CN104894096B - 一种利用细菌纤维素膜固定化丙酮丁醇梭菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用细菌纤维素膜固定化丙酮丁醇梭菌的方法,该方法包括如下步骤:(1)细菌纤维素膜的疏水改性:用酸处理细菌纤维素膜,清洗,干燥,得到细菌纤维素膜A;再用碱处理细菌纤维素膜A,清洗,干燥,得到细菌纤维素膜B;通过对细菌纤维素膜B表面进行乙酰化、酯化、硅烷偶联、高分子修饰或有机膦偶联的处理,制备得到改性的细菌纤维素膜;(2)改性的细菌纤维素膜固定化梭菌:将步骤(1)得到的改性的细菌纤维素膜固定在连续发酵罐内,通入丙酮丁醇梭菌菌悬液,自循环培养,使丙酮丁醇梭菌吸附在细菌纤维素膜上,得到固定化在细菌纤维素膜上的丙酮丁醇梭菌。本发明疏水改性后固定化梭菌,用于连续发酵,提高生产效率,降低成本。
Description
技术领域
本发明属于固定化细胞连续发酵领域,具体涉及一种以改性后细菌纤维素膜为载体固定化梭菌的方法。
背景技术
梭菌属微生物中,丙酮丁醇梭菌常用于发酵生产丁醇,但传统的游离发酵,生产周期长,效率低,不能长期连续发酵,产物与菌体难以分离。固定化细胞可以克服以上问题,实现连续批次发酵,提高生产效率,降低成本。
细菌纤维素具有独特的超细网状纤维结构,该材料具有高比表面积,含有大量孔隙结构,有利于细胞吸附和固定。然而细菌纤维素结构单一,高亲水性,不利于菌体的吸附,热稳定性以及机械稳定性能差影响其作为固定化材料的稳定性。由于细菌纤维素全部由葡萄糖苷键和氢键连接而成,化学结构分子式中含有大量的羟基基团,易于改性和表面修饰,将其与其它原子团或分子组合制成更高性能的物质,在固定化材料方面,将具有良好的发展潜力和应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,提供一种对细菌纤维素膜进行改性的方法,将该方法得到的细菌纤维素膜作为梭菌的固定化载体,固定化后的梭菌发酵性能提高,能够连续批次发酵。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
一种利用细菌纤维素膜固定化丙酮丁醇梭菌的方法,该方法包括如下步骤:
(1)细菌纤维素膜的疏水改性:用酸处理细菌纤维素干膜,清洗,干燥,得到细菌纤维素膜A;再用碱处理细菌纤维素膜A,清洗,干燥,得到细菌纤维素膜B;对细菌纤维素膜B表面进行乙酰化修饰、酯化修饰、硅烷偶联剂修饰、高分子聚合物修饰或有机膦偶联剂修饰,制备得到改性的细菌纤维素膜;优选利用乙酰化修饰、硅烷偶联剂修饰或硅烷偶联剂修饰;最优选硅烷偶联剂修饰。
(2)改性的细菌纤维素膜固定化梭菌:将步骤(1)得到的改性的细菌纤维素膜固定在连续发酵罐内,通入丙酮丁醇梭菌菌悬液,自循环培养,得到固定化了丙酮丁醇梭菌的细菌纤维素膜。
只要是能产丁醇的丙酮丁醇梭菌都能作为本发明中改性细菌纤维素膜的固定化对象,优选的丙酮丁醇梭菌为Clostridium acetobutylicum B3(CGMCC No.5234)。
所述的自循环培养,其培养条件为:35~40℃,30~40rpm/min,由下自上循环,优选:37℃,30rpm/min。
步骤(1)中,所述的细菌纤维素干膜,通过发酵制备得到,所述的发酵包括如下步骤:
(1a)将木醋杆菌接种到斜面培养基上培养,在30℃条件下培养24h,得到一级种子;
(2a)将步骤(1a)得到的一级种子转接至种子培养基中,30℃条件下培养18~24h,优选培养18h,转速为150rpm,得到二级种子液;
(3a)将步骤(2)得到的二级种子液转接到发酵培养基中,30℃条件下静置培养72h,形成细菌纤维素膜,收集发酵液中的细菌纤维素膜,用水冲洗,将其在碱液中浸泡,再次冲洗使其pH为中性,然后干燥处理,制备得到细菌纤维素干膜,所述的干燥处理是冷冻干燥,冷冻干燥的条件为:-20℃,24h。
只要能产细菌纤维素的木醋杆菌都能用上述方法产细菌纤维素,优选的木醋杆菌为ATCC 23769
步骤(1a)中,所述的斜面培养基,其配方为:葡萄糖80~120g/L,酵母粉8~12g/L,碳酸钙15~25g/L,琼脂15~20g/L,pH=6.4~7.0,溶剂为水;斜面培养基的配方优选为:葡萄糖100g/L,酵母粉10g/L,碳酸钙20g/L,琼脂15g/L,pH=6.8,溶剂为水;
步骤(2a)中,所述的种子培养基,其配方为:葡萄糖18~20g/L,蛋白胨8~10g/L,酵母粉4~6g/L,磷酸氢二钠2.5~3g/L,柠檬酸1~1.5g/L,硫酸镁0.2~0.3g/L,pH=6.0~6.5,溶剂为水;种子培养基的配方优选为:葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,磷酸氢二钠2.7g/L,柠檬酸1.2g/L,硫酸镁0.25g/L,pH6.0,溶剂为水;
步骤(3a)中,所述的发酵培养基,其配方为:葡萄糖18~20g/L,蛋白胨8~10g/L,酵母粉4~6g/L,磷酸氢二钠2.5~3g/L,柠檬酸1~1.5g/L,硫酸镁0.2~0.3g/L,pH=6.0~6.5,溶剂为水;发酵培养基的配方优选为:葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,磷酸氢二钠2.7g/L,柠檬酸1.2g/L,硫酸镁0.25g/L,pH6.0,溶剂为水;
步骤(3a)中,所述的在碱液中浸泡,是将细菌纤维素膜置于0.1~0.2mol/L的NaOH水溶液中,NaOH的浓度优选为0.1mol/L,在60~80℃条件下浸泡1~2h,浸泡温度优选为80℃,浸泡时间优选为1h。
步骤(1)中,所述的用酸处理细菌纤维素干膜,将细菌纤维素干膜在0.5~1mol/L的HCl中浸泡1~2h;HCl的浓度优选为1mol/L,浸泡时间优选为1h。
步骤(1)中,所述的用碱处理细菌纤维素膜A,将细菌纤维素膜A在20~50g/L的NaOH中浸泡2~8h;NaOH的浓度优选为20g/L,浸泡时间优选为8h。
步骤(1)中,所述的乙酰化修饰,包括如下步骤:将细菌纤维素膜B浸入乙酰化试剂中,细菌纤维素膜B与乙酰化试剂的比例为1g:5ml~25ml,加入催化剂,在60~100℃条件下,反应0.5~3h,反应温度优选为70℃,反应时间优选为2h,反应结束用水冲洗,干燥,制备得到改性的细菌纤维素膜;
所述的乙酰化试剂为已酸酐、氯乙酰或冰醋酸,乙酰化试剂优选为已酸酐;
所述的催化剂为硫酸或碘,其中硫酸的加入量为10~12mol/L,碘的加入量为0.05~0.15mmol/L,所述的催化剂优选为硫酸。
步骤(1)中,所述的酯化修饰,包括如下步骤:将细菌纤维素膜B按5g/L~10g/L加入吡啶或三乙胺中,再加入酯化剂,细菌纤维素与酯化剂的比例为0.5~2g:100ml,50~150℃条件下,优选反应温度为50℃,氮气保护下反应1~3h,反应时间优选为2h,用乙醇清洗,再用水冲洗,干燥,制备得到改性的细菌纤维素膜;
所述的酯化剂是硫酸、醋酸、己酸或十二酸,所述的酯化剂优选为十二酸。
步骤(1)中,所述的硅烷偶联剂修饰,包括如下步骤:将硅烷偶联剂与甲苯按体积比为1:1~2的比例混合,将细菌纤维素按5~20g/L加入硅烷偶联剂中,再加入与硅烷偶联剂等摩尔量的异咪唑,室温下反应1~3h,反应时间优选为2h,用水清洗,干燥,制备得到改性的细菌纤维素膜;
所述的硅烷试剂是烷基二甲基氯硅烷、丁基二甲基氯硅烷、辛基二甲基氯硅烷或十二烷基二甲基氯硅烷,所述的硅烷试剂优选为丁基二甲基氯硅烷。
步骤(1)中,所述的高分子聚合物修饰,包括如下步骤:将细菌纤维素膜B按照5~20g/L加入高分子聚合物中,得到混合物,将该混合物与甲苯按照体积比为1:1~2的比例混合,以Sn(Oct)2为催化剂,80~95℃,优选80℃,反应12~24h,优选24h,用水清洗,干燥,制备得到改性的细菌纤维素膜;
所述的高分子聚合物为聚乳酸或聚己内酯,所述的高分子聚合物优选为聚乳酸。
步骤(1)中,所述的有机膦偶联剂修饰,包括如下步骤:将膦酸或亚磷酸衍生物溶于有机溶剂制成饱和溶液,按照流速为1~2ml/min逐滴加入到细菌纤维素薄膜中,60~100℃,有限60℃,在氮气保护下反应2~6h,优选反应2h,乙醇清洗,再用水清洗,干燥,制备得到改性的细菌纤维素膜;
所述的亚磷酸衍生物为苯基膦或苯基次膦酸,所述的亚磷酸衍生物优选为苯基膦;所述的有机溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃,所述的有机溶剂优选为二氯甲烷。
上述细菌纤维素膜固定化梭菌的方法制备得到的固定化了丙酮丁醇梭菌的细菌纤维素膜也在本发明的保护范围之内。
上述固定化了丙酮丁醇梭菌的细菌纤维素膜在发酵制备丁醇中的应用也在本发明的保护范围之内。
具体的利用固定化了丙酮丁醇梭菌的细菌纤维素膜发酵产丁醇的方法如下:
将固定化了丙酮丁醇梭菌的细菌纤维素膜按0.05g~0.1g/L放入丙酮丁醇梭菌发酵培养基中,35~40℃,优选37℃,静置培养36-48h,至发酵结束;
所述丙酮丁醇梭菌发酵培养基的配方为:葡萄糖60~70g/L,乙酸铵0.2~0.22g/L,K2HPO4 0.05~0.1g/L,KH2PO4 0.05~0.1g/L,MgSO4·7H2O 0.2~0.3g/L,MnSO4·H2O0.01~0.02g/L,NaCl 0.01~0.02g/L,FeSO4·7H2O 0.01~0.02g/L,对氨基苯甲酸1~2mg/L,维生素B1 1~2mg/L,生物素0.01~0.02mg/L。发酵培养基优选配方为:葡萄糖60g/L,乙酸铵0.22g/L,K2HPO4 0.05g/L,KH2PO4 0.05g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,MnSO4·H2O 0.01g/L,NaCl 0.01g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,对氨基苯甲酸1mg/L,维生素B1 1mg/L,生物素0.01mg/L。
有益效果:
本发明利用固定在细菌纤维素上的丙酮丁醇梭菌作为载体发酵产丁醇,不仅可以多批次连续发酵,还缩短发酵时间,增加产物浓度,有利于产物和菌体的分离,提高生产效率,降低生产成本。
附图说明
图1为细菌纤维素XRD图谱。
图2为酸碱修饰后细菌纤维素的电镜图片。
图3为未修饰,有机膦修饰后的细菌纤维素红外图谱。
图4为高分子聚合,以及有机膦修饰后的热重分析图谱。
图5为游离发酵梭菌的电镜图片。
图6为未修饰前,细菌纤维素固定化梭菌4h后的电镜图片。
图7为苯基膦疏水性修饰后,细菌纤维素固定化梭菌4h后的电镜图片。
图8为苯基膦疏水性修饰后,细菌纤维素固定化梭菌8h后的电镜图片。
图9为苯基膦疏水性修饰后,细菌纤维素固定化梭菌12h后的发酵中期的电镜图片。
图10为苯基膦疏水性修饰后,细菌纤维素固定化梭菌24h后的电镜图片。
图11为苯基膦疏水性修饰后,细菌纤维素固定化连续发酵产丁醇图。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:
将-80℃保藏的木醋杆菌(购自ATCC,该菌的编号为ATCC 23769)接种到斜面培养基上,所述的斜面培养基为:葡萄糖100g/L,酵母粉10g/L,碳酸钙20g/L,琼脂15g/L,pH=6.8;在30℃下,静置培养24h,长出菌苔后,刮取一环转接至100ml种子培养基中,所述种子培养基为:葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,磷酸氢二钠2.7g/L,柠檬酸1.2g/L,硫酸镁0.25g/L,pH6.0,高温灭菌15min,150r/min,30℃,培养18h;以5%的接种量接种到200ml发酵培养基中,所述发酵培养基为:葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,磷酸氢二钠2.7g/L,柠檬酸1.2g/L,硫酸镁0.25g/L,pH6.0,30℃,静置培养72h,待形成细菌纤维素薄膜,取出细菌纤维素薄膜,蒸馏水多次冲洗,去除表面杂质,再浸入0.1mol/L NaOH中,80℃,60min,除去残存菌体和培养基;然后去离子水反复冲洗使pH为中性,剪成5*5cm2小块,真空冷冻干燥至恒重,得到细菌纤维素干膜。得到细菌纤维素膜的XRD图谱如图1所示,从图中可以看出所制备得到的细菌纤维素膜为纯细菌纤维素薄膜。
降低自交联度:细菌纤维素干膜小块0.5g,浸泡在20ml 1M HCl中,室温下,静置1h,去离子水清洗至中性,自然干燥。
增加粗糙度:酸处理后的细菌纤维素干膜0.5g,浸泡在20ml,20g/L的NaOH溶液中,室温下静置8h,取出,去离子水清洗至中性,自然干燥。
如图2所示,酸碱处理后,细菌纤维素自交联度降低,出现较多孔隙,细菌纤维素表面粗糙。
实施例2:
按照表1所示的方法分别制备乙酰化修饰、酯化修饰、硅烷偶联剂修饰、高分子聚合物修饰及有机膦偶联修饰的改性细菌纤维素膜。以下改性方法中细菌纤维素的加入量为0.5g。
表1细菌纤维素膜的改性方法
实验结果见图3、4。
如图3,由红外图谱中的特征峰可看出:细菌纤维素特征峰为3450nm处,O—H伸缩振动,2920nm处,CH2—CH伸缩振动,900nm处,糖苷键,1059nm处,C=O伸缩振动。
有机膦修饰后,2100nm处的峰消失,1500nm,1400nm处的峰出现,1000—1300nm处的峰增强,表明,磷酯键的出现,增强。2400nm处的为CO2吸收峰。
如图4,TG分析:纯细菌纤维素只有两个拐点,0-100℃,细菌纤维素脱水,BC质量有少许的下降,240℃后纤维素迅速失重;图中聚乳酸修饰后,340℃左右进一步降低,是修饰上去的聚乳酸失去质量;有机膦修饰约200℃细菌纤维素质量迅速降低,340℃左右进一步降低,是修饰上去的有机膦失去质量。DSC分析,一开始失水,有个吸热峰,后面细菌纤维素分解,修饰的聚乳酸以及苯基膦分解表现出两个放热峰。
实施例3:
丙酮丁醇梭菌细胞液的制备:-80℃保存的丙酮丁醇梭菌Clostridiumacetobutylicum B3(CGMCC No.5234),接种到平板培养基上,所述的平板培养基为:葡萄糖5g/L,蛋白胨5g/L,酵母粉3g/L,乙酸铵2g/L,MgSO4·7H2O 3g/L,NaCl 2g/L,K2HPO4 1g/L,KH2PO4 1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,琼脂粉15~20g/L,pH 6.0,121℃,15min灭菌;在37℃下,厌氧培养24h,长出菌苔后,刮取菌苔转接到另一平板上,12h后再转接一次,培养12h后刮取菌苔,转接至100ml种子培养基中,所述种子培养基为:葡萄糖5g/L,蛋白胨5g/L,酵母粉3g/L,乙酸铵2g/L,MgSO4·7H2O 3g/L,NaCl 2g/L,K2HPO4 1g/L,KH2PO4 1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,pH 6.0,高温灭菌15min,37℃,静置培养12h;以10%的接种量接种到100ml发酵培养基中,所述发酵培养基为:葡萄糖60g/L,乙酸铵0.22g/L,K2HPO4 0.05g/L,KH2PO40.05g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,MnSO4·H2O 0.01g/L,NaCl 0.01g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,对氨基苯甲酸1mg/L,维生素B11mg/L,生物素0.01mg/L,37℃,静置培养12h后得丙酮丁醇梭菌菌液,从图5中可以看出出细菌悬液中,细菌比较分散,有利于其在细菌纤维素上固定化。
丙酮丁醇梭菌固定化发酵:改性后的细菌纤维素干膜0.5g,加入到丙酮丁醇梭菌细胞液中,静置24h,使细胞吸附固定在细菌纤维素膜上,得到固定化了丙酮丁醇梭菌的细菌纤维素膜。
图6为未修饰前,细菌纤维素固定化梭菌4h后的电镜图片,图7为苯基膦疏水性修饰后,细菌纤维素固定化梭菌4h后的电镜图片。图6、7对比可看出苯基膦修饰后,相同时间下比未修饰的固定化细菌量多。
图8为苯基膦疏水性修饰后,细菌纤维素固定化梭菌8h后的电镜图片,图9为苯基膦疏水性修饰后,细菌纤维素固定化梭菌12h后的发酵中期的电镜图片,图10为苯基膦疏水性修饰后,细菌纤维素固定化梭菌24h后的电镜图片。图8、9、10可看出随着固定吸附的时间增加,吸附的菌体逐渐增多,最终覆盖整个材料表面。
将该固定化了丙酮丁醇梭菌的细菌纤维素膜置于100ml丙酮丁醇梭菌培养液:葡萄糖60g/L,乙酸铵0.22g/L,K2HPO4 0.05g/L,KH2PO4 0.05g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,MnSO4·H2O 0.01g/L,NaCl 0.01g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,对氨基苯甲酸1mg/L,维生素B11mg/L,生物素0.01mg/L中,37℃,静置培养,每6h取样,GC分析产物浓度,48h发酵结束。以没有进行固定化的丙酮丁醇梭菌为对照,其发酵时间为72小时,游离发酵48h时丁醇产量为:4.84g/L。
连续批次发酵:固定化了丙酮丁醇梭菌的有机膦偶联剂修饰(苯基膦)的细菌纤维素膜固定在连续发酵罐内,通入丙酮丁醇梭菌菌悬液,自循环培养:37℃,30rpm/min,由下往上循环培养,使丙酮丁醇梭菌吸附在细菌纤维素膜上,用于连续发酵,见图11,可看出该纤维素可连续发酵,周期约12h,每批次产丁醇约10g/L,增加了丁醇生产效率。
表2固定化细胞发酵与游离细胞发酵丁醇产量比较
发酵结果如表2所示。从表2中可以看出,分别经过乙酰化修饰(乙酸酐)、酯化修饰(十二酸)、硅烷偶联剂修饰(丁基二甲基氯硅烷)、高分子聚合物修饰(聚乳酸)、有机膦偶联剂修饰(苯基膦)的细菌纤维素固定的丙酮丁醇梭菌的丁醇产量较游离细胞丁醇生产效率依次增加了63.62%、58.49%、65.23%、57.61%、64.06%。
Claims (6)
1.一种利用细菌纤维素膜固定化丙酮丁醇梭菌的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)细菌纤维素膜的疏水改性:用酸处理细菌纤维素干膜,得到细菌纤维素膜A;再用碱处理细菌纤维素膜A,得到细菌纤维素膜B;对细菌纤维素膜B表面进行有机膦偶联剂修饰,制备得到改性的细菌纤维素膜;
(2)改性的细菌纤维素膜固定化梭菌:将步骤(1)得到的改性的细菌纤维素膜固定在连续发酵罐内,通入丙酮丁醇梭菌菌悬液,自循环培养,得到固定化了丙酮丁醇梭菌的细菌纤维素膜;
步骤(1)中,所述的有机膦偶联剂修饰,包括如下步骤:将膦酸或亚磷酸衍生物溶于有机溶剂制成饱和溶液,按照流速为1~2ml/min逐滴加入到细菌纤维素薄膜中,60~100℃,反应2~6h,制备得到改性的细菌纤维素膜;
所述的亚磷酸衍生物为苯基膦或苯基次膦酸,所述有机溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃。
2.根据权利要求1所述的利用细菌纤维素膜固定化梭菌的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的细菌纤维素干膜,通过发酵制备得到,所述的发酵包括如下步骤:
(1a)将木醋杆菌接种到斜面培养基上培养,得到一级种子;
(2a)将步骤(1a)得到的一级种子转接至种子培养基中,30℃条件下培养18~24h,转速为150rpm,得到二级种子液;
(3a)将步骤(2)得到的二级种子液转接到发酵培养基中,30℃条件下静置培养,收集发酵液中的细菌纤维素膜,将其在碱液中浸泡,然后干燥处理,制备得到细菌纤维素干膜。
3.根据权利要求2所述的利用细菌纤维素膜固定化梭菌的方法,其特征在于,
步骤(1a)中,所述的斜面培养基,其配方为:葡萄糖80~120g/L,酵母粉8~12g/L,碳酸钙15~25g/L,琼脂15~20g/L,pH=6.4~7.0,溶剂为水;
步骤(2a)中,所述的种子培养基,其配方为:葡萄糖18~20g/L,蛋白胨8~10g/L,酵母粉4~6g/L,磷酸氢二钠2.5~3g/L,柠檬酸1~1.5g/L,硫酸镁0.2~0.3g/L,pH=6.0~6.5,溶剂为水;
步骤(3a)中,所述的发酵培养基,其配方为:葡萄糖18~20g/L,蛋白胨8~10g/L,酵母粉4~6g/L,磷酸氢二钠2.5~3g/L,柠檬酸1~1.5g/L,硫酸镁0.2~0.3g/L,pH=6.0~6.5,溶剂为水;
步骤(3a)中,所述的在碱液中浸泡,是将细菌纤维素膜置于0.1~0.2mol/L的NaOH水溶液中,在60~80℃条件下浸泡1~2h。
4.根据权利要求1所述的利用细菌纤维素膜固定化梭菌的方法,其特征在于,
步骤(1)中,所述的用酸处理细菌纤维素干膜,将细菌纤维素干膜在0.5~1mol/L的HCl中浸泡1~2h,
步骤(1)中,所述的用碱处理细菌纤维素膜A,将细菌纤维素膜A在20~50g/L的NaOH中浸泡2~8h。
5.权利要求1~4任一所述的利用细菌纤维素膜固定化梭菌的方法得到的固定化了丙酮丁醇梭菌的细菌纤维素膜。
6.权利要求5所述的固定化了丙酮丁醇梭菌的细菌纤维素膜在发酵制备丁醇中的应用。
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