酒酵母干粉(广西丹宝利酵母有限公司)与生理盐水配成30％的菌悬液，旋涡震荡10min分散细胞。取海藻酸钠复合材料溶液与菌悬液按质量比为90:10混合，用无菌注射器吸取10g此悬液逐滴滴入到3.0％的氯化钙溶液中，静置固定化酵母细胞2小时。无菌蒸馏水洗涤3次，得到固定化酵母细胞，投入含30mL的转化培养基(同实施例1)中，转速为250rpm，设定30℃转化48h。检测固定化细胞的生物活性(以产物生成量表示，以游离细胞生物活性为对照)，转化完成后，将发酵液过滤出来，气相检测GDL含量。
如图3所示，是实施例1-3中的实施例方法转化一次细胞活性比较，实施例1(实验组4)(方法一)中转化48h后得到γ-癸内酯含量为2.86g/L，比游离酵母高出28.4％；实施例2(方法二)方法二中得到γ-癸内酯含量为1.81g/L，比游离酵母低19.5％；实施例3(方法三)中得到γ-癸内酯含量为1.73g/L，比游离酵母高出23.1％。

Claims (10)

1.一种利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，包括：
步骤1：配制培养基，灭菌，接入活化后的木醋杆菌或红茶菌，静态培养5～10天；
步骤2：用1～2％的NaOH溶液清洗步骤1所得的细菌纤维素膜，用0.5～1％的乙酸浸泡0.5-1h，用蒸馏水清洗，将洗净的膜搅碎制备细菌纤维素匀浆液；
步骤3：配制2％～4％海藻酸钠溶液，将海藻酸钠溶液与细菌纤维素匀浆液按照重量比1:2-200:1混合，得到海藻酸钠复合材料溶液，称取氯化钙粉末配制成1.5％～4.5％(w/v)的氯化钙溶液；
步骤4：称取活性干酵母粉与生理盐水配成质量浓度为30％～60％的菌悬液，将海藻酸钠复合材料溶液与菌悬液按照重量比90：10～95：5混合，取此悬液逐滴滴入到氯化钙溶液中固定化酵母细胞。
2.如权利要求1所述的利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，所述的步骤1中的培养为25℃～30℃恒温生化培养箱培养。
3.如权利要求1所述的利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，所述的用1～2％的NaOH溶液清洗步骤1所得的细菌纤维素膜的具体步骤包括：在1～2％的NaOH溶液中80℃水浴或者煮沸细菌纤维素膜至透明。
4.如权利要求1所述的利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，所述步骤2中的“将洗净的膜搅碎制备细菌纤维素匀浆液”的具体步骤包括：将洗净的细菌纤维素膜用料理机打碎，用100～300目滤布过滤，得到细菌纤维素匀浆液。
5.如权利要求1所述的利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，所述步骤3中的海藻酸钠溶液中含有1％～2％琼脂、0.6％～2.0％壳聚糖、0.3％～0.5％明胶、2％～3％卡拉胶以及1％～3％黄原胶中的至少一种。
6.如权利要求1所述的利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，所述的壳聚糖分子量为1.95×104～6.00×104。
7.如权利要求1所述的利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，所述的活性干酵母粉为酿酒活性干酵母粉或是面包活性干酵母粉或是经从斜面活化后培养至生长对数期后期的菌体。
8.如权利要求1所述的利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，所述的步骤4中称取活性干酵母粉与生理盐水配成质量浓度为30％～60％的菌悬液后，旋涡震荡10min。
9.如权利要求1所述的利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，所述的固定化的时间为1～3h。
10.如权利要求1所述的利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法，其特征在于，所述的利用海藻酸钠复合材料包埋菌体的方法还包括：将所得固定化酵母细胞进行清洗，4℃保藏或使用。
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