CN103224926A - 一种制备固定化脂肪酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备固定化脂肪酶的方法。该方法，利用耦合固定化技术即吸附、交联及包埋三种结合的方法对脂肪酶进行固定化。耦合技术的应用，克服了吸附法带来的脂肪酶易脱落，循环利用率差的缺点，具备交联法的高结合力及包埋法的高酶活回收的优点，使得结合于载体的脂肪酶牢牢地固定化于载体，提高重复循环利用率及酶活性。本工艺制备的固定化酶用于酯化，转酯，酯水解，不但转化率可达到90%以上，反应时间缩短，重复利用率达到100次以上，酶活降低≤5%，具有工业应用的前景。

Description

一种制备固定化脂肪酶的方法

技术领域

本发明涉及制备固定化脂肪酶的方法，具体涉及利用耦合固定化技术即吸附、交联及包埋三种结合的方法对脂肪酶进行固定化的方法。

背景技术

脂肪酶(Lipase El3．1，1．3)是水解脂肪的酶，它可以水解天然油脂，产生脂肪酸及甘油的酶。由于脂肪酶水解脂肪具有高效、反应条件温和、无毒等优点，并在洗涤剂、制革、食品、纺织及轻工业等领域具有广泛的用途。作为一种新型的酶制剂，脂肪酶已成为世界酶制剂市场上重要的品种。

液体的脂肪酶水解油脂存在与底物接触不充分导致水解不完全，反应时间长，同时使用后的脂肪酶不能回收利用，增加使用成本。酶的固定化技术有利于酶的回收和再利用，减少酶的损耗，为生产节约成本。迄今为止开发的固定化技术不能普遍适用于每一种酶，所以要要根据酶的应用目的和特性，开发固定化方法。脂肪酶的固定化方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等4种方法，广泛使用的固定化方法为吸附的方法。

专利EP424130利用乙醇预处理疏水载体后进行脂肪酶的吸附得到的固定化酶活性及稳定性较高。

专利US5156963利用聚甲基丙烯酸树脂进行吸附，用于转酯，酯化，酯水解但反应时间长（8h以上）。

专利US5182201将脂肪酶吸附于弱酸离子交换树脂，添加卵磷脂增加活性。固定化酶的半衰期为36-126h。

专利US5342768利用大孔无机载体颗粒（含有至少60%硅）进行吸附，用于转酯，酯化，酯水解，但是并未达到90%以上的转化率。

专利US5773266对比了表面活性剂对脂肪酶固定于疏水载体的影响，用于酯水解或者酯化，但活性不高。

专利US5908769将脂肪酶固定于丙烯酸树脂，能够使短链醇与短链酸进行反应。

专利US6605452将脂肪酶表面包埋表面活性剂固定于不溶性载体上，具有较高的酯化，转酯及内部酯交换，重复5次，活性损失。

专利US7238504将脂肪酶通过吸附固定于载体，利用油脂调整固定化酶的含水量，处理时间较长（18-24h），酯化活力比冷冻干燥得到的固定化酶高。达到DG+TG=70%需要7h。

专利CN101280297A在脂肪酶液里加入印记分子（脂肪酸或者类似物）吸附于大孔树脂上后，冷冻干燥后，利用界面激活技术处理，再次冷冻干燥，获得固定化脂肪酶应用于生物柴油的制备，反应时间比较长。

专利CN101712951A将脂肪酶吸附于大孔离子交换树脂，用于转化阿魏酸酯，但是反应时间比较长达6-8天。

专利101736000A利用有机化合物处理固定化酶，提高固定化酶的稳定性，半衰期延长3-8h，催化大豆油转酯化反应延长使用3-6批。

专利CN101278047A将脂肪酶、多官能胺和交联剂吸附在粒状多孔载体上来对脂肪酶进行固定化，未提到固定化酶的循环利用率。

通过以上专利对比分析可以看出，通过吸附法得到的固定化脂肪酶活性、稳定性及半衰期明显比游离脂肪酶提高，但是固定化后脂肪酶易从载体上脱落，循环利用率不高，半衰期较短，不适合大规模工业生产。

少数采用其他的方法进行固定化，例如，专利US5445955通过多种方式将脂肪酶吸附于多孔载体，体系存在脂肪酸或者脂肪酸衍生物中进行固定化，经实验验证利用环氧基对脂肪酶进行固定化后脂肪酶的转酯反应活性最高；US5569594将脂肪酶通过环氧基或者叔胺基固定于载体上，转酯率24h达到99.8%。通过共价结合的方式虽然能够提高转酯活力，但是反应时间比较长，并且固定化酶制备成本比较昂贵，这也限制了固定化酶的工业应用。

专利US5387514是将脂肪酶固定于疏水载体，后用交联剂进行交联，得到的固定化酶能够对乙醇进行酰化作用，5天转化率达到50%。专利US5232843将脂肪酶固定于疏水或者离子交换树脂，后用酪蛋白酸钠进行包埋，得到的固定化酶酯化与酯交换反应活性比较高，但是需要反应2-5天。虽然耦合技术的应用可以克服单一固定化技术的缺点，但是还是需要将其有机的结合起来，才能发挥各种固定化技术的优势，得到适合工业化的固定化脂肪酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于脂肪酶的工业固定化的简单有效的方法。本发明的方法通过有机结合吸附、交联与包埋的三种方法制备固定化脂肪酶，其与已知的固定化方法获得的固定化酶产物相比稳定性更高，应用性更好，适合工业生产用。

本发明的固定化脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：

a)制备含脂肪酶、水溶性蛋白和糖类的液体介质A，其中按100g液体介质A来计脂肪酶：水溶性蛋白：糖类的比例为100000-500000U:0-0.2g：0.01-0.5g；

b)制备含交联剂的液体介质B，其中交联剂的质量百分含量为0.1-1.5%；

c)制备含包埋剂的液体介质C，其中包埋剂的质量百分含量为0.01-0.1%；

d)将液体介质A和液体介质B引入至经预处理的粒状多孔载体上，过滤除去液体，得固体产物；

e)将液体介质C引入至d）的固体产物中，过滤除去液体，剩余物经干燥后得固定化脂肪酶；

所述步骤d)中液体介质A：液体介质B：粒状多孔载体的质量比优选为8-10:1:1，更优选为10:1:1，液体介质A和液体介质B的引入顺序为任意或同时；

所述步骤e）中按质量比液体介质C：固体产物的质量比优选为2-5:1，更优选为5:1；

所述液体介质A、液体介质B、液体介质C是水溶液。

本发明的技术方案中，所述脂肪酶优选来源于南极假丝酵母（C.Antarctica）、产碱假单胞菌（P.pseudoalcaligenes）、曼赫根毛霉（R.miehei）。

本发明的技术方案中，所述水溶性蛋白质优选为牛血白蛋白、乳清蛋白、酪蛋白酸钠、明胶中的一种。

本发明的技术方案中，所述糖类优选为葡萄糖、果糖、海藻糖、半乳糖、蔗糖中的一种。

本发明的技术方案中，所述交联剂优选为聚乙烯亚胺，碳化二亚胺、聚丙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、戊二醛、丁二醛、对苯二醛中的一种。

本发明的技术方案中，所述包埋剂优选为阿拉伯胶、海藻酸钙、聚乙二醇、聚乙烯醇、酪蛋白酸钠和明胶中的一种。

本发明的优选技术方案中，所述粒状多孔载体的粒径为50-1000um，更优选150-650um，更优选300-650um；颗粒孔径为10nm-1um，优选为50-200nm。

所述粒状多孔载体可以为无机或者有机材料的载体，优选高分子有机合成材料，更优选为树脂类高分子材料，其中优选AmberliteXAD761、Amberlite XAD7HP、Amberlite XAD16、Amberlite XAD1600、ES-1环氧树脂。

本发明的技术方案中，步骤d)中所述的液体介质A和液体介质B的引入方法为：在连续混合器中加入粒状多孔载体，再加入步骤液体介质A和液体介质B，在20-30℃,50-120rpm，搅拌6-24小时，过滤除去液体即可；步骤e)中所述的液体介质C的引入方法为：将液体介质C加入到所述步骤d）得到的固体产物中，在20-30℃,50-120rpm，搅拌2-10小时，过滤除去液体即可。

本发明的技术方案中，步骤e)所述的干燥方法为室温干燥或者在10-50℃烘箱干燥，干燥至剩余物含水量为5-10%。

本发明的制备方法中，将含脂肪酶、水溶性蛋白以及糖类化合物的液体介质吸附于载体，使水溶性蛋白替代脂肪酶吸附于载体，以此节省脂肪酶固定化的成本，糖类化合物通过分子间作用力增加了酶分子空间结构的热稳定性，制备得到的固定化脂肪酶经干燥后酶活性没有损失，增加重复回收使用的次数，减少了以往的方法中冷冻干燥带来的高成本；在交联剂存在下进行脂肪酶的吸附(吸附于载体)，使得交联剂中的醛基或者亚胺基一方面与脂肪酶的氨基结合，另一方面与载体中的基团发生反应，这样交联剂将脂肪酶连接至载体上，不易脱落，再加入适当浓度的包埋剂，使吸附的脂肪酶更紧密的结合于载体上，使其不易泄露，增加酶活性，提高重复使用次数。通过本发明方法制备得到的固定化酶比现有的固定化酶具备更高的稳定性及工艺利用价值。

本发明中，所述液体介质的pH为4-11。

本发明中，在含有脂肪酶的液体介质中所述的脂肪酶，可以通过纯化产脂肪酶的上述菌株的培养液得到的浓缩液，也可以为溶于水性介质的比较纯的脂肪酶。

在本发明的具体实施方式中，载体中液体介质的引入方法具体为：可以在加入含交联剂的液体介质之前，将含脂肪酶、水溶性蛋白和糖类的液体介质加入至粒状多孔载体；也可以先将含交联剂的液体介质加入至粒状多孔载体中，然后加入含脂肪酶、水溶性蛋白和糖类的液体介质；也可以将两种液体介质同时加入至粒状多孔载体中。

在本发明的具体实施方式中，粒状多孔载体在使用之前需要进行预处理，预处理方法不予特别限定，可以根据载体所附的说明书或本领域技术人员可以根据现有技术和公知常识选择能够实现本发明技术效果的现有技术中的任何处理方法对载体进行预处理。

本发明的另一个目的是提供用上述方法制备的固定化脂肪酶。本发明的方法制备的固定化脂肪酶，稳定性高，可以多次重复使用，降低成本，具有很高的工业利用价值，实验表明本发明的固定化脂肪酶，在共轭亚油酸甲酯的水解反应中，重复回收次数为100次时，其水解率也高达90%。

本发明的又一目的是提供用上述方法制备的固定化脂肪酶在脂肪酸酯的酯水解反应或游离脂肪酸的酯化反应中的应用。其中所述脂肪酸酯可以为脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸三甘酯。

本发明的有益效果：

①本发明的固定化脂肪酶的制备方法采用有机结合吸附、交联及包埋三种固定化方法，得到的固定化脂肪酶与其它的只用到其中一种或者两种的固定化技术相比，酶的重复循环利用率及酶活性均大幅提高。

②本发明利用价格低廉的水溶性蛋白吸附于载体，部分替代脂肪酶，使得固定化成本大大降低，能够满足工业化生产的应用。

③本发明在制备在酶液中添加糖类物质，通过分子间作用力增加酶分子空间结构的热稳定性，制备得到的固定化脂肪酶干燥后活性没有损失，减少了冷冻干燥带来的高成本。

④本发明的方法制备的固定化脂肪酶，可以用于有机化合物的酯化反应或酯水解反应，酯化及酯水解的效率可以达到90%以上，反应时间缩短，重复利用率达到100次以上，酶活降低≤5%，具有很高的工业应用的前景。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

（1）称取10g大孔离子交换树脂（Amberlite XAD761），加入10ml无水乙醇浸泡2h，过滤弃去无水乙醇，用纯净水冲洗净树脂中残留的无水乙醇，得活化大孔离子交换树脂(含水量70%)；

（2）将来自产碱假单胞菌（P.pseudoalcaligenes）的液体脂肪酶（10000U/g）20g，加入2.7g磷酸氢二钾、搅拌溶解至完全，用10%的NaOH水溶液调pH至8.0±0.5,用纯净水稀释至100g，后加入100mg葡萄糖,搅拌溶解，得脂肪酶酶液；

（3）1%的交联剂配制：10ml戊二醛溶液（50%）加纯净水稀释至500ml；

（4）连续混合器中加入步骤（1）得到的溶剂处理大孔树脂10g、在步骤（3）得到的1%交联剂溶液10ml与在步骤（2）得到的脂肪酶酶液100g,在25℃、120rpm下搅拌12h，过滤，弃去滤液，得到固体产物；

（5）在步骤（4）得到的固体产物中加入50ml0.1%聚乙烯醇水溶液，在25℃、120rpm下搅拌2h，过滤，弃去滤液，剩余物在室温晾干6小时至含水量为5%，得固定化脂肪酶。

采用聚乙烯醇-橄榄油乳化法（参照轻工行业标准GB/T23535-2009中所述的方法）测定上述制备的固定化脂肪酶的活力，经计算得到制备得到的固定化脂肪酶在干燥前后的酶活力无损失，具体酶活力为9000U/g，游离脂肪酶对橄榄油水解的最适温度为40℃，固定化后对橄榄油水解的最适温度提高到60℃，最适pH与游离脂肪酶酶同为9.4。

实施例2

（1）按照实施例1步骤（1）的方法得到活化大孔离子交换树脂；

（2）将来自产碱假单胞菌（P.pseudoalcaligenes）的液体脂肪酶（10000U/g）10g，加入0.02%的酪蛋白酸钠蛋白水溶液10g，搅拌均匀，加入2.7g磷酸氢二钾、搅拌溶解至完全，用10%的NaOH水溶液调pH至8.0±0.5,用纯净水稀释至100g，加入100mg葡萄糖,搅拌溶解，得脂肪酶酶液；

（3）1%的交联剂：10ml甲醛溶液（50%）加纯净水稀释至500ml。

（4）连续混合器中加入步骤（1）得到的溶剂处理大孔树脂10g、在步骤（3）得到的0.1%交联剂溶液10ml与在步骤（2）得到的脂肪酶酶液100g,在25℃、120rpm下搅拌12h,过滤，弃去滤液，得固体产物；

（5）在步骤（4）得到的固体产物中加入50ml0.1%酪蛋白酸钠水溶液，在25℃、120rpm下搅拌2h，过滤，弃去滤液，剩余物在室温晾干6小时至含水量为5%，得固定化脂肪酶。

用实施例1所述聚乙烯醇-橄榄油乳化法测定所述方法制备的固定化脂肪酶的酶活力：固定化脂肪酶活力为9000U/g，游离脂肪酶对橄榄油水解的最适温度为40℃，固定化后对橄榄油水解的最适温度提高到60℃，最适pH与游离脂肪酶同为9.4。

实施例3

（1）离子交换树脂（Amberlite XAD7HP）的处理方式同实施例1。

（2）将来自南极假丝酵母（C.Antarctica）的液体脂肪酶（10000U/g）10g，加入0.02%的牛血清白蛋白水溶液10g，搅拌均匀，加入2.7g磷酸氢二钾、搅拌溶解至完全，用10%的NaOH水溶液调pH至8.0±0.5,用纯净水稀释至100g，加入100mg海藻糖,搅拌溶解，得脂肪酶酶液；

（3）1%的交联剂溶液：10g聚碳化二亚胺溶液（50%）加纯净水稀释至500ml；

（4）连续混合器中加入步骤（1）得到的活化离子交换树脂10g、在步骤（3）得到的1%交联剂溶液10ml与在步骤（2）得到的脂肪酶酶液100g,在25℃、120rpm下搅拌12h,过滤，弃去滤液，得固体产物；

（5）在步骤（4）得到的固体产物中加100ml0.3%聚乙烯醇水溶液，在25℃、120rpm下搅拌2h，过滤，弃去滤液，剩余物在室温晾干6小时至含水量为5%，得固定化脂肪酶。

用实施例1所述聚乙烯醇-橄榄油乳化法测定所述方法制备的固定化脂肪酶的酶活力：固定化脂肪酶酶活力为10053U/g，游离脂肪酶对橄榄油水解的最适温度为40℃，固定化后对橄榄油水解的最适温度提高到60℃，最适pH与游离酶同为9.4。

实施例4

（1）按照实施例3的固定化脂肪酶制备步骤（1）-（4）的方法得到固体产物；

（2）在固体产物中加入1%阿拉伯胶水溶100ml，在25℃、120rpm下搅拌2h，过滤，弃去滤液，剩余物在室温晾干6小时至含水量为5%，得固定化脂肪酶。

用实施例1所述聚乙烯醇-橄榄油乳化法测定所述方法制备的固定化脂肪酶的酶活力：固定化脂肪酶酶活力为11202U/g，游离脂肪酶对橄榄油水解的最适温度为40℃，固定化后对橄榄油水解的最适温度提高到60℃，最适pH与游离酶同为9.4。

实施例5

利用实施例1、2、3或4制备得到的固定化脂肪酶，水解共轭亚油酸（CLA）甲酯，并测定CLA甲酯的水解率，具体方法为：称取0.5g固定化脂肪酶，添加入装有5g CLA甲酯（大连医诺生物有限公司生产）和20g水混合底物的反应瓶中，在50℃下，旋转蒸发反应4h，负压为0.95Mpa；反应结束后，反应终产物在3000rpm离心20min，测定油脂层的酸值，计算CLA甲酯的水解率，结果如表1。所述油脂层酸值的计算方法参见国标GB/T5530-2005所述的方法,CLA甲酯水解率计算公式为：酸值/2%。

固定化脂肪酶的反复回收使用及回收脂肪酶对CLA甲酯水解率的影响：用如下方法回收上述CLA甲酯水解终产物中的固定化脂肪酶，并按照上述方法水解CLA甲酯，测定CLA甲酯的水解率，结果如表2。

CLA甲酯水解终产物中的固定化脂肪酶的回收方法：水解反应结束后，利用200目的滤网过滤掉反应瓶中的油脂与水混合物，得到固体产物；固体产物用100ml无水乙醇进行浸泡20min,过滤掉无水乙醇后，室温进行干燥得到干燥回收固定化脂肪酶。

表1固定化脂肪酶对CLA甲酯水解率的影响

固定化脂肪酶	CLA甲酯水解率（%）
		实施例1	90%
实施例2	90%
		实施例3	99.5%

实施例4

97%

表2固定化脂肪酶反复回收使用次数及其对CLA甲酯水解率的影响

由表1和表2的结果可知，用本发明的方法制备的固定化脂肪酶对CLA甲酯的水解率达到90%以上，实施例4的固定化脂肪酶的CLA甲酯水解率高达97%；实施例1的固定化脂肪酶反复回收使用50次后，对CLA甲酯的水解率仍在90%，实施例2和实施例4的固定化脂肪酶反复回收使用100次后，其对CLA甲酯的水解率仍保持90%。

实施例6

利用实施例1、2、3、4的方法制备的固定化脂肪酶，进行共轭亚油酸（CLA）乙酯的合成实验，并测定CLA乙酯的合成效率，具体方法为：称取0.5g固定化脂肪酶，添加入装有5g CLA与8.3g的无水乙醇混合底物的反应瓶中，在40℃下，旋转蒸发反应3h，反应结束后，用旋转蒸发仪除掉反应产物中乙醇，对剩余产物进行酸值测定，计算CLA乙酯的合成效率，结果如表3。

所述酸值测定法参见国标GB/T5530-2005所述的方法；乙酯合成效率:（200-酸值）/2%。

表3固定化脂肪酶对CLA乙酯合成率的影响

固定化脂肪酶	CLA乙酯合成率（%）
		实施例1	90%
实施例2	90%
		实施例3	95%

实施例4

91%

由表3的结果可知，用本发明的方法制备的固定化脂肪酶催化CLA乙酯的合成率高达90%以上。

实施例7

利用诺维信的固定化脂肪酶（Novozmy435或Lipozyme TL IM）进行CLA甲酯水解实验（具体方法同实施例5）及CLA乙酯合成实验（具体方法同实施例6）。结果如下：Novozmy435对CLA甲酯水解率为95%,对CLA乙酯合成效率为90%；而Lipozyme TL IM对CLA甲酯水解率为50%,对CLA乙酯合成效率为89%。回收使用20次后，两种酶对CLA甲酯的水解率以及CLA乙酯合成效率均降低了20%左右。

Claims (10)

1.一种制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于包括如下步骤：

a)制备含脂肪酶、水溶性蛋白和糖类的液体介质A，其中按100g液体介质A来计脂肪酶：水溶性蛋白：糖类的比例为100000-500000U:0-0.2g：0.01-0.5g；

b)制备含交联剂的液体介质B，其中交联剂的质量百分含量为0.1-1.5%；

c)制备含包埋剂的液体介质C，其中包埋剂的质量百分含量为0.01-0.1%；

d)将液体介质A和液体介质B引入至经预处理的粒状多孔载体上，过滤除去液体，得固体产物；

e)将液体介质C引入至d）的固体产物中，过滤除去液体，剩余物经干燥后得固定化脂肪酶；

所述步骤d)中按质量比液体介质A：液体介质B：粒状多孔载体=8-10:1:1，液体介质A和液体介质B的引入顺序为任意或同时；

所述步骤e）中按质量比液体介质C：固体产物的=2-5:1；

所述液体介质A、液体介质B、液体介质C为水溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述脂肪酶来源于南极假丝酵母（C.Antarctica）、产碱假单胞菌（P.pseudoalcaligenes）、曼赫根毛霉（R.miehei）；所述水溶性蛋白为牛血白蛋白、乳清蛋白、酪蛋白酸钠、明胶中的一种；所述糖类为葡萄糖、果糖、海藻糖、半乳糖、蔗糖中的一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述交联剂为聚乙烯亚胺，碳化二亚胺、聚丙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、戊二醛、丁二醛、对苯二醛中的一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述包埋剂为阿拉伯胶、海藻酸钙、聚乙二醇、聚乙烯醇、酪蛋白酸钠和明胶中的一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述粒状多孔载体的粒径为50-1000um，颗粒孔径为10nm-1um。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述粒状多孔载体选自Amberlite XAD761、Amberlite XAD7HP、Amberlite XAD16、Amberlite XAD1600、ES-1环氧树脂。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d)中所述的液体介质A和液体介质B的引入方法为：在连续混合器中加入粒状多孔载体，再加入步骤液体介质A和液体介质B，在20-30℃,50-120rpm，搅拌6-24小时，过滤除去液体即可；步骤e)中所述的液体介质C的引入方法为：将液体介质C加入到所述步骤d）得到的固体产物中，在20-30℃,50-120rpm，搅拌2-10小时，过滤除去液体即可。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e)所述的干燥方法为室温干燥或者在10-50℃烘箱干燥，干燥至含水量为5-10%。

9.权利要求1-8的任一项所述的方法制备的固定化脂肪酶。

10.权利要求9所述的固定化脂肪酶在脂肪酸酯的酯水解反应或游离脂肪酸的酯化反应中的应用。