CN104726517B - 一种以细菌纳米纤维素为原料制备纤维素纳米晶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以细菌纳米纤维素为原料制备纤维素纳米晶的方法，包括：(1)将细菌纤维素生产菌株按2～3接种环的接种量接入液体种子培养基，于30～40℃条件下种子培养24～36小时后，再按3～15％的接种量转接到发酵培养基中，20～30℃静置培养1‑14天或者搅拌罐中发酵1～6天，收获细菌纳米纤维素，然后浸泡于0.5～2wt％的NaOH溶液中，70～100℃水浴处理30～120min，得到纯化过的细菌纳米纤维素；(2)制备纤维素纳米晶。本发明以细菌纳米纤维素为原料，具有原料化学纯度高、结晶度高的特点，且纳米纤维素易水解，纤维素纳米晶得率高，制备方法简便易行，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纤维素纳米晶领域，特别涉及一种以细菌纳米纤维素为原料制备纤维素纳米晶的方法。
背景技术
纤维素纳米晶是一新型的多功能纳米材料，它具有机械强度极高、密度低、化学性质可调、绿色环保等特性。现今，它已被用于食品、传感器、药物传递、酶固定化、催化剂等领域。
细菌纳米纤维素(bacterial nanocellulose,BNC)是由一种微生物合成的胞外多糖，是由葡萄糖单体通过β-1，4糖苷键聚合而成的直链高分子化合物。细菌纳米纤维素具有以下独特的性质，用于制造纤维素纳米晶具有很大优越性：(1)高化学纯度。细菌纳米纤维素以100％纤维素的形式存在，不含半纤维素、木质素和其它成分，提纯过程简单；(2)高结晶度。细菌纳米纤维素的结晶度高于70％，大大高于植物纤维素，因此在制造纤维素纳米晶时得率也应相对高于植物纤维；(3)纳米级纤维。细菌纳米纤维素的微纤维组成独特的束状纤维，宽度100nm左右，厚度为3～8nm，是目前最细的天然纤维，故其中的非结晶区非常容易被去除掉；(4)发酵合成。细菌纳米纤维素是由微生物发酵时合成的，故其生产不受季节变换的影响，且合成速率比植物纤维快。因此，基于纤维素纳米晶的广阔应用前景及细菌纳米纤维素的各种特性，细菌纳米纤维素用于制备纤维素纳米晶将产生很好的效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种以细菌纳米纤维素为原料制备纤维素纳米晶的方法，该方法以细菌纳米纤维素为原料，具有原料化学纯度高、结晶度高的特点，且纳米纤维素易水解，纤维素纳米晶得率高，制备方法简便易行，具有良好的应用前景。
本发明的一种以细菌纳米纤维素为原料制备纤维素纳米晶的方法，包括：
(1)将细菌纤维素生产菌株按2～3接种环的接种量接入液体种子培养基，于30～40℃条件下种子培养24～36小时后，再按3～15％的接种量转接到发酵培养基中，20～30℃静置培养1-14天或者搅拌罐中发酵1～6天，收获细菌纳米纤维素，然后浸泡于0.5～2wt％的NaOH溶液中，70～100℃水浴处理30～120min，得到纯化过的细菌纳米纤维素；
(2)取纯化过的细菌纳米纤维素，先进行匀浆，再加入过硫酸铵，而后加水，在40～60℃条件下振荡1～12h，离心收集沉淀，用超纯水洗涤，再离心，如此重复，直到导电率低于一定值，加入碱性溶液直至pH为7，得到纳盐形式的纤维素纳米晶；
或者取纯化过的细菌纳米纤维素，先进行匀浆，加入浓硫酸，在40～60℃条件下振荡1～12h，加超纯水使反应停止，冷却后离心，取沉淀用超纯水洗涤并超声，再离心，如此重复直至pH不变，再用超滤膜过滤，取滤液加入碱性溶液直至pH为7，得到纳盐形式的纤维素纳米晶。
所述步骤(1)中的细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenessp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌(Seudomonas cepacia)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)或红茶菌(kombucha)。
所述步骤(1)中的液体种子培养基和发酵培养基的组分为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖25g，蛋白胨或胰蛋白胨3g，酵母浸膏5g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min；或者为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO42.7g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min。
所述步骤(2)中的细菌纳米纤维素、过硫酸铵和水的比例为10g:10～150g:1L；细菌纳米纤维素和浓硫酸的比例为10g:80～100mL。
所述步骤(2)中的浓硫酸的体积百分比浓度为50～70％。
所述步骤(2)中的碱性溶液为NaOH溶液，浓度为1M。
有益效果
本发明利用细菌纳米纤维素制备纤维素纳米晶，比常规利用植物纤维素的方法步骤少且水解速度快，得率高。常规法的原料——植物纤维素的制备一般通过碱法或者有机溶剂提取法，环境污染大，消耗资源多，而本发明的原料细菌纳米纤维素通过细菌发酵获得，资源消耗少，污染小。本发明有利于细菌纳米纤维素的开发利用，降低纤维素纳米晶生产成本，及拓宽纤维素纳米晶的应用领域。故本发明非常适合于工业化生产，产生很好的经济效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)细菌纳米纤维素的制备及处理
木葡醋杆菌23770按2接种环的接种量于液体种子培养基中30℃扩培24小时后，再按6％的接种量转接到发酵培养基中30℃静置培养8天，收获细菌纳米纤维素湿膜；制备好的BC膜浸泡在1％的NaOH溶液中在80℃水浴直至细菌纳米纤维素膜变白色半透明；
其中，种子培养基和发酵培养基的组分为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖25g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH5.0，121℃灭菌20min；
(2)纤维素纳米晶的制备
取纯化过的细菌纳米纤维素10g(干重)，先进行匀浆，加入80mL 50％的浓硫酸，在40℃条件下振荡1h，加超纯水500mL使反应停止，再高速离心，取沉淀用超纯水洗涤并超声，再高速离心，如此重复三次，再用超滤膜过滤，取滤液加入1M NaOH溶液直至pH为7，可得到纳盐形式纤维素纳米晶，经称重计算，得率可达50-70％。
实施例2
(1)细菌纳米纤维素的制备及处理
取果糖25g、蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH为5.0，115℃灭菌30min，制作木葡糖醋杆菌23770种子，再以6％的量至搅拌罐中，而后在30℃下100转的转速下培养6天；将细菌纤维素离心分离。再将其浸泡在80℃0.5％的NaOH溶液中直至细菌纳米纤维素变白色半透明；
(2)纤维素纳米晶的制备
取纯化过的细菌纳米纤维素10g(干重)，先进行匀浆，再加入50g过硫酸铵，而后加水至1L，在40℃条件下振荡2h，高速离心收集沉淀，用超纯水洗涤，再高速离心，如此重复三次，再加入1M NaOH溶液直至pH为7，可得到纳盐形式纤维素纳米晶，经称重计算，得率可达68％。
实施例3
(1)细菌纳米纤维素的制备及处理
取蔗糖40g、胰蛋白胨6g、酵母浸膏10g，水1L，pH为5.0，115℃灭菌30min，制作木葡糖醋杆菌23770种子，再以8％的量至搅拌罐中，而后在30℃下200转的转速下培养6天。将细菌纤维素离心分离。再将其浸泡在80℃0.5％的NaOH溶液中直至细菌纳米纤维素变白色半透明；
(2)纤维素纳米晶的制备
取纯化过的细菌纳米纤维素10g(干重)，先进行匀浆，再加入150g过硫酸铵，而后加水至1L，在50℃条件下振荡2h，高速离心收集沉淀，用超纯水洗涤，再高速离心，如此重复三次，再加入1M NaOH溶液直至pH为7，可得到纳盐形式纤维素纳米晶，经称重计算，得率可达60％。
实施例4
(1)细菌纳米纤维素的制备及处理
取甘露醇40g、胰蛋白胨6g、酵母浸膏10g，水1L，115℃灭菌30min，接入直径1cm的红茶菌1～3片圆片，将其在30℃下静置培养2周。将细菌纤维素转移至玻砂漏斗中。再将其浸泡在80℃1％的NaOH溶液中直至细菌纳米纤维素膜变白色半透明；
(2)纤维素纳米晶的制备
取纯化过的细菌纳米纤维素10g(干重)，先进行匀浆，加入80mL 70％的浓硫酸，在60℃条件下振荡4h，加超纯水500mL使反应停止，冷却后高速离心，取沉淀用超纯水洗涤并超声，再高速离心，如此重复上次，再用超滤膜过滤，取滤液加入1M NaOH溶液直至pH为7，可得到纳盐形式纤维素纳米晶，经称重计算，得率可达50％。
实施例5
(1)细菌纳米纤维素的制备及处理
取葡萄糖50g、蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，115℃灭菌30min，接入直径1cm的红茶菌1～3片圆片，将其在30℃下静置培养2周。将细菌纤维素转移至玻砂漏斗中。再将其浸泡在80℃1％的NaOH溶液中直至细菌纳米纤维素膜变白色半透明；
(2)纤维素纳米晶的制备
取纯化过的细菌纳米纤维素10g(干重)，先进行匀浆，再加入10g过硫酸铵，而后加水至1L，在50℃条件下振荡4h，高速离心收集沉淀，用超纯水洗涤，再高速离心，如此重复四次，再加入1M NaOH溶液直至pH为7，可得到纳盐形式纤维素纳米晶。
Claims (3)
1.一种以细菌纳米纤维素为原料制备纤维素纳米晶的方法，包括：
(1)将细菌纤维素生产菌株按2～3接种环的接种量接入液体种子培养基，于30～40℃条件下种子培养24～36小时后，再按3～15％的接种量转接到发酵培养基中，20～30℃静置培养1-14天或者搅拌罐中发酵1～6天，收获细菌纳米纤维素，然后浸泡于0.5～2wt％的NaOH溶液中，70～100℃水浴处理30～120min，得到纯化过的细菌纳米纤维素；其中，所述细菌纤维素生产菌株为木葡醋杆菌23770；
(2)取纯化过的细菌纳米纤维素，先进行匀浆，再加入过硫酸铵，而后加水，在40～60℃条件下振荡1～12h，离心收集沉淀，用超纯水洗涤，再离心，如此重复，加入碱性溶液直至pH为7，得到钠盐形式的纤维素纳米晶；其中，细菌纳米纤维素、过硫酸铵和水的比例为10g:10～150g:1L；碱性溶液为NaOH溶液。
2.根据权利要求1所述的一种以细菌纳米纤维素为原料制备纤维素纳米晶的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的液体种子培养基和发酵培养基的组分为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖25g，蛋白胨或胰蛋白胨3g，酵母浸膏5g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min；或者为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO42.7g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min。
3.根据权利要求1所述的一种以细菌纳米纤维素为原料制备纤维素纳米晶的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的碱性溶液的浓度为1M。
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