CN101278047A - 酶的固定化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在混合器设备或流化床设备中通过将酶、多官能胺和交联剂吸附在粒状多孔载体上来对酶进行固定化。
Description
发明领域
本发明涉及制备固定化酶产物的方法,和这样的固定化酶产物在基于酶的连续过程(enzyme based processes)中,诸如在有机合成中的用途。
发明背景
酶固定化涉及将酶产物固定在载体上,在该载体上此酶是固定的且仍是有功能的,而且由于该载体,所述酶未释放于所施加的溶剂。最常见的固定化酶是用于异构化反应的葡萄糖异构酶。
酶的工业用途常常受限于其高成本和快速的失活。为了提高酶在工业过程的经济可行性,一般将酶固定于基质上。固定化促进了酶的重复使用,且可影响酶的选择性和稳定性。固定化研究主要集中于增强酶到支持物(support)的转移的方法,和确保所转移的酶保持活性的方法。
为了实现高水平的酶吸收及最小的酶降解或失活,已尝试了大量不同的有机和无机的支持物基质和酶固定化技术。
广泛使用的酶固定化方法可称为共价交联方法,且其示例于US4,071,409(Messing等)。根据此专利的教导,对支持物介质改性或涂层以提供官能度(functionality),该官能度则能经交联试剂连接到酶的游离官能团。
在现有技术所述的很多工业固定化过程中,将载体或支持物材料置于柱状吸附容器内,并将含酶液体环流直至获得酶在载体上的充分吸附。在吸附步骤后,通过手动将酶-载体产物铲入托盘而将柱子腾空。然后通过将托盘在室温在真空下放置14-16小时的时间来干燥该产物。
EP 0216272描述了一种用多胺(polyamine)处理且与例如戊二醛反应的颗粒硅藻土,然后此硅藻土与酶反应而形成固定化酶。其是在柱式反应器的水溶液中制备的。
EP 0641859描述了一种用多胺处理的颗粒硅藻土载体,此外胺反应性材料与酶反应,该酶和载体接触以形成固定化酶。它是在柱内的水溶液中制备的。
US 4438196描述了一种与多胺反应的碳载体,此载体再与一反应物反应,最后和酶反应而形成固定化酶。
US4141857描述了一种酶支持物的制备,其是通过多孔载体与多胺再与一反应物反应而制得的。
其它固定化方法在WO 95/22606(Pedersen等)和WO 99/33964(Christensen等)中描述。
WO 95/22606描述了一种方法,其中使含酶液体与多孔硅石载体在挤压机(extruder)或粒化装置(granulation apparatus)中接触。
WO 99/33964公开了一种固定化方法,其中固定化是在流化床设备中制备的。
CA 2277371描述了一种通过如下将酶固定化的方法:将具有表面羟基的硅土支持物与含多醛的第一水溶液保温,随后使含酶的第二水溶液与修饰后的载体接触和最后从溶液中除去支持物。
EP 133531描述了一种用于通过如下来将酶固定化的方法:(a)引入包含酶和聚乙烯亚胺的水性介质和(b)将戊二醛和壳聚糖加入水性介质和随后从液体介质中移出交联产物。
在US 4,888,285(Nishimura等)中,通过在有机溶剂中与氨基硅烷衍生物反应而将硅胶改性。然后在戊二醛、丹宁酸和壳聚糖存在下将得到的胺化支持物与酶进行连接。
EP 0206687公开了一种固定化方法,其包括将酶分散体与聚氮杂环丁烷的预聚体及戊二醛混合,然后脱水。
已知固定化的酶用于多种工业应用中的连续酶反应,所述工业应用包括污水处理、药品和化学品的产生。
发明概述
本发明的一个目的是提供用于酶的工业固定化的简单有效的方法,其提供具有增加量的固定于载体上的酶的产品和在终端应用的使用过程中滤出(leach)酶的可能性更小的产品。
发现本发明的方法令人惊奇地提供了固定化酶产物,其与由已知固定化方法获得的固定化酶产物相比具有更高酶活性且在终端应用的使用过程中滤出酶的可能性减少。
因此,在第一方面本发明提供了一种制备固定化酶制品的方法,其包括下列步骤:
a)制备包含酶的液体介质;
b)制备包含多官能胺的液体介质;
c)制备包含交联剂的液体介质;
d)将a)、b)和c)的液体介质引至粒状多孔载体上;
其中可将a)、b)和c)的液体介质按任何顺序或同时引至粒状多孔载体上,且未导致超过载体的吸附容量(adsorption capacity)。
在第二方面,本发明涉及通过上述方法可制得的固定化酶产物。
发明详述
介绍
酶固定化已为人所知很多年。固定化的酶产物可用于有机化合物的酶改性,诸如用于有机合成过程中。
在宽范围的酶应用方法中,诸如在药物制备、专业日用化学品(specialtycommodity chemicals)、污水处理和高果糖糖浆制造中,根据本发明所制备的固定化酶具有潜在的应用。
通常地,应用于所述方法的固定化酶产物可重复使用几次。但是如果固定化酶产品滤出,其导致固定化酶产品的酶活性随时间而降低,则酶产品不能按期望重复使用多次。此外,由在固定化酶产物的使用过程中滤出酶带来的问题是滤出的酶将存在于有机合成的产物中,这是不令人满意的。
描述于此的本发明是一种将酶固定化的方法。该方法包括用酶,多官能胺和交联剂浸渍(impregnate)合适的载体。
在具体实施方式中,固定化酶系统包括:
-具有高物理强度的粒状载体以用于连续填充床反应器及连续搅拌罐反应器;
-酶;
-多官能胺;
-交联剂。
多官能胺的功能是提供可用于与交联剂和酶胺基间共价交联的胺基网络。多官能胺将给固定化酶产物提供机械强度并改进酶的总体交联,且由此使酶从载有多官能胺的载体中滤出最小化。
所述交联剂是与多官能胺和酶反应以产生共价交联的多官能或双官能试剂。该交联剂也可在多官能胺之间及在酶之间发生分子间反应。还可(例如在交联前)引入粘合剂(binder)以使来自硅石颗粒表面的磨损最小化。
已令人惊奇地发现,通过本方法可能获得固定化酶产物,其与已知固定化酶相比初始具有更高的酶活性而且滤出更少。本发明的一个重要方面是此固定化方法易于通过应用其它更大的标准设备来放大。因此可以调整上面给出的设备设置范围以优化更大型的设备。
载体
在本发明的一个实施方式中,载体是固体载体。在本发明的另一个实施方式中,载体是多孔载体。
在本发明的一个实施方式中,本发明的载体是粒状多孔材料。组成粒状多孔材料的颗粒所具有的合适的直径可为50-1500μm,诸如100-1000μm,优选250-700μm;具有的表面积为5-1000m2/g,20-1000m2/g,特别是100-700m2/g,更特别是10-300m2/g,且具有的孔径大小为5nm-50μm,诸如5nm-1000nm,特别是10-500nm,更特别是100-300nm。在本发明的具体实施方式中,组成粒状多孔材料的颗粒的粒度是100-600μm。在本发明的更具体的实施方式中,组成粒状多孔材料的颗粒的粒度是150-500μm。在本发明的还更具体的实施方式中,组成粒状多孔材料的颗粒的粒度是200-450μm。在本发明的最具体的实施方式中,组成粒状多孔材料的颗粒的粒度是250-400μm。
载体颗粒可包括无机的、有机的或无机和有机的材料。所述的载体还可具有亲水的或疏水的表面。
在本发明的第一实施方式中,载体颗粒包括具有基本上亲水的表面的无机材料,其基本上不溶于亲水或疏水液体或它们的混合物。载体可基于硅石(silicas)(例如来自Degussa,Germany的Sipernat 2200)、沸石(zeolites)(例如来自Degussa,Germany的Wessalith MS330)、矾土(aluminas)、硅藻土(diatomaceous earth)、陶瓷(ceramics)(如Yoshihiko Hirose等,Proceedings from3rd International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations,La GrandeMotte,France,1997,p238中所公开的)和高岭土(kaolins)(如在US 5,614,401中所公开的进行酸、水热和烘焙处理的高岭土)。在本发明的具体实施方式中,粒状多孔载体是选自下组:硅石、沸石、矾土、陶瓷和高岭土。
在本发明的具体实施方式中,载体可为金属氧化物如氧化铝,特别是γ氧化铝,硅石,氧化锆(zirconia),硅镁氧化物(silica magnesia),硅-锆-铝氧化物(silica-zirconia-alumina)等。
在本发明的第二实施方式中,载体颗粒包括如第一个实施方式中所述的亲水无机材料,该材料用有机部分(organic moieties)涂覆因此具有基本上疏水的表面,例如在JP 09000257-A中所述,其中用N-苯基-γ-氨基丙基三甲氧基硅烷(N-phenyl-gamma-aminopropyltrimethoxysilane)涂覆酸处理后的高岭土。在JP 08126489-A中描述了更多载体,其中用与酶形成二硫键的聚合物涂覆水不溶性的载体。在本发明的第三实施方式中,载体颗粒包括有机聚合物树脂。该树脂可以是吸附剂树脂(adsorbent resin),优选聚丙烯酸酯,聚甲基丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸甲酯),与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯,聚氨酯(polyurethane)或聚丙烯,或者该树脂可为离子交换树脂,优选阴离子交换树脂,例如弱碱性阴离子交换树脂。优选的阴离子交换树脂是来自Rohm & Haas的酚型Duolite树脂。此外,如DE 4429018-A所公开的,载体可由再生壳聚糖制得。
酶
待根据本发明固定化的酶可以是适用于基于酶的方法的任何酶。
在本发明上下文中,酶可以是任何酶或不同酶的组合。因此,当提及“酶”时,通常应理解为包括一种酶或多种酶的组合。因此本发明的固定化酶产物可包括几种不同的酶。
应当理解的是酶变体(例如通过重组技术产生的)包括在术语“酶”的含义中。这样的酶变体的例子公开于例如EP 251,446(Genencor)、WO 91/00345(Novo Nordisk)、EP 525,610(Solvay)和WO 94/02618(Gist-Brocades NV)中。
可基于来自NC-IUBMB的酶命名手册(1992)对酶进行分类,也参见在因特网上的ENZYME站点:http://www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是与酶命名有关的信息储存库。其主要是以生物化学和分子生物学国际联合会(IUB-MB)命名委员会的建议(Academic Press,Inc.,1992)为基础,描述了已提供EC(酶学委员会)号的每种已表征的酶(Bairoch A.The ENZYME database,2000,Nucleic Acids Res 28:304-305)。该IUB-MB酶命名法基于它们的底物特异性,且有时基于它们的分子机制;这样的分类不能反映这些酶的结构特征。
几年前,已提出另一种基于氨基酸序列相似性以家族进行的某些糖苷水解酶的分类,所述糖苷水解酶例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶。它们目前分为90个不同的家族:参见CAZy(ModO)因特网站点(Coutinho,P.M.& Henrissat,B.(1999)Carbohydrate-Active Enzymes服务器,在URL:http://afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html(相应的文件:Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)Carbohydrate-active enzymes:an integrated databaseapproach.在“Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering”中,H.J.Gilbert,G.Davies,B.Henrissat和B.Svensson编,The Royal S ociety of Chemistry,Cambridge,pp.3-12;Coutinho,P.M.& Henrissat,B.(1999)The modularstructure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes:an integrateddatabase approach.在“Genetics,Biochemistry and Ecology of CelluloseDegradation”中.,K.Ohmiya,K.Hayashi,K.Sakka,Y.Kobayashi,S.Karita和T.Kimura编,Uni Publishers Co.,Tokyo,pp.15-23)。
可并入本发明颗粒中的酶的类型包括氧化还原酶(EC 1.-.-.-)、转移酶(EC 2.-.-.-)、水解酶(EC 3.-.-.-)、裂合酶(EC 4.-.-.-)、异构酶(EC 5.-.-.-)和连接酶(EC 6.-.-.-)。
在本发明上下文中,优选的氧化还原酶是过氧化物酶(EC 1.11.1)、漆酶(EC 1.10.3.2)和葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)]。商业上可得到的氧化还原酶(EC1.-.-.-)的例子是GluzymeTM(可获得自Novozymes A/S的酶)。更多的氧化还原酶可获得自其他供应商。优选的转移酶是如下任何亚类中的转移酶:
a转移一-碳基团(one-carbon groups)的转移酶(EC 2.1);
b转移醛或酮残基的转移酶(EC 2.2);酰基转移酶(EC 2.3);
c糖基转移酶(EC 2.4);
d转移除甲基外的脂族烃基(alkyl)或芳基的转移酶(EC 2.5);和
e转移含氮基团(nitrogeneous group)的转移酶(EC 2.6)。
在本发明上下文中,转移酶最优选的类型是谷氨酰胺转移酶(蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶;EC 2.3.2.13)。
适合的谷氨酰胺转移酶的更多例子描述于WO 96/06931(Novo NordiskA/S)。
在本发明上下文中优选的水解酶是:羧酸酯水解酶(EC 3.1.1.-)例如脂肪酶(EC 3.1.1.3);肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.-),如3-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8)和6-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.26);糖苷酶(EC 3.2,其落入本文表示为“糖酶”的组中),例如,α-淀粉酶(EC 3.2.1.1);肽酶(EC 3.4,也称为蛋白酶);和其他的羰基水解酶。
在本上下文中,术语“糖酶”不仅用于表示能分解碳水化合物链(如淀粉或纤维素)特别是五或六元环结构的碳水化合物链的酶(即糖苷酶,EC 3.2),也表示能异构化碳水化合物的酶,如将六元环结构例如D-葡萄糖异构化为五元环结构例如D-果糖的酶。
有关的糖酶包括如下(EC号在括号中):
α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、内切-1,4-β-葡聚糖酶(纤维素酶、EC 3.2.1.4)、内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)、内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、葡聚糖酶(EC3.2.1.11)、壳多糖酶(EC 3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、溶菌酶(EC 3.2.1.17)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、淀粉-1,6-葡糖苷酶(EC 3.2.1.33)、木聚糖1,4-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、葡聚糖内切-1,3-β-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.39)、α-糊精内切-1,6-α-葡糖苷酶(EC3.2.1.41)、蔗糖α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.48)、葡聚糖内切-1,3-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.59)、葡聚糖1,4-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.74)、葡聚糖内切-1,6-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.75)、半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)、乳糖酶(EC 3.2.1.108)、脱乙酰壳多糖酶(chitosanases)(EC 3.2.1.132)、葡萄糖异构酶(EC 5.3.1.9)和木糖异构酶(EC 5.3.1.5)。
最常用的待固定化的酶是葡萄糖异构酶和脂肪酶。
葡萄糖异构酶:合适的葡萄糖异构酶包括细菌或真菌来源的那些葡萄糖异构酶。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。
脂肪酶:合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自假丝酵母属(Candida),或根毛霉属(Rhizomucor)、南极假丝酵母(C.Antarctica)、曼赫根毛霉(R.miehei)、Hyphozyma、腐质霉属(Humicola)(同物异名嗜热霉属(Thermomyces))的脂肪酶,例如EP 258 068和EP 305 216所述来自疏棉状腐质霉(H.lanuginosa)(细毛嗜热霉(T.lanuginosus))的脂肪酶或如WO96/13580中所述来自特异腐质霉(H.insolens)的脂肪酶;假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶,例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012);芽孢杆菌属(Bacillus)脂肪酶,例如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Dartois等(1993),Biochemica etBiophysica Acta,1131,253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)。当与作为底物的甘油三酯相互作用时,所述脂肪酶可以是位点特异性的(也就是1,3-特异性)或非特异性的。
而且,大量克隆的脂肪酶可以是有用的,包括Yamaguchi等,(1991),Gene 103,61-67所述的沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶,白地霉脂肪酶(Geotricum candidum)(Schimada,Y.等,(1989),J.Biochem.,106,383-388)和各种根霉属(Rhizopus)脂肪酶诸如德列马根霉(R.delemar)脂肪酶(Hass,M.J等,(1991),Gene 109,117-113)、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等,(1992),Biosci.Biotech.Biochem.56,716-719)和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。
其它种类的脂解酶诸如角质酶也可以是有用的,例如WO 88/09367所述的源自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶,或源自豌豆腐皮镰孢(Fusarium solani pisi)的角质酶(例如WO 90/09446中所述)。在本发明具体的实施方式中,用于部分取代或完全取代表面活性剂的酶是角质酶,在本发明更具体的实施方式中,用于部分取代或完全取代表面活性剂的酶源自门多萨假单胞菌或豌豆腐皮镰孢。
其它实例是脂肪酶变体,例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中所述的那些。
商业上可得到的脂肪酶的例子包括Lipex、LipoprimeTM、LipolaseTM、LipolaseTM Ultra、LipozymeTM、PalataseTM、NovozymTM 435和LecitaseTM(都可从Novozymes A/S获得)。
其他商业上可得到的脂肪酶包括LumafastTM(来自GenencorInternational Inc.的门多萨假单胞菌脂肪酶);LipomaxTM(来自DSM/GenencorInt.Inc.的类产碱假单胞菌脂肪酶);和来自Genencor enzymes的芽孢杆菌属菌种脂肪酶。更多的脂肪酶可从其他供应商获得。
商业上可得到的糖酶的例子包括Alpha-GalTM、Bio-FeedTM Alpha、Bio-FeedTM Beta、Bio-FeedTM Plus、Bio-FeedTM Plus、NovozymeTM 188、CelluclastTM、CellusoftTM、CeremylTM、CitrozymTM、DenimaxTM、DezymeTM、DextrozymeTM、FinizymTM、FungamylTM、GamanaseTM、GlucanexTM、LactozymTM、MaltogenaseTM、PentopanTM、PectinexTM、PromozymeTM、PulpzymeTM、NovamylTM、TermamylTM、AMGTM(Amyloglucosidase Novo)、MaltogenaseTM、SweetzymeTM和AquazymTM(都可从Novozymes A/S获得)。更多的糖酶可从其他供应商获得,例如RoxazymeTM和RonozymeTM产品系列(DSM Nutritional Products),AvizymeTM、PorzymeTM和GrindazymeTM产品系列(Danisco、Finnfeeds),以及NatugrainTM(BASF)。
蛋白酶:适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。微生物来源是优选的。包括化学或遗传修饰或蛋白质工程的变体。蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶,优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶-样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草蛋白酶(subtilisin),特别是源自芽孢杆菌属的那些,如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶-样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如,猪或牛来源的)和WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢属(Fusarium)蛋白酶。在具体的实施方式中,去污剂组合物包括源自芽孢杆菌属(例如克劳氏芽孢杆菌(Bacillus Clausii)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus Lentus)、盐敏芽孢杆菌(Bacillus halmapalus)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens))的蛋白酶。
在本发明的具体实施方式中,用于部分取代或完全取代去污剂组合物中的增清剂(builder)的酶是源自芽孢杆菌属的蛋白酶,特别是源自选自下组的微生物的蛋白酶:克劳氏芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、盐敏芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌。
有用的蛋白酶的实例是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体,特别是在以下位置中的一个或多个具有取代的变体:27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
商业上可得到的蛋白酶(肽酶)的例子包括KannaseTM、EverlaseTM、EsperaseTM、AlcalaseTM、NeutraseTM、DurazymTM、SavinaseTM、OvozymeTM、PyraseTM、Pancreatic Trypsin NOVO(PTN)、Bio-FeedTM Pro和Clear-LensTMPro(都可从Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark获得)。其他优选的蛋白酶包括WO 01/58275和WO 01/58276中描述的那些。
其他商业上可得到的蛋白酶包括RonozymeTM Pro、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、OpticleanTM、PropeaseTM、PurafectTM和Purafect OxTM(可从Genencor International Inc.、Gist-Brocades、BASF或DSM NutritionalProducts获得)。
其他商业上可得到的酶包括PectawayTM和StainzymeTM。
淀粉酶:合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些淀粉酶。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。淀粉酶包括,例如,获得自芽孢杆菌属,例如地衣芽孢杆菌的特殊菌株的α-淀粉酶,其在GB 1,296,839中更详细地描述。
有用的淀粉酶的实例是WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体,特别是在以下位置中的一个或多个具有取代的变体:15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
商业上可得到的淀粉酶是NatalaseTM、StainzymeTM、DuramylTM、Ter-mamylTM、TermamylTM Ultra、FungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)、RapidaseTM、PurastarTM和Purastar OxAmTM(来自Genencor International Inc.)。
纤维素酶:合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些纤维素酶。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶,例如从特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶,如US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259中所公开的。
特别适合的纤维素酶是具有颜色保护(colour care)益处的碱性或中性纤维素酶。这些纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体,例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些变体。
商业上使用的纤维素酶包括CelluzymeTM、EndolaseTM、RenozymeTM、和CarezymeTM(Novozymes A/S)、ClazinaseTM和Puradax HATM(GenencorInternational Inc.)和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
氧化还原酶:本发明上下文中具体的氧化还原酶是过氧化物酶(EC1.11.1)、漆酶(EC 1.10.3.2)和葡糖氧化酶(EC 1.1.3.4)]。商业上可得到的氧化还原酶(EC 1.-.-.-)的例子是GluzymeTM(可从Novozyme A/S获得的酶)。更多的氧化还原酶可从其他供应商获得。
过氧化物酶/氧化酶:合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶,和它们的变体,如WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所述的那些。
商业上可得到的过氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozymes A/S)。
甘露聚糖酶(Mannanase):可使用适用于碱性溶液中的任何甘露聚糖酶。合适的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或遗传修饰的突变体。
在优选的实施方式中,甘露聚糖酶源自芽孢杆菌属的菌株,特别是在WO 99/64619的SEQ ID NO:2的31-330位或SEQ ID NO:5中所公开的芽孢杆菌属菌种I633或者Bacillus agaradhaerens,例如来自模式株DSM 8721。在本发明的更优选的实施方式中,甘露聚糖酶源自嗜碱的芽孢杆菌。
合适的甘露聚糖酶包括MannawayTM(Novozymes A/S)。
果胶酸裂合酶:可使用适用于碱性溶液中的任何果胶酸裂合酶。合适的果胶酸裂合酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或遗传修饰的突变体。
在优选的实施方式中,果胶酸裂合酶源自芽孢杆菌属的菌株,特别是枯草芽孢杆菌的菌株,特别是在WO 02/092741实施例6中公开的SEQ IDNO:2或其变体所公开的枯草芽孢杆菌DSM14218。在本发明的更优选的实施方式中,果胶酸裂合酶源自地衣芽孢杆菌。
商业上可得到的肌醇六磷酸酶的例子包括Bio-FeedTM Phytase(Novozymes)、RonozymeTM P(DSM Nutritional Products)、NatuphosTM(BASF)、FinaseTM(AB Enzymes)和PhyzymeTM产品系列(Danisco)。其他优选的肌醇六磷酸酶包括描述于WO 98/28408、WO 00/43503和WO 03/066847中的那些。
在具体的实施方式中,酶选自下组:水解酶、角质酶(cutinase)、氧化酶转移酶、还原酶、半纤维素酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶、漆酶、果胶酶、过氧化氢酶、腈水解酶和它们的混合物。
在本发明的另一具体实施方式中,水解酶选自下组:蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、甘露聚糖酶、纤维素酶和它们的混合物。
在本发明更具体的实施方式中,酶选自下组:蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶、氧化还原酶、氧化酶、酮异构酶(ketoisomerases)和酯酶。
含酶液体介质
在具体的实施方式中,含酶液体介质是亲水介质,优选水性(aqueous)介质。其可含有其它有机或生物物质。因而其可以是发酵培养液或通过纯化发酵培养液可得到的酶浓缩溶液,例如通过超滤或通过蛋白质沉淀、分离和再溶解于其它水性介质来纯化发酵培养液。含酶液体介质还可以是溶于水性介质的基本上纯的酶。在本发明的特殊实施方式中,含酶水成液(aqueous liquid)在固定化前未经昂贵的处理步骤(如蒸发)以除水,也未加入非水溶剂,例如有机溶剂诸如醇类,例如(聚)乙二醇和/或(聚)丙二醇。
在本发明的具体实施方式中,含酶的液体介质也是含多官能胺的液体介质。
优选通过将多官能胺的水溶液加入含酶的水成液中而制备液体介质。
含多官能胺的液体介质
含多官能胺的液体可为亲水介质,优选为水性介质。
多官能胺可以是本领域内已知的任意多官能胺。
合适的多官能胺可以是但不限于选自下组:聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二胺、聚亚甲基二环己基胺(polymetylenedicyclohexylamine)、聚亚甲基二苯胺(polymetylenedianiline)、聚四亚乙基五胺(polytetraethylenepentamine)、聚苯二胺(polyphenylenediamine)、聚丙烯亚胺(polypropylenimine)、聚烯丙胺、聚乙烯胺或含有或不含有N-乙烯基甲酰胺的1-氨基乙烯的聚合物或1-氨基乙烯的聚合物(如EP 502035-B1所述)、脱乙酰壳多糖、白蛋白、明胶。其它合适的胺可以是亚精胺、精胺、三亚乙基四胺、聚丙烯亚胺树状高分子(polypropyleneimine dendrimer)和双(2-乙基氨基)-1,3-丙二胺以及它们的混合物。胺可以是伯胺,仲胺,叔胺或季胺。
PEI是弱的多元脂肪胺(polybasic aliphatic amine),其可以是支链的或直链的。聚乙烯亚胺可有任何合适的分子量。在具体的实施方式中,其摩尔重量(mole weight)是20,000到80,000。在更具体的实施方式中,其摩尔重量是40,000到60,000。不同分子量的聚乙烯亚胺可从BASF(Polymin)、CordovaChemical company(Corcat P)和Nipon shokubai Kagaku Kogyo(Epomin)获得。
液体介质可包含其它有机或生物物质。
在具体的实施方式中,酶蛋白-多官能胺比例(基于100溶液)是1∶20到20∶1,1∶15到15∶1,1∶5到5∶1;在另一实施方式中,该比例是1∶2到3∶1;在另一实施方式中该比例是1∶1到2∶1。
液体的pH优选为4-11。在本发明的具体实施方式中,液体的pH高于6。在本发明的另一具体实施方式中,液体的pH高于7。在本发明的另一具体实施方式中,液体的pH高于7.5。
包含交联剂的液体介质
交联剂可以是能与所选的酶交联的任意化合物。交联剂可选自下组但不限于:多官能醛、多官能有机卤化物、多官能酸酐、多官能偶氮化合物(azocompounds)、多官能异硫氰酸酯、多官能异氰酸酯和它们的混合物。在本发明的具体实施方式中,交联剂是丁二醛、对苯二醛(Terephthaldehyde)、双-重氮联苯胺-2,2’-二磺酸(bis-diazobenzidine-2,2’disulfonic acid)、戊二醛、聚氮杂环丁烷(polyazetidine)、氰尿酰氯、二环氧化物(biepoxides)、二异氰酸酯例如,甲代亚苯基二异氰酸酯(toluylene diisocyanate)、六亚甲基二异氰酸酯(hexamethylene diisocyanate)。
在本发明的具体实施方式中,交联剂是戊二醛和/或聚氮杂环丁烷。
含交联剂的液体介质优选为亲水介质,优选为水性介质。它可包含其它有机或生物物质。酶蛋白-交联剂比例(基于100%溶液)可以是1∶20到1∶0-05,如1∶10到1-0.1,在具体实施方式中,该比例是1∶6到1∶0.4,在另一具体实施方式中该比例是1∶3到1∶0.4。
液体介质还可包含使酶、多官能胺或交联剂更好地粘附于(stick to)粒状多孔载体的组分。此组分可以是本领域已知的任何粘合剂。
合适的组分可以是盐,碳水化合物例如淀粉,聚合物和蜡状物(waxes)。
在本发明的具体实施方式中,此组分是糊精聚乙烯吡咯烷酮山梨醇,聚乙二醇,金属硅酸盐或金属原硅酸盐(metal orthosilicates)。
此组分可加入到任意的所述液体介质中。
固定化方法
在本发明的一个实施方式中,固定化方法是用于制备固定化酶制剂的方法,其包含下列步骤:
a)制备含酶的液体介质;
b)制备含多官能胺的液体介质;
c)制备含交联剂的液体介质;
d)将a)、b)和c)的液体介质引至粒状多孔载体上
其中可以将a)、b)和c)的液体介质按任何顺序或同时引至粒状多孔载体上,且其中未超出所述载体的吸附容量。
在本发明的一个实施方式中,含多官能胺的液体介质和含酶的液体介质是同一(one and the same)液体。
在另一个实施方式中,在加入含交联剂的液体介质之前,将含酶的液体介质和含多官能胺的液体介质加入粒状多孔载体。
在本发明的另一个实施方式中,将含交联剂的液体在含酶和多官能胺的液体之前加至粒状载体。
术语“载体的吸附容量”是指载体所能吸附的液体量。
测定吸附容量的一种方法是将载体样品在105℃干燥24小时,将该载体冷却至环境温度并将1g干燥的载体材料在20℃在100ml液体中放置1小时,然后通过排水(drainage)将载体与过量液体(excess liquid)分离,并测定包含吸附的液体的载体重量。
当超过吸附容量时,载体不能再吸附更多的液体,而如果存在更多的液体,其将其称为过量液体。
因此在发生于液体介质中(例如在柱中)的固定化方法,超出了载体吸附容量的限值且存在过量液体。
在具体的实施方式中,加至方法中的液体量未导致超出载体的吸附容量。应限制加至方法的液体量使得不超出载体的吸附容量。在本发明的具体实施方式中,应以基本上不发生载体凝聚(agglomeration)的量加入液体。
在本发明的第一个实施方式中,加入方法中的液体介质重量与载体重量的比例小于50。在本发明的第二个实施方式中,加入方法中的液体介质重量与载体重量的比例小于25。在第三个实施方式中,液体介质与载体的比例小于10。在另一个实施方式中,该比例小于5。
在本发明的另一个实施方式中,进行附加的方法步骤e)。在步骤e)中,从得到的产物中除去挥发性(volatile)组分。可以通过但不限于多种方法例如过滤、离心、喷雾干燥、风干和冷冻干燥来进行步骤e)中挥发性组分的除去。在具体的实施方式中,步骤e)在流化床中进行。用于除去挥发性组分的合适进气(inlet air)温度主要取决于酶的热稳定性(失活温度)。该温度可以是40-130℃,40-90℃,诸如50-70℃,例如60℃。更高的温度提供更短的固定化和干燥时间。
在本发明的另一实施方式中,固定化方法是用于制备固定化酶制剂的方法,其包含下列步骤:
a)制备含酶和多官能胺的液体介质;
b)制备含交联剂的液体介质;
d)将a)和b)的液体介质加入粒状多孔载体;和
其中可以将a)和b)的液体介质按任何顺序或同时引至粒状多孔载体上。
固定化方法可在任何适于上述方法的设备中进行。
在本发明的具体实施方式中,该设备选自下组:混合器(mixer)、流化床(fluid bed)和盘式涂布机(pan coaters)。
流化床设备可以是主要作为流化床工作的任何设备。可通过雾化(atomization)将本发明的液体介质引至载体上。
在流化床设备中合适的进气口(air inlet)流量取决于固定化酶产品的大小和密度、载体量和流化床设备。而且进气口流量具有上限,因为该流量应足以使固定化酶产物保持流态化,但又不是那么强以致于“吹出(blow off)”固定化酶产物。
当应用流化床同时进行固定化和干燥时,干燥过程将进行与将液体介质雾化入流化床一样长的时间,且可以在停止引入液体介质后合适地延长5-30分钟。
而且,当设备、进气口流量和空气温度不变时,固定化和/或干燥固定化酶产物的耗时将取决于酶、多官能胺和交联剂的量以及载体。本发明的一个重要方面是可通过应用其它更大的标准设备容易地将此固定化方法放大。因此可以调整上面给出的设备设定范围以优化更大型的设备。
酶在具有亲水表面的载体上的固定化:
在本发明的具体实施方式中,载体具有基本上亲水的表面。在具体实施方式中,可在标准的混合装置(例如德国)中进行固定化方法,其中在混合期间,通过雾化将步骤a)、b)和c)中的液体介质引至干燥的多孔粒状载体,例如使用与泵(例如标准Watson-Marlow蠕动泵)相连的喷雾器(nebulizer)进行。
在本发明的另一具体实施方式中,将酶固定在具有基本上亲水表面的载体上可选地可在标准流化床装置,例如Uni-Glatt流化床装置(Glatt,德国)中进行,其中干燥的多孔粒状载体是流化的,且通过雾化将步骤a)、b)和c)中的液体介质引至流化的载体,例如使用与泵(例如标准Watson-Marlow蠕动泵)相连的喷雾器进行。在此实施方式中,固定化和干燥可同时进行。
在具有疏水表面的载体上的固定化:
在本发明的具体实施方式中,酶在具有基本上疏水的表面的载体上的固定化可在标准的混合设备中进行,其中将步骤a)、b)和c)的液体介质引至干燥的多孔粒状载体。
在本发明的另一具体实施方式中,酶在具有基本上疏水的表面的载体上的固定化可选地可在标准流化床装置,例如Uni-Glatt流化床装置(Glatt,德国)中进行,其中干燥的多孔粒状载体是流化的,且通过雾化将步骤a)、b)和c)的液体介质引至流化的载体,例如使用与泵(例如标准Watson-Marlow蠕动泵)相连的喷雾器进行。在此实施方式中,固定化和干燥是同时进行的。
在本发明的一个实施方式中,固定化方法不发生在液体介质中,如包含柱的装置中。
与发生在液体介质中的已知固定化方法相比,本发明方法提供一种更简单更容易操作的方法。本发明方法还使将大量酶加入载体成为可能,且更易于控制颗粒尺寸。
与发生在混合器或流化床中的已知方法相比,本发明方法提供一种具有改良的滤出性质(leaching properties)的固定化酶产品。
固定化的酶制备物的应用
本发明上下文中制备的固定化酶可用于有机物的水解、合成或改性。水解、合成或改性优选地发生在基本上没有游离水(free water)的介质中。
因此,本发明包括一种用于有机化合物的酶改性的方法,其包括将所述有机化合物与根据本发明制得的固定化酶在反应介质中接触。
固定化的纤维素酶可用于纺织品处理(棉的去球和粗斜纹棉布织物的石洗)和回收纸的脱墨(deinking)。
可将固定化的葡萄糖异构酶用作由葡萄糖制造高果糖糖浆的催化剂。固定化的乳糖酶可用于食品改性,诸如从奶中去除乳糖。
固定化蛋白酶可用于防止表面上的微生物生长或应用于温和皮肤表皮脱落(of or as mild skin exfoliating applications)。
固定化的葡糖氧化酶可作为试剂用于葡萄糖测定(glucose assay),用于从食品中除氧,或用于制备葡糖酸和其盐。
本发明的固定化酶可用于有机化合物的酶改性,包括将所述有机化合物与通过本发明的方法制得的固定化酶在反应介质中接触。
在本发明的具体实施方式中,改性是酯化反应,其包括使第一反应物即羧酸和第二反应物即醇与通过本发明的方法制得的固定化脂肪酶相接触。羧酸可选自但不限于下组:脂肪酸、乳酸、苯甲酸、丙烯酸和甲基丙烯酸,而醇可选自但不限于下组:甲醇、乙醇、异丙醇、多元醇诸如丙三醇、山梨醇、异山梨醇(isosorbide)、木糖醇、葡糖苷(诸如乙基葡糖苷和甲基葡糖苷)、新戊醇和丙二醇。
在一实施方式中,改性是手性拆分(chiral resolvation),其包括羧酸酯或酰胺的对映选择性(enantioselective synthesis)合成或者水解。
在一实施方式中,改性是两醛之间的醇醛缩合反应。
在具体的实施方式中,改性是指由本发明中的酶在原位制得的过羧酸(percarboxylic acid)对烯类基团的环氧化作用。
在具体的实施方式中,改性是指聚酯化(polyesterification)反应,其中待改性的有机化合物是羟基羧酸或所述化合物的寡聚物(oligomer),例如乳酸或3-羟基丙酸。或者该羧酸是选自下组的二羧酸:己二酸、丁二酸、反丁烯二酸、2,5-呋喃二羧酸、葡糖二酸、对苯二酸和间苯二酸,且第二反应物选自由多元醇组成的组,如(1,4-丁二醇、1,6-己二醇、丙三醇、山梨醇、异山梨醇、新戊醇、丙二醇)。
在另一个具体实施方式中,改性是开环聚合反应,其包括使内酯(lactone)与通过本方法制得的固定化脂肪酶相接触。
制备的聚合物可以是均聚物或杂聚物。
在具体的实施方式中,改性是酯交换反应(transesterification reaction),其包括使第一反应物即羧酸酯和第二个反应物即醇与通过本方法制得的固定化脂肪酶相接触。
在具体的实施方式中,改性是相互酯化反应(interesterification reaction),其包括使第一反应物即羧酸酯和第二反应物即第二羧酸酯与通过本方法制得的固定化脂肪酶相接触。在更具体的实施方式中,改性是相互酯化反应,其包括使第一反应物即多羧酸酯(polycarboxylic acid ester)和第二反应物即第二多羧酸酯与通过本方法制得的固定化脂肪酶相接触。
羧酸酯可选自但不限于下组:脂肪酸、乳酸、葡糖二酸、苯甲酸、丙烯酸、甲基丙烯酸的烷基酯,且其中的烷基可以是甲基、乙基、丁基;而醇可选自但不限于下组:甲醇、乙醇、异丙醇、多元醇如丙三醇、烷基葡糖苷(诸如乙基葡糖苷或甲基葡糖苷)、山梨醇、有机硅(silicone)和有机硅衍生物、异山梨醇、新戊醇和丙二醇。
在具体的实施方式中,改性是水解或合成,其使用通过本发明制得的固定化酶制备对映纯的(enantiopure)化合物。
在具体的实施方式中,改性是醇醛缩合,其使用通过本方法制得的固定化脂肪酶制备化合物。
在具体的实施方式中,改性是酰胺化反应,其包括使第一反应物即羧酸和第二反应物即胺与通过本方法制得的固定化脂肪酶相接触。
在具体的实施方式中,改性是环氧化反应,其包括用通过本方法制得的固定化酶原位制备环氧化剂。
在本发明的实施方式中,将固定化脂肪酶用于在基本上无游离水的介质中的酯化反应、酯交换反应或相互酯化反应。酯交换反应可用于脂肪酸取代,其包括使第一反应物和第二反应物与所述固定化脂肪酶相接触,通过该酶发生了取代反应。第一反应物可以是脂肪酸酯,优选甘油三酯或甘油三酯的混合物。第二反应物可以是另一不同于第一反应物的脂肪酸酯,优选甘油三酯或甘油三酯的混合物。第二反应物还可以是醇或游离脂肪酸。
在本发明此优选的实施方式中,介质包括有机溶剂,或其可基本上由甘油三酯组成。
本发明的所述用途可适用于制备食品,例如人造奶油(margarine)或可可脂替代物(cocoa-butter substitutes)。
还通过如下实施例来描述本发明,所述实施例不应理解为限制了本发明的范围。
实施例
实施例1
通过一步浸渍法(1-step impregnation)在硅石基载体(silica based carrier)上以30mg/g的酶蛋白载量(enzyme protein load)固定化脂肪酶。
1.使用10%NaOH溶液将源自南极假丝酵母(Candida Antarctica)的脂肪酶B的3.0kg溶液(18400LU(CA)/g)调节至pH7.5±0.2,并用660g水稀释。将129g磷酸氢二钠加入酶溶液并搅拌直到磷酸氢二钠溶解。用10%NaOH溶液将pH调回至pH 7.5±0.2。
2.然后在环境温度使用转速为150rpm的连续混合,在20L混合器(Germany)中将液体脂肪酶溶液(根据1)均匀施于2.1kg的Sipernat2200(来自Degussa,Germany的硅石基载体)上。使用调节至16min喷雾时间的雾化喷嘴。
3.在加入液体脂肪酶溶液后(根据2),在入口温度为100℃的流化床(GEA)中干燥载体颗粒,直至产物温度达到60℃。从而获得低于5%的含水量(moisture content)。
固定化酶产物的活性:3600PLU。
在二甲亚砜(DMSO)中测定的酶蛋白滤出:30mg/g
滤出前酶蛋白水平:30mg/g。
酶活性的测定:
通过Novozymes标准方法EB-SM-0095.02来确定液体脂肪酶的酶活性(LU=脂肪酶单位),所述方法可根据要求从Novozymes A/S得到。
1 LU对应于在标准条件下释放1μmol可滴定的丁酸/分钟的酶量。
通过Novozymes标准方法EB-SM-1069.02来确定固定化脂肪酶的酶活性(PLU=月桂酸丙酯单位),所述方法可根据要求从Novozymes A/S得到。
1 PLU单位对应于1μmol/g/min,例如,每克酶每分钟形成的1μmol月桂酸丙酯。固定化脂肪酶将月桂酸与1-丙醇酯化以形成月桂酸丙酯。通过GC定量形成的月桂酸丙酯和消耗的月桂酸来确定此活性(μmol/g/min)。
滤出测量:
将固定化酶(50mg)称入Eppendorf管,在此Eppendorf管中加入DMSO(1mL)。在37℃和1200rpm将混合物温育30分钟。将DMSO上清液转移至微量滴定板并用DMSO稀释(10x)。由Coomassie(Bradford)蛋白试验,使用从纯化的CaLB酶得到的标准曲线来确定蛋白质含量。将滤出计算为mgCaLB每g总重量。
实施例2
通过一步浸渍法在硅石基载体上以30mg/g的酶蛋白载量固定化脂肪酶,并随后用戊二醛(GA)/聚乙烯亚胺(PEI)交联。
1.用10%NaOH溶液将源自南极假丝酵母的脂肪酶B的3.0kg溶液(18400LU(CA)/g)调节至pH 7.5±0.2。将466g的15%聚乙烯亚胺水溶液(Sedipur,BASF)和129g磷酸氢二钠加入酶溶液并搅拌直至磷酸氢二钠溶解。使用10%NaOH溶液将pH调回至pH 7.5±0.2。
2.然后在环境温度使用转速为150rpm的连续混合,在20L混合器(Lodige,Germany)中将液体脂肪酶溶液(根据1)均匀施于1.9kg的Sipernat2200(来自Degussa,Germany的硅石基载体)上。使用调节至14min喷雾时间的雾化喷嘴。
3.在加入液体脂肪酶溶液后(根据2),再以相同的转速和11min喷雾时间将933g的15%戊二醛水溶液(Dow)施于同一硅石载体颗粒上。
由于含PEI液体酶溶液和GA吸附到载体颗粒上,载体颗粒经处理后还是自由流动的分离的(individual)颗粒。
4.最后,将载体颗粒在入口温度为100℃的流化床(GEA)中干燥,直至产物温度达到60℃。从而获得低于5%的含水量。
固定化酶产物的活性:3200PLU
在DMSO中测定的酶蛋白滤出:13mg/g
在滤出前酶蛋白水平:30mg/g
实施例3
通过二步浸渍和随后通过戊二醛(GA)/聚乙烯亚胺(PEI)交联,在硅石基载体上以50mg/g的酶蛋白载量固定化脂肪酶。
1.用10%NaOH溶液将源自南极假丝酵母的脂肪酶B的3.0kg溶液(18400LU(CA)/g)调节至pH 7.5±0.2。将233g的15%聚乙烯亚胺水溶液(Sedipur,BASF)和129g磷酸氢二钠加入酶溶液并搅拌直至磷酸氢二钠溶解。使用10%NaOH溶液将pH调回至pH 7.5±0.2。
2.然后在环境温度使用转速为150rpm的连续混合,在20L混合器(Lodige,Germany)中首先将466g的15%戊二醛溶液施于1.9kg的Sipernat2200(来自Degussa,Germany的硅石基载体)上。使用调节至10min喷雾时间的雾化喷嘴。
3.然后,使用相同的转速和11min喷雾时间将液体脂肪酶溶液(根据1)施于相同的硅石载体颗粒上。
4.然后使用实施例1所述的条件在流化床中干燥载体颗粒。
5.在干燥和冷却后,将含PEI和Na2HPO4的液体酶溶液(根据1)施于经干燥的载体颗粒。
6.在步骤5中加入液体酶溶液后,以相同的转速和11min喷雾时间将466g的15%戊二醛水溶液(根据步骤2)施于相同的硅石载体颗粒上。
由于液体酶、PEI和GA吸附到载体颗粒上,载体颗粒经处理后还是自由流动的分离的颗粒。
7.然后在5℃将载体颗粒静置45min至16hr。
8.最后,将固定化酶载体颗粒在入口温度为100℃的流化床(GEA)中干燥,并干燥直至产物温度达到60℃。从而获得低于5%的含水量。
固定化酶产物的活性:5300PLU
在DMSO中测定的酶蛋白滤出:5mg/g
在滤出前酶蛋白水平:50mg/g
实施例4
通过一步浸渍和随后用戊二醛(GA)/聚乙烯亚胺(PEI)交联,在硅石基载体上以59mg/g的酶蛋白载量固定化脂肪酶。
1.用49g的10%NaOH溶液将源自南极假丝酵母的脂肪酶B的1.7kg溶液(61800LU(CA)/g)调节至pH 7.5±0.2。834g的15%聚乙烯亚胺(Sedipur,BASF)水溶液并搅拌15min。随后使用75g的10%NaOH溶液将pH重调至pH 7.5±0.2。
2.然后在环境温度使用转速为150rpm的连续混合,在20L混合器(Lodige,Germany)中首先将834g的15%戊二醛溶液施于1.8kg的Sipernat2200(来自Degussa,Germany的硅石基载体)上。使用调节至11min喷雾时间的雾化喷嘴。
3.然后,使用相同的转速和10min喷雾时间将液体脂肪酶溶液(根据1)施于相同的硅石载体颗粒上。
4.在喷雾液体酶溶液(根据3)后,使用相同的转速和12min喷雾时间将834g的15%戊二醛水溶液施于相同的硅石颗粒上。
由于液体酶、PEI和GA吸附到载体颗粒上,载体颗粒经处理后还是自由流动的分离的颗粒。
5.最后,将固定化酶载体颗粒在入口温度为100℃的流化床(GEA)中干燥,并干燥直至产物温度达到60℃。从而获得低于5%的含水量。
固定化酶产物的活性:6400PLU
在DMSO中测定的酶蛋白滤出:4mg/g
在滤出前酶蛋白水平:59mg/g
实施例5
通过一步浸渍和随后用戊二醛(GA)/聚乙烯亚胺(PEI)交联,在硅石基载体上以50mg/g的酶蛋白载量固定化脂肪酶。将所有液体在流化床中加至硅石基载体上。
5.使用10%NaOH溶液将源自南极假丝酵母的脂肪酶B的894g溶液(102000LU(CA)/g)调节至pH 7.5±0.2。将221g的15%聚乙烯亚胺水溶液(Sedipur,BASF)加入酶溶液。将48g磷酸氢二钠溶于1390g水中并将此磷酸盐溶液加至酶溶液中。使用10%NaOH溶液将pH调回至pH 7.5±0.2。
6.然后在流化床(GEA MP-2/3,Germany)中,使用125-135m3/hr的空气流速和31℃的入口空气温度将液体脂肪酶溶液(根据1)均匀施于2.25kg的Zeofree 5170(来自Huber Engineered Materials,USA的硅石基载体)上。将流化床中的产品温度保持在15-16℃。使用1bar的喷嘴压力,其导致22min的喷雾时间。
7.在加入液体脂肪酶溶液(根据2)后,使用与2中给出的相同的流化床和过程参数,再将993g的6.7%戊二醛水溶液(Dow)施于相同的硅石载体颗粒上。使用15min的喷雾时间。
由于含PEI的液体酶溶液和GA吸附到载体颗粒中,载体颗粒在整个方法中是自由流动的分离的颗粒。
8.最后,将载体颗粒在入口温度为100℃的相同的流化床(GEAMP 2/3)中干燥直至产物温度达到60℃。从而获得低于5%的含水量。
固定化酶产物的活性:4200PLU/g
在DMSO中测定的酶蛋白滤出:6mg/g
在滤出前酶蛋白水平:50mg/g
实施例1、2、3、4和5的比较
方法步骤 | 活性PLU | 酶滤出mg/g | |
实施例1 | 步骤1:将脂肪酶施于载体上 | 3600 | 30 |
实施例2 | 步骤1:将脂肪酶+PEI施于载体上步骤2:加入戊二醛 | 3200 | 13 |
实施例3 | 步骤1:将戊二醛施于载体上步骤2:加入脂肪酶+PEI步骤3:干燥步骤4:加入脂肪酶+PEI步骤5:加入戊二醛 | 5300 | 5 |
实施例4 | 步骤1:将戊二醛施于载体上步骤2:加入脂肪酶+PEI步骤3:加入戊二醛 | 6400 | 4 |
实施例5 | 步骤1:将脂肪酶+PEI施于载体上步骤2:加入戊二醛 | 4200 | 6 |
Claims (35)
1、一种制备固定化酶制品的方法,包括下列步骤:
a)制备包含酶的液体介质;
b)制备包含多官能胺的液体介质;
c)制备包含交联剂的液体介质;
d)将a)、b)和c)的液体介质引至粒状多孔载体上;
其中可以将a)、b)和c)的液体介质按任何顺序或同时引至粒状多孔载体上,且其中引入该方法中的液体量未导致超出所述载体的吸附容量。
2、权利要求1的方法,其中此方法是在混合器、流化床或盘式涂布机中进行的。
3、权利要求1或2的方法,其中a)的液体介质和b)的液体介质是同一液体介质。
4、任意前述权利要求的方法,其中在引入步骤c)的液体介质后将a)和b)的液体介质引至粒状多孔载体上。
5、任意前述权利要求的方法,其中在引入步骤c)的液体介质前将a)和b)的液体介质引至粒状多孔载体上。
6、任意前述权利要求的方法,还包括步骤e),在该步骤中将挥发性成分从所得产物中去除。
7、权利要求6的方法,其中在步骤e)中挥发性成分的去除是通过干燥完成的。
8、任意前述权利要求的方法,其中多孔载体具有50到1500μm的颗粒尺寸。
9、任意前述权利要求的方法,其中步骤d)的液体介质引入的量使载体基本上不发生凝聚。
10、任意前述权利要求的方法,其中步骤d)的液体介质的引入是通过雾化完成的。
11、任意前述权利要求的方法,其中多孔载体选自下组:硅石、沸石、矾土、硅藻土和高岭土。
12、任意前述权利要求的方法,其中酶是选自下组:水解酶、角质酶、氧化酶转移酶、还原酶、半纤维素酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶、漆酶、果胶酶、过氧化氢酶、腈水解酶和它们的混合物。
13、权利要求12的方法,其中水解酶选自下组:蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、甘露聚糖酶、纤维素酶和它们的混合物。
14、任意前述权利要求的方法,其中多官能胺选自下组:聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺或含有或不含有N-乙烯基甲酰胺的1-氨基乙烯的聚合物、脱乙酰壳多糖、白蛋白、明胶、亚精胺、精胺、三亚乙基四胺、聚丙烯亚胺树状高分子和双(2-乙基氨基)-1,3-丙二胺。
15、任意前述权利要求的方法,其中交联剂选自下组:戊二醛、聚氮杂环丁烷、氰尿酰氯、二环氧化物和二异氰酸酯。
16、任意前述权利要求的方法,其中步骤a)、b)和c)的液体介质是水性液体介质。
17、通过权利要求1至16的方法可获得的固定化酶产物。
18、对有机化合物进行酶改性的方法,其包括使所述的有机化合物与权利要求17的固定化酶产物在反应介质中接触。
19、根据权利要求18的方法,其中改性是酯化反应,其包括使第一反应物即脂肪酸酯和第二反应物即另一脂肪酸酯、醇或游离脂肪酸与根据权利要求1至16中任意项的方法制得的固定化脂肪酶相接触。
20、权利要求19的方法,其中第一反应物是甘油三酯。
21、权利要求19和20的方法,其中第二反应物是脂肪酸酯,且脂肪酶是位置特异性的。
22、权利要求19的方法,其中第一和第二反应物是不同的甘油三酯或甘油三酯的不同混合物,且脂肪酶是1,3-位特异性的。
23、权利要求18-22的方法,其中反应介质基本上由甘油三酯组成。
24、权利要求18-22的方法,其中反应介质包括有机溶剂。
25、根据权利要求18的方法,其中改性是酯化反应,其包括使第一反应物即羧酸和第二反应物即醇与根据权利要求1至16中任意项的方法制得的固定化脂肪酶相接触。
26、根据权利要求25的方法,其中酯化反应是聚合反应,其包括使二羧酸和多元醇与根据权利要求1至14中任意项的方法制得的固定化脂肪酶相接触。
27、根据权利要求18的方法,其中改性是聚酯化反应,其包括使至少一种羟基羧酸与根据权利要求1至14中任意项的方法制得的固定化脂肪酶相接触。
28、根据权利要求18的方法,其中改性是开环聚合反应,其包括使内酯与根据权利要求1至16中任意项的方法制得的固定化脂肪酶相接触。
29、根据权利要求18的方法,其中改性是酯交换反应,其包括使第一反应物即羧酸酯和第二个反应物即醇与根据权利要求1至16中任意项的方法制得的固定化脂肪酶相接触。
30、根据权利要求18的方法,其中改性是相互酯化反应,其包括使第一反应物即羧酸酯和第二反应物即第二羧酸酯与根据权利要求1至16中任意项的方法制得的固定化脂肪酶相接触。
31、根据权利要求18的方法,其中改性是相互酯化反应,其包括使第一反应物即多羧酸酯和第二反应物即第二多羧酸酯与根据权利要求1至16中任意项的方法制得的固定化脂肪酶相接触。
32、根据权利要求18的方法,其中改性是水解或合成,其使用根据权利要求1至16中任意项的方法制得的固定化酶制备对映纯的化合物。
33、根据权利要求18的方法,其中改性是羟醛缩合,其使用根据权利要求1至16中任意项的方法制得的固定化脂肪酶制备化合物。
34、根据权利要求18的方法,其中改性是酰胺化反应,其包括使第一反应物即羧酸和第二个反应物即胺与根据权利要求1至16中任意项的方法制得的固定化脂肪酶相接触。
35、根据权利要求18的方法,其中改性是环氧化反应,其包括用根据权利要求1至16中任意项的方法制得的固定化酶原位制备环氧化剂。
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