CN105002231A - 一种生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法 - Google Patents

一种生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法，该方法包括配制发酵培养基、接种菌株和静态发酵、收集细菌纤维素膜及清洗步骤。所述方法是将新鲜桑叶经粉碎、超声提取、酸解、调节pH、脱色以及过滤制得桑叶提取液，将蔗糖加入桑叶提取液中，灭菌即得发酵培养基，由木醋杆菌静态发酵制得细菌纤维素膜。本发明利用价格低廉、来源广泛的桑叶作为细菌纤维素发酵培养基的成分，同时，与大多数生物质相比，桑叶富含碳、氮以及细菌必要的生长因子，在发酵过程中无需加入其它氮源，并可有效替代传统发酵液中的碳源，进一步地降低了生产成本，且制备方法简便易行，能够有效促进细菌纤维素的规模化生产。

Description

一种生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial Cellulose,BC)是一种由某些细菌产生的由D-吡喃葡萄糖以β-1,4糖苷键链接而成的线性高分子聚合物，与植物纤维素相比，细菌纤维素具有更高的纯度、抗拉强度以及更高的杨氏模量，良好的生物相容性和可降解性等一系列独特的性能，使其在生物医学、组织工程、食品以及纺织等诸多领域得到了广泛的应用。
细菌纤维素的生产受诸多因素的影响，特别是发酵培养基的成本。为了减少细菌纤维素的生产成本，促进细菌纤维素的大规模生产，大量发酵培养基如糖蜜、酒产品废弃液等均被尝试用于细菌纤维素生产，但是，这些原料的使用仍不足以促进细菌纤维素的规模化生产，甚至使细菌纤维素的产率降低。生物质被尝试用于细菌纤维素的生产中。Yang等人利用一种生物质象草，实现了由生物质象草到细菌纤维素的低成本生物转换(X.-Y.Yang,C.Huang,H.-J.Guo,L.Xiong,Y.-Y.Li，H.-R.Zhang,and X.-D.Chen:Bioconversion of elephant grass(Pennisetum purpureum)acid hydrolysate to bacterialcellulose by Gluconacetobacter xylinus.Journal of Applied Microbiology 115,995-1002)。
桑叶即桑树的叶子，我国大部分地区均有种植，是我国传统中药之一。近年来，人们对桑叶的化学成分进行了系统的研究，发现桑叶具有极大的营养价值。桑叶中含有人体必需氨基酸，各种维生素，黄酮，生物碱以及镁、钙、锰等元素。目前从桑叶中检测出15种氨基酸，含氮量为3.3％～4.3％，粗蛋白含量占20％～27％，具有极高的含氮量和粗蛋白量。此外桑叶中还含有多酚类，叶酸，脂肪，多糖等营养物质，其中可溶性糖占10％～14％。桑叶中极大含氮量、黄酮量以及可溶性糖量使其在食品、医药等诸多领域得到了广泛的应用。富含氮、糖含量的桑叶有望成为细菌纤维素发酵培养基的原料，加上其广域的种植，资源丰富，使其有望显著降低细菌纤维素生产成本，促进细菌纤维素的规模化生产，具有极大的商业价值和应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对细菌纤维素生产成本高而不利于实现规模化生产的问题，提供一种操作简单，工艺简洁，价格低廉的生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法，包括配制发酵培养基、接种菌株和静态发酵、收集细菌纤维素膜及清洗步骤，其中，配制发酵培养基时加入桑叶提取液。
所述的桑叶提取液的制备过程如下：首先将桑叶洗净剪碎后，按桑叶与水的质量体积比为2～5:3加水，40～70℃下超声，然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入MgSO4·5H2O、冰乙酸及稀硫酸，110～135℃下蒸煮0.5～1.5h，得到酸解液，之后用氢氧化钙调pH至6～7，然后将酸解液与滤液混合、脱色、过滤，即得桑叶提取液，其中，桑叶与MgSO4·5H2O的质量比为200～500：0.35，桑叶与冰乙酸的质量体积比为200～500：0.75，桑叶与稀硫酸的质量比为2～5：2，稀硫酸的质量浓度为1.5％～4.0％。
所述的脱色为活性炭脱色，活性炭的加入量为桑叶质量的5％，脱色时间为1～2h。
所述的发酵培养基的配制如下：将蔗糖加入桑叶提取液中，灭菌即得发酵培养基，其中，蔗糖与桑叶的质量比为0～11：200～500。
所述的接种菌株和静态发酵为在发酵培养基中接入体积为发酵培养基的12％的木醋杆菌种子液，静态发酵7～10d。
所述收集细菌纤维素膜及清洗为发酵结束后取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
与现有技术相比，本发明利用价格低廉、来源广泛的桑叶作为细菌纤维素发酵培养基的成分，降低了生产成本，并且制备方法简便易行，能够有效促进细菌纤维素的规模化生产；同时，与大多数生物质相比，桑叶富含碳、氮以及细菌必要的生长因子，在发酵过程中无需加入其它氮源，并可有效替代传统发酵液中的碳源，进一步地降低了生产成本。本发明所述生产细菌纤维素的方法产量高达9.8g/L(干重)。
附图说明
图1为实施例10制备得到的细菌纤维素的SEM图。
图2为实施例10制备得到的细菌纤维素的红外图。
图3为实施例10制备得到的细菌纤维素的XRD图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面结合实施例对本发明作进一步详述。
实施例1
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将200g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，40℃下超声15min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为1.5％H2SO4溶液，110℃下蒸煮0.5h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至6，然后将酸解液与滤液混合，加入10g活性炭脱色1h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将上述所得桑叶提取液加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵7d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例2
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将200g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，40℃下超声15min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为1.5％H2SO4溶液，135℃下蒸煮0.5h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至6，然后将酸解液与滤液混合，加入10g活性炭脱色2h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将5g蔗糖加入到上述所得桑叶提取液中并加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵8d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例3
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将200g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，40℃下超声15min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为1.5％H2SO4溶液，110℃下蒸煮0.5h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至7，然后将酸解液与滤液混合，加入10g活性炭脱色1h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将11g蔗糖加入到上述所得桑叶提取液中并加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵10d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例4
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将200g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，70℃下超声20min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为3.0％H2SO4溶液，110℃下蒸煮1h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至6，然后将酸解液与滤液混合，加入10g活性炭脱色2h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将上述所得桑叶提取液加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵7d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例5
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将300g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，70℃下超声20min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为3.0％H2SO4溶液，135℃下蒸煮1h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至6，然后将酸解液与滤液混合，加入15g活性炭脱色1h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将5g蔗糖加入到上述所得桑叶提取液中并加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵8d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例6
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将300g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，40℃下超声20min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为3.0％H2SO4溶液，135℃下蒸煮1h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至7，然后将酸解液与滤液混合，加入15g活性炭脱色2h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将11g蔗糖加入到上述所得桑叶提取液中并加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵10d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例7
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将300g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，70℃下超声20min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为4.0％H2SO4溶液，110℃下蒸煮1.5h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至6，然后将酸解液与滤液混合，加入15g活性炭脱色1h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将上述所得桑叶提取液加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵7d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例8
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将300g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，70℃下超声30min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为4.0％H2SO4溶液，110℃下蒸煮1.5h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至7，然后将酸解液与滤液混合，加入15g活性炭脱色2h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将5g蔗糖加入到上述所得桑叶提取液中并加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵8d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例9
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将500g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，40℃下超声30min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为4.0％H2SO4溶液，135℃下蒸煮1.5h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至6，然后将酸解液与滤液混合，加入25g活性炭脱色1h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将11g蔗糖加入到上述所得桑叶提取液中并加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵10d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例10
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将500g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，70℃下超声15min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为1.5％H2SO4溶液，135℃下蒸煮1h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至6，然后将酸解液与滤液混合，加入25g活性炭脱色1h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将上述所得桑叶提取液加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵7d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例11
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将500g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，70℃下超声30min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为1.5％H2SO4溶液，110℃下蒸煮0.5h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至6，然后将酸解液与滤液混合，加入25g活性炭脱色2h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将5g蔗糖加入到上述所得桑叶提取液中并加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵10d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例12
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将500g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，40℃下超声20min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为4.0％H2SO4溶液，110℃下蒸煮1h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至7，然后将酸解液与滤液混合，加入25g活性炭脱色1h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将11g蔗糖加入到上述所得桑叶提取液中并加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵8d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
实施例13
步骤1、桑叶提取液的制备：首先将500g桑叶洗净剪碎后，加入300ml水，70℃下超声15min；然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入0.35g的MgSO4·5H2O、0.75mL的冰乙酸及200mL质量浓度为3.0％H2SO4溶液，135℃下蒸煮1.5h，得到酸解液；之后用氢氧化钙调pH至6，然后将酸解液与滤液混合，加入25g活性炭脱色2h，过滤即得桑叶提取液；
步骤2、发酵培养基的配制：将11g蔗糖加入到上述所得桑叶提取液中并加水定容至500mL，在121℃下灭菌20min，即得发酵培养基；
步骤3、接种菌株和静态发酵：接入60mL木醋杆菌种子液，静态发酵8d；
步骤4、收集细菌纤维素膜及清洗：取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
表征
1、扫描电镜观察
扫描电镜下观察实施例10制备得到的细菌纤维素，结果如图1所示。从图中可知，利用桑叶制备得到的细菌纤维素膜为三维网状结构，纤维粗细均匀，与传统发酵液制得的细菌纤维素在形态上类似，说明此方法完全可用于工业生产，有效降低生产成本。
2、红外光谱图
测定实施例10制备得到的细菌纤维素的红外光谱图，结果如图2所示。从图中可以看出，本发明制得的细菌纤维素纯净，没有杂质的引入且发酵液成分容易去除干净，便于工业生产的后处理。
3、XRD图
测定实施例10制备得到的细菌纤维素的XRD图，结果如图3所示。从图中可以看出，本发明制得的细菌纤维素膜具有较高的结晶度，晶型与传统发酵液所制备纤维素一致，说明此方法对细菌纤维素的晶型没有影响。

Claims (5)

1.一种生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法，包括配制发酵培养基、接种菌株和静态发酵、收集细菌纤维素膜及清洗步骤，其特征在于，配制发酵培养基时加入桑叶提取液，所述的桑叶提取液的制备过程如下：首先将桑叶洗净剪碎后，按桑叶与水的质量体积比为2～5：3加水，40～70℃下超声，然后将超声后的混合物过滤，滤液备用，滤渣中加入MgSO4·5H2O、冰乙酸及稀硫酸，110～135℃下蒸煮0.5～1.5h，得到酸解液，之后用氢氧化钙调pH至6～7，然后将酸解液与滤液混合、脱色、过滤，即得桑叶提取液，其中，桑叶与MgSO4·5H2O的质量比为200～500：0.35，桑叶与冰乙酸的质量体积比为200～500：0.75，桑叶与稀硫酸的质量比为2～5：2，稀硫酸的质量浓度为1.5％～4.0％。
2.如权利要求1所述的生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的脱色为活性炭脱色，活性炭的加入量为桑叶质量的5％，脱色时间为1～2h。
3.如权利要求1所述的生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的配制发酵培养基为在桑叶提取液中加入蔗糖，灭菌即得发酵培养基，其中，蔗糖与桑叶的质量比为0～11：200～500。
4.如权利要求1所述的生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的接种菌株和静态发酵为在发酵培养基中接入体积为发酵培养基的12％的木醋杆菌种子液，静态发酵7～10d。
5.如权利要求1所述的生物转化桑叶制备细菌纤维素的方法，其特征在于，所述收集细菌纤维素膜及清洗的过程如下：发酵结束后取出细菌纤维素膜，分别用1.5％(w/v)的NaOH、3‰(v/v)的双氧水85℃下煮2h，即得纯净的细菌纤维素膜。
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