CN101967471B - 一种以细菌纤维素小球/膜块为载体制备固定化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以细菌纤维素小球/膜块为载体制备固定化酶的方法，包括：发酵制备细菌纤维素小球或细菌纤维素膜；然后用0.1％的NaOH在80～90℃水浴中处理30～120min，去离子水漂洗，收集，用0.1％的醋酸中和残留的碱液，静置，去离子水漂洗，将小球或膜块取出，吸干表面水分，冷冻，然后冷冻干燥后备用；最后采用物理吸附法或吸附～交联法制备固定化酶。本发明的细菌纤维素小球/膜块能高效吸附生物酶，最大限度地保持酶的活性，且安全环保，方法简单，易于操作，可控性强。
Description
技术领域
本发明属固定化酶技术领域，特别是涉及一种以细菌纤维素小球/膜块为载体制备固定化酶的方法。
背景技术
由于酶具有较好的底物专一性，在许多领域具有重要应用价值。但游离的酶蛋白在实际应用过程中易受环境条件影响而变性失活，且不易从反应体系中分离以实现重复使用的目的，这在一定程度上限制了酶的工业化应用。酶固定化技术是实现酶重复连续使用和改善其稳定性的有效手段。目前酶的固定化载体主要包括无机载体材料(如二氧化硅、活性炭、多孔性玻璃等)、有机合成高分子材料(如聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯等)和天然高分子材料(如结构性蛋白，壳聚糖，海藻酸钠等)，但尚无利用细菌纤维素小球为载体来固定化酶的报道。现有的固定化酶技术主要有5种：(1)微囊法：该法是利用半透膜能阻止大分子的酶从胶囊中扩散出去，而小分子反应物和产物能自由扩散的特性来实现的；(2)惰性载体吸附法：酶可以通过范德华力，氢键，疏水作用，静电相互作用等吸附到不溶性支持物上，从而达到固定化的目的；(3)共价交联法：利用双功能试剂可以使分子与分子交联起来而形成大分子颗粒，从而实现酶的固定化；(4)胶格物理包埋法：该包埋是通过成胶物质在酶的水溶液中聚合而实现的，最常用的是聚丙烯酰胺胶，其它还有淀粉胶等；(5)与水不溶性载体共价结合法：根据酶和载体本身的理化性质，通过共价偶联使酶和载体产生共价结合。
细菌纤维素(bacterial cellulose，BC)是一种由微生物合成的高纯度胞外生物纤维。细菌纤维素的初级结构与植物纤维素相似，由吡喃葡萄糖单体以β-1，4糖苷键连接而成的直链多糖，但是BC的纤维结构却与植物纤维大不相同。BC由微纤维丝组成，这种微纤维丝呈带状，其厚度为0.1μm左右，比植物纤维的厚度(10μm)小两个数量级。此外，这种微纤维丝具有明显的网状结构。由于BC微结构的特性，它具有许多独特的性质，例如良好的机械强度，超细纳米纤维网络，生物可降解性，较大的比表面积、导电性和高的结晶度等特性。近几年，有研究报道利用化学改性后的细菌纤维素膜为载体用于微生物细胞的固定化，其固定化后的微生物细胞对孔雀石绿染料的降解效果良好，在培养液初始pH值和染料初始浓度不变的情况下仍能保持稳定的脱色率。细菌纤维素作为一种新型的纳米纤维生物材料，已经成为国内外研究的热点。细菌纤维素具有纳米纤维网络结构，因此该纤维材料具有非常高的比表面和数量众多的空隙结构，有利于吸附和包容酶蛋白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种以细菌纤维素小球/膜块为载体制备固定化酶的方法，具有工艺简便，可操作性强，酶活损失小等优点。
本发明提供一种以球形细菌纤维素为载体制备固定化酶的方法，包括：
(1)细菌纤维素小球的制备
将活化的斜面菌种接入pH4.8～5.2的种子培养基，在25～30℃、100～200rpm条件下培养12～16h制得液体种子，以体积百分比为4～10％接种量将液体种子转接至pH4.8～5.2的发酵培养基中，每500mL锥形瓶中含有200～300mL发酵培养液，25～30℃，80～200rpm条件下培养48～96h，倾滤，得细菌纤维素小球；
(2)细菌纤维素小球的处理
将发酵收集得到的细菌纤维素小球用质量分数为0.1％的NaOH在80～90℃水浴中处理30～120min，用去离子水漂洗3～5次，收集，用体积分数为0.1％的醋酸中和小球内残留的碱液，静置12～24h，用去离子水漂洗2～3次，在水中保持其球状形态，将小球取出，吸干表面水分，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻，然后在冷冻干燥机中干燥后获得白色纤维素小球；
(3)细菌纤维素小球固定化酶的制备
以细菌纤维素小球为载体采用物理吸附法或吸附～交联法制备固定化酶。
所述步骤(1)中的菌种选自醋杆菌(Acetobacter sp.)、木醋杆菌(A.xylinum)、产醋醋杆菌(A.acetigenum)、醋化杆菌(纹膜醋酸菌，A.aceti)、许氏醋酸菌(A.schutzenbachii)、恶臭醋酸菌(A.rances)、奥尔兰醋杆菌(A.orleanense)、弯醋杆菌(A.curvum)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、葡萄糖杆菌(Gluconobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacter oxydans)、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、根瘤菌(Rhizobium trifolii)、洋葱假单胞菌(Seudomonas cepacia)、八叠球菌(Sarcina ventriculi)、椰毒假单胞菌(P.cocovenenans)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)中的一种或几种。
所述步骤(1)中的种子培养基，按重量百分比，包含：葡萄糖2.0％，酵母粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，Na2HPO4·12H2O 0.27％，柠檬酸0.115％。
所述步骤(1)中的发酵培养基，按重量百分比，包含：葡萄糖2.0％，酵母粉0.5％，胰蛋白胨0.3％，Na2HPO4·12H2O 0.27％，柠檬酸0.115％。
所述步骤(3)中物理吸附法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素小球0.05～0.4g并使其浸没，轻微振荡3～5min，在4℃条件下吸附6～24h，取出细菌纤维素小球，用pH4.8～9.0的醋酸钠缓冲溶液漂洗1～2次，吸干小球表面水分，4℃冰箱保存。
所述步骤(3)中吸附～交联法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素小球0.05～0.4g并使其浸没，轻微振荡3～5min，在4℃条件下吸附6～24h，以1g纤维素小球：25～200mL戊二醛溶液的比例加入质量体积百分比为25％的戊二醛溶液，20～30℃搅拌条件下交联反应1～3h，取出细菌纤维素小球，用pH4.8～9.0的醋酸钠缓冲溶液漂洗1～2次，吸干小球表面水分，4℃冰箱保存。
本发明的一种以细菌纤维素膜块为载体制备固定化酶的方法，包括
(1)细菌纤维素膜的预处理
将细菌纤维素膜用质量分数为0.1％的NaOH在80～90℃水浴中处理30～120min至膜呈乳白色半透明，用去离子水漂洗3-5次，收集，用体积分数为0.1％的醋酸中和膜内残留的碱液，静置12～24h，用去离子水漂洗2-3次，滤纸吸干膜表面水分，将膜切成边长4-30mm×4-30mm的膜块，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻，然后在冷冻干燥机中干燥，备用；或将去离子水漂洗的膜在冷冻干燥机中冻干后，将冻干后的膜切成边长4-30mm×4-30mm的膜块，备用；
(2)固定化酶的制备
以细菌纤维素膜块为载体采用物理吸附法或吸附～交联法制备固定化酶。
所述步骤(2)中物理吸附法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素膜块0.002～0.5g并使其浸没，轻微振荡3～5min，在4℃条件下吸附0.5～24h(优选6-24h)，取出细菌纤维素膜块，用pH4.8～9.0的缓冲溶液漂洗1～2次，吸干膜块表面水分，4℃冰箱保存。
所述步骤(2)中吸附～交联法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素膜块0.002～0.5g并使其浸没，轻微振荡3-5min，在4℃条件下吸附0.5～24h(优选6-24h)，以1g纤维素膜：25～200mL戊二醛溶液的比例加入质量体积百分比为25％的戊二醛溶液5-15mL，20-30℃条件下交联反应1-3h，取出细菌纤维素膜块，用pH4.8～9.0的缓冲溶液漂洗1～2次，吸干膜块表面水分，4℃冰箱保存。
有益效果
(1)本发明提供了一种新型酶固定化技术。本发明能高效吸附生物酶，最大限度地保持酶的活性，且安全环保，方法简单，易于操作，可控性强。与采用化学交联的方法相比，初始酶活保留率高出约25％。
(2)球状细菌纤维素的生产并将其作为酶固定化的载体材料，拓宽了细菌纤维素的应用领域。
(3)细菌纤维素材料纯度高，生物稳定性强。
(4)细菌纤维素材料传质性能好，有利于实现酶的高效催化。
(5)细菌纤维素材料在自然界的生物可降解性好，生物相容性好。
(6)细菌纤维素小球固定化酶可以用于柱型生物反应器，而纤维素膜固定化酶则可以用于膜生物反应器。
(7)纤维素膜用于固定化酶在尺寸和形状的控制上比纤维素小球更方便，操作更简单容易，结构上也更均匀。
附图说明
图1为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素小球吸附法固定化漆酶(■)的最适反应温度。
图2为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素小球吸附法固定化漆酶(■)最适反应pH值。
图3为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素小球吸附法固定化漆酶(■)的热稳定性。
图4为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素小球吸附法固定化漆酶(■)的pH稳定性。
图5为本发明的吸附法(◆)和吸附-交联法(■)细菌纤维素小球固定化漆酶的重复使用稳定性。
图6为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素膜吸附法固定化漆酶(■)的最适反应温度。
图7为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素膜吸附法固定化漆酶(■)的最适反应pH值。
图8为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素膜吸附法固定化漆酶(■)的温度稳定性。
图9为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素膜吸附法固定化漆酶(■)的pH稳定性。
图10为本发明细菌纤维素膜吸附法固定化漆酶的重复使用稳定性。
图11为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素膜吸附-交联法固定化漆酶(■)的最适反应温度。
图12为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素膜吸附-交联法固定化漆酶(■)的最适反应pH值。
图13为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素膜吸附-交联法固定化漆酶(■)的温度稳定性。
图14为游离漆酶(▲)和本发明细菌纤维素膜吸附-交联法固定化漆酶(■)的pH稳定性。
图15为本发明细菌纤维素膜吸附-交联法固定化漆酶的重复使用稳定性。
图16为游离酶(▲)和本发明纤维素膜吸附法固定化葡萄糖氧化酶(■)的最适反应温度。
图17为游离酶(▲)和本发明纤维素膜吸附法固定化葡萄糖氧化酶(■)的最适反应pH。
图18为游离酶(▲)和本发明纤维素膜吸附法固定化葡萄糖氧化酶(■)的温度稳定性。
图19为游离酶(▲)和本发明纤维素膜吸附法固定化葡萄糖氧化酶(■)的pH稳定性。
图20为固定化葡萄糖氧化酶的重复使用稳定性。
图21为游离酶(▲)和本发明纤维素膜吸附-交联法固定化葡糖氧化酶(■)最适反应温度。
图22为游离酶(▲)和本发明纤维素膜吸附-交联法固定化葡糖氧化酶(■)最适反应pH。
图23为游离酶(▲)和本发明纤维素膜吸附-交联法固定化葡糖氧化酶(■)温度稳定性。
图24为游离酶(▲)和本发明纤维素膜吸附-交联法固定化葡糖氧化酶(■)pH稳定性。
图25为吸附-交联法固定化葡萄糖氧化酶的重复使用稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下为以细菌纤维素小球为载体制备固定化酶的相关实施例
实施例1
从醋酸杆菌斜面上挑取1环单菌落接种于100mL无菌种子培养基中，所述的种子培养基包含(质量百分比)：葡萄糖2.0％，酵母粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，Na2HPO4·12H2O0.27％，柠檬酸0.115％，pH5.0，在30℃，130rpm条件下培养12h。以6％的接种量将种子液接入到装有300mL无菌发酵培养基的500mL锥形瓶中。所述的发酵培养基包含(质量百分比)：葡萄糖2.0％，酵母粉0.5％，胰蛋白胨0.3％，Na2HPO4·12H2O 0.27％，柠檬酸0.115％，pH5.0；30℃，110rpm条件下培养72h后，在培养基中生成许多细菌纤维素小球。将培养基倾滤后取出纤维素小球，用去离子水反复冲洗，除去小球表面培养基及杂质，再将小球浸泡于0.1％的NaOH溶液中，80℃处理60min，去除纤维素小球中的菌体及残留培养基至乳白色半透明；然后用去离子水冲洗并加入少量0.1％的醋酸中和小球中残留的NaOH，静置过夜后再用去离子水冲洗细菌纤维素小球；将小球表面液体用滤纸吸干，逐个用液氮速冻或置于低温冰箱中冷冻，然后在冷冻干燥机中干燥，得到细菌纤维素小球载体。
固定化漆酶的制备
吸附法：向50mL烧杯中加入酶活单位300U/L的漆酶酶液10mL，加入0.2g冻干的细菌纤维素小球并使其浸没，轻微振荡3～5min，在4℃条件下吸附24h，取出细菌纤维素小球，用200mM、pH5.2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液漂洗1～2次，吸干小球表面水分，4℃冰箱保存备用。
吸附-交联法：向50mL烧杯中加入酶活单位300U/L的漆酶酶液10mL，加入0.2g冻干的细菌纤维素小球并使其浸没，轻微振荡3～5min，在4℃条件下吸附24h，加入10mL戊二醛溶液，30℃、磁力搅拌条件下交联反应1～3h，取出细菌纤维素小球，用pH4.8～5.2的醋酸钠缓冲溶液漂洗1～2次，吸干小球表面水分，4℃冰箱保存。
酶的表征如下：
(a)游离酶和固定化酶的最适反应温度：
以0.4mM 2，2′-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)，简称ABTS)为底物，在50mM醋酸钠缓冲溶液中(pH＝5.2)测定漆酶活力，以确定固定化漆酶和游离漆酶的最适反应温度，结果如图1所示。从图1中相对酶活力的变化(以同组实验中最高酶活力为100％)可知，当反应温度＜60℃时，固定化酶的活力随着反应温度的升高而增大，当反应温度＞60℃时，固定化酶的活力有所下降，其最佳反应温度(60℃)比游离酶(50℃)提高了10℃。
(b)游离酶和固定化酶的最适反应pH值：
以0.4mMABTS为底物，在200mM的柠檬酸缓冲液中，50℃条件下测定漆酶活力，以确定游离酶和固定化酶的最适反应pH。以每组最高酶活力为100％作图，结果如图2所示。从图中可知，游离酶和固定化酶的最适反应pH值都为3.5，在pH3.5-5.5之间，pH值对固定化酶的影响要小于对游离酶的影响。
(c)游离酶和固定化酶的热稳定性：
将游离酶酶液和固定化酶分别在30～70℃水浴中保持30min后，以0.4mMABTS为底物，在50℃条件下测定漆酶活力，确定游离酶和固定化酶的温度稳定性。以每组的最高酶活力为100％，结果见图3。由图可知，游离酶在40℃以内较为稳定，而固定化酶在50℃以内较稳定，比游离酶提高了10℃。
(d)游离酶和固定化酶的pH稳定性：
将游离酶和固定化酶分别置于含0.2M不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液和0.4mM ABTS底物的反应液中，30℃下保温30min后，以0.4mM ABTS为底物，在50mM醋酸钠缓冲溶液(pH5.2)中，50℃条件下测定漆酶活力，以确定游离酶和固定化酶的pH稳定性。以每组的最高酶活力为100％，其结果见图4。从图中可以看出，游离酶在pH5时较稳定，其酶活在pH4～7的范围内保持了90％以上的相对活力；固定化酶在pH4时较稳定，其酶活在pH3～6的范围内保持80％以上的相对活力。固定化酶的酸碱稳定性较游离酶向酸性方向移动了1个pH单位。
(e)固定化酶的重复使用稳定性：
在50mL小烧杯中，加入10mL去离子水、5mL醋酸钠缓冲溶液(200mM，pH5.2)和5mL ABTS(2mM)，磁力搅拌子缓慢搅拌，当温度达到50℃后加入0.2g固定化酶。按照(d)中酶活力测定方法测定固定化酶酶活。20min后，取出固定化酶，用醋酸钠缓冲溶液冲洗1～2次，再用去离子水反复冲洗，充分洗涤反应底物和产物。用滤纸吸干残留水分并重复以上操作，直到得到重复使用7次后的固定化酶。测定酶活力的结果见图5，以固定化漆酶第一次使用所测酶活为100％计，其它所测的酶活以其为基准计算相对酶活。由图5可知，两种固定化酶经多次重复使用后，都具有较好的稳定性，在经过4次使用后，其相对酶活力仍高于35％。
以下为以细菌纤维素膜块为载体制备固定化酶的相关实施例
实施例2
细菌纤维素膜块载体的制备
从活化的斜面菌种上挑取1环单菌落接种于100mL无菌的种子培养基中，30℃，100-200rpm条件下培养12h后作为种子液所述的种子培养基包含(质量百分比)：甘露醇2.5％，酵母粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，pH5.0。以4-10％接种量将液体种子转接至发酵培养基中，所述的发酵培养基包含(质量百分比)：甘露醇2.5％，酵母粉0.5％，胰蛋白胨0.3％，pH5.0；25-30℃，静置培养5-14d，倾滤，收集细菌纤维素膜。将发酵收集得到的细菌纤维素膜用0.1％的NaOH在80℃水浴中处理至膜呈乳白色半透明，用去离子水漂洗3-5次，收集，用0.1％的醋酸中和膜内残留的碱液，静置过夜，用去离子水漂洗2-3次，滤纸吸干膜表面水分，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻，然后在冷冻干燥机中干燥，将冻干后的膜切成边长4-30mm的膜块，备用。
其中，菌种选自醋杆菌、木醋杆菌、产醋醋杆菌、醋化杆菌、许氏醋酸菌、恶臭醋酸菌、奥尔兰醋杆菌、弯醋杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、葡萄糖氧化杆菌、农杆菌、根瘤菌、洋葱假单胞菌、八叠球菌、椰毒假单胞菌、空肠弯曲菌中的一种或几种。
实施例3
固定化漆酶的制备(单纯吸附固定)
向50mL烧杯中加入pH5.0、酶活单位，1000U/L的漆酶酶液10mL，加入0.2g冻干的细菌纤维素膜块并使其浸没，轻微振荡3-5min，在4℃条件下吸附24h，取出细菌纤维素膜块，用200mM、pH5.2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液漂洗1-2次，吸干膜块表面水分，4℃冰箱保存备用。
酶经固定化后与游离酶相比具有如下特征：从图6-10中相对酶活力(同组实验中以酶活力最高的为100％，其余的固定化酶或游离酶的活力与之相比，以百分数表示)的变化可知，固定化酶的最适反应温度为60℃，较游离酶的最适反应温度50℃提高了10℃。固定化酶和游离酶的最适反应pH均为3.5，但在pH 3.5-5.5之间，固定化酶较游离酶受pH的影响小。游离酶在40℃较为稳定，而固定化酶在50℃较稳定，比游离酶提高了10℃。游离酶在pH5时较稳定，其酶活在pH4-7的范围内保持90％以上的相对活力；固定化酶在pH4时较稳定，其酶活在pH3-6的范围内保持80％以上的相对活力。固定化酶的酸碱稳定性较游离酶向酸性方向移动了1个单位。吸附法固定化漆酶在前4次重复使用中具有较好的稳定性。
实施例4
固定化漆酶的制备及表征(吸附联合戊二醛交联)
向50mL烧杯中加入pH5.0、酶活单位，1000U/L的漆酶酶液10mL，加入0.2g冻干的细菌纤维素膜块并使其浸没，轻微振荡3-5min，在4℃条件下吸附24h，加入5-15mL 2.5％的戊二醛溶液，30℃条件下交联反应1h。取出细菌纤维素膜块，用200mM、pH5.2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液漂洗1-2次，吸干膜块表面水分，4℃冰箱保存备用。
酶经固定化后与游离酶相比具有如下特征：从图11-15中相对酶活力(同组实验中以酶活力最高的为100％，其余的固定化酶或游离酶的活力与之相比，以百分数表示)的变化可知，固定化酶的最佳反应温度(60℃)比游离酶(50℃)提高了10℃。固定化酶的最适反应pH(4.0)比游离酶(3.0)向碱性方向移动了1个单位。在50-70℃范围内，固定化酶的稳定性较游离酶高。游离酶在pH5时较稳定，固定化酶在pH4时较稳定，固定化酶的酸碱稳定性较游离酶向酸性方向移动了1个单位。吸附-交联法固定化漆酶在经过6次重复反应使用后其相对酶活力高于70％。具有较好的重复利用效果。
实施例5
固定化葡萄糖氧化酶的制备及表征(单纯吸附固定)
向50mL烧杯中加入pH5.0、酶活单位1700U/L的葡萄糖氧化酶的酶液10mL，加入0.2g冻干的细菌纤维素膜块并使其浸没，轻微振荡3-5min，在4℃条件下吸附24h。取出细菌纤维素膜块，用200mM、pH7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液漂洗1-2次，吸干膜块表面水分，4℃冰箱保存备用。
酶经固定化后与游离酶相比具有如下特征：从图16-20中相对酶活力(同组实验中以酶活力最高的为100％，其余的固定化酶或游离酶的活力与之相比，以百分数表示)的变化可知，酶经吸附固定化后，其最适反应温度较游离酶提高了5℃，随着温度的升高，游离酶酶活迅速下降，而固定化酶在70℃仍保持39％的相对酶活力。固定化酶的最适反应pH较游离酶向酸性方向移动了2个单位，为pH5.0。酶经吸附固定化后，其温度稳定性较游离酶得到了较大提高，在40℃仍保持85％以上的酶活力。其酸碱稳定性也有一定程度的提高，游离酶和固定化酶在pH6.0的条件下最稳定，但固定化酶在pH3-8范围内的酸碱稳定性均略高于游离酶。固定化酶具有一定的重复使用效果，在使用3次后活力有一定下降。
实施例6
固定化葡萄糖氧化酶的制备及表征(吸附联合戊二醛交联)
向50mL烧杯中加入pH5.0、酶活单位1700U/L的葡萄糖氧化酶的酶液10mL，加入0.2g冻干的细菌纤维素膜块并使其浸没，轻微振荡3-5min，在4℃条件下吸附24h，加入5-15mL 2.5％的戊二醛溶液，30℃条件下交联反应1h。取出细菌纤维素膜块，用200mM、pH7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液漂洗1-2次，吸干膜块表面水分，4℃冰箱保存备用。
酶经固定化后与游离酶相比具有如下特征：从图21-25中相对酶活力(同组实验中以酶活力最高的为100％，其余的固定化酶或游离酶的活力与之相比，以百分数表示)的变化可知，酶经吸附-交联固定化后，其最适反应温度较游离酶提高了5℃，随着温度的升高，游离酶酶活迅速下降，而固定化酶在60℃仍保持50％以上的酶活力。固定化酶的最适反应pH为6.0，较游离酶向酸性方向移动了1个单位。酶经吸附-交联固定化后，其温度稳定性得到了较大提高，在60℃仍保持45％以上的酶活力。其酸碱稳定性有一定程度的提高，游离酶在pH6.0的条件下最稳定，而固定化酶在pH5.0条件下最稳定，较游离酶向酸性方向移动了一个单位。固定化酶在经过6次重复使用后其相对酶活力仍高于70％，具有较好的重复利用效果。
实施例7
细菌纤维素膜块固定化漆酶的影响
以实施例1中所制备的细菌纤维素膜块为材料，按照实施例2的方法固定化漆酶，所不同的是固定化所用的细菌纤维素膜块大小不同、膜块数目不同、吸附时间不同、加酶量不同。从表1-4中可以看出，随着膜块尺寸的增大，固定化酶的活力逐渐减小，膜的尺寸大小为7mm×7mm时，固定化酶活力为9.70U/g载体，蛋白载量此时最大，为3.20mg蛋白/g载体。随着膜块数目(即膜块相对表面积)的增加，固定化酶的活力逐渐增大，当膜块数目为4时，固定化酶活力达9.77U/g载体，蛋白载量此时达到最大。膜块数目为3时，比活力最高为2.63U/mg蛋白。随着吸附时间的增加，固定化酶活力逐渐增大，在4小时后增加较为缓慢，在4小时时固定化酶的比活力达到最大，为0.47U/mg蛋白。随着加酶量的增加，固定化酶活力逐渐增大，在加酶量超过1.5mL后，酶活增加较缓慢，在加酶量为0.5mL时，比酶活最大，为4.43U/mg蛋白。
表1.细菌纤维素膜块大小对固定化漆酶的影响
表2.细菌纤维素膜块相对表面积对固定化漆酶的影响
表3.吸附时间对细菌纤维素固定化漆酶的影响
表4.加酶量对细菌纤维素固定化漆酶的影响
实施例8
细菌纤维素膜块对固定化葡萄糖氧化酶的影响
以实施例1中所制备的细菌纤维素膜块为材料，按照实施例3的方法固定化葡萄糖氧化酶，所不同的是固定化所用的细菌纤维素膜块大小不同、膜块数目不同、吸附时间不同、加酶量不同。从表5-6中可以看出，随着膜块尺寸的增大，固定化酶的活力逐渐减小，比活力先增加后减小，在膜块尺寸为15mm×15mm时比活力达到最大，为28.84U/mg蛋白。随着膜块数目(相对表面积)的增加，固定化酶活力逐渐增大，比活力逐渐减小，在膜块数目为4时，固定化酶活力为132.12U/g载体，比活力为43.60U/mg蛋白。随着吸附时间的增加，固定化酶活力先增大后减小，在吸附时间为6小时时，固定化酶活力最大为415.03U/g载体。比活力在吸附时间为4小时时达到最大，为181.89U/mg蛋白。随着加酶量的增加，固定化酶活力逐渐增大，当加酶量大于1mL后，酶活增加缓慢。比活力先增大后减小，在加酶量为0.75mL时达到最大，为107.18U/mg蛋白。
表5.细菌纤维素膜块大小对固定化葡萄糖氧化酶的影响
表6.细菌纤维素膜块相对表面积对固定化葡萄糖氧化酶的影响
表7.吸附时间对细菌纤维素膜块固定化葡萄糖氧化酶的影响
表8.加酶量对细菌纤维素膜块固定化葡萄糖氧化酶的影响
Claims (6)
1.一种以球形细菌纤维素为载体制备固定化酶的方法，包括：
(1)细菌纤维素小球的制备
将活化的斜面菌种接入pH4.8～5.2的种子培养基，在25～30℃、100～200rpm条件下培养12～16h制得液体种子，以体积百分比为4～10％接种量将液体种子转接至pH4.8～5.2的发酵培养基中，每500mL锥形瓶中含有200～300mL发酵培养基，25～30℃，80～200rpm条件下培养48～96h，倾滤，得细菌纤维素小球；
所述的菌种选自醋杆菌、木醋杆菌、产醋醋杆菌、醋化杆菌、许氏醋酸菌、恶臭醋酸菌、奥尔兰醋杆菌、弯醋杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、葡萄糖氧化杆菌、农杆菌、根瘤菌、洋葱假单胞菌、八叠球菌、椰毒假单胞菌、空肠弯曲菌中的一种或几种；
所述的种子培养基，按重量百分比，包含：葡萄糖2.0％，酵母粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，Na2HPO4·12H2O 0.27％，柠檬酸0.115％。
所述的发酵培养基，按重量百分比，包含：葡萄糖2.0％，酵母粉0.5％，胰蛋白胨0.3％，Na2HPO4·12H2O 0.27％，柠檬酸0.115％。
(2)细菌纤维素小球的处理
将发酵收集得到的细菌纤维素小球用质量分数为0.1％的NaOH在80～90℃水浴中处理30～120min，用去离子水漂洗3～5次，收集，用体积分数为0.1％的醋酸中和小球内残留的碱液，静置12～24h，用去离子水漂洗2～3次，在水中保持其球状形态，将小球取出，吸干表面水分，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻，然后在冷冻干燥机中干燥后获得白色纤维素小球；
(3)细菌纤维素小球固定化酶的制备
以细菌纤维素小球为载体采用物理吸附法或吸附～交联法制备固定化酶。
2.根据权利要求1所述的一种以球形细菌纤维素为载体制备固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中物理吸附法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素小球0.05～0.4g并使其浸没，轻微振荡3～5min，在4℃条件下吸附6～24h，取出细菌纤维素小球，用缓冲溶液漂洗1～2次，吸干小球表面水分，4℃冰箱保存。
3.根据权利要求1所述的一种以球形细菌纤维素为载体制备固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中吸附～交联法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素小球0.05～0.4g并使其浸没，轻微振荡3～5min，在4℃条件下吸附6～24h，以1g纤维素小球：25～200mL戊二醛溶液的比例加入质量体积百分比为25％的戊二醛溶液，20～30℃搅拌条件下交联反应1～3h，取出细菌纤维素小球，用缓冲溶液漂洗1～2次，吸干小球表面水分，4℃冰箱保存。
4.一种以细菌纤维素膜块为载体制备固定化酶的方法，包括
(1)将细菌纤维素膜用质量分数为0.1％的NaOH在80～90℃水浴中处理30～120min至膜呈乳白色半透明，用去离子水漂洗3-5次，收集，用体积分数为0.1％的醋酸中和膜内残留的碱液，静置12～24h，用去离子水漂洗2-3次，滤纸吸干膜表面水分，将膜切成膜块，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻，然后在冷冻干燥机中干燥，备用；或将去离子水漂洗的膜在冷冻干燥机中冻干后，将冻干后的膜切成膜块，备用；
(2)固定化酶的制备
以细菌纤维素膜块为载体采用物理吸附法或吸附～交联法制备固定化酶。
5.根据权利要求4所述的一种以细菌纤维素膜块为载体制备固定化酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)中物理吸附法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素膜块0.002～0.5g并使其浸没，轻微振荡3～5min，在4℃条件下吸附0.5～24h，取出细菌纤维素膜块，用缓冲溶液漂洗1～2次，吸干膜块表面水分，4℃冰箱保存。
6.根据权利要求4所述的一种以细菌纤维素膜块为载体制备固定化酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)中吸附～交联法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素膜块0.002～0.5g并使其浸没，轻微振荡3-5min，在4℃条件下吸附0.5-24h，以1g纤维素膜：25～200mL戊二醛溶液的比例加入质量体积百分比为25％的戊二醛溶液5-15mL，20-30℃条件下交联反应1-3h，取出细菌纤维素膜块，用缓冲溶液漂洗1～2次，吸干膜块表面水分，4℃冰箱保存。
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