CN101979617B - 白藜芦醇二聚体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白藜芦醇二聚体的制备方法，其特点是将白藜芦醇溶解于丙酮或乙酸乙酯溶液中，加入固定化漆酶，在35℃～45℃条件下反应1～5小时后固液分离；将含有固定化漆酶的固相再加入反应底物可继续反应、反复使用，将收集的反应液用有机溶剂或中性盐沉淀蛋白，固液分离后将液相浓缩，再加入乙酸乙酯萃取后再浓缩干燥，即得白藜芦醇二聚体。本发明采用固定化漆酶进行白藜芦醇二聚体的合成，可使合成时间大大缩短(从24小时缩短为1～4小时)，转化效率显著提高(从18～21％提高到35～38％)，效果显著。
Description
技术领域
本发明属于生化合成技术领域，具体涉及白藜芦醇二聚体的制备方法。
技术背景
白藜芦醇(resveratrol)是葡萄与葡萄酒中的一种功效成分，分子式为C14H12O3，相对分子量228.25，化学名称为3，4′，5-三羟基-1，2-二苯乙烯，属于一类具有二苯乙烯母核的化合物——芪类结构的非黄酮类多酚化合物。白藜芦醇具有广泛的生理活性，包括抗动脉硬化、抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤活性、心血管保护作用、抗艾滋病活性、以及免疫调节等。研究表明，白藜芦醇对肺癌、肝癌、肠癌、胃癌、乳腺癌和白血病等均具有拮抗作用。
白藜芦醇二聚体是一类结构复杂、具有多种生物活性的天然化合物，由白黎芦醇以不同方式、不同聚合度聚合而成。目前的研究主要集中在ε-viniferin、δ-viniferin、α-viniferin三种结构上。白藜芦醇二聚体(主指δ-viniferin)具有较强的抗氧化作用，是白藜芦醇抗氧化作用的50倍；同时，其对引起癌变的环氧酶的抑制效果比白藜芦醇更强。
目前，白藜芦醇二聚体的体外合成方法大体分为化学催化剂合成和生物酶催化合成两类。化学催化剂合成主要利用FeCl3、Ag2O、VOCl3、Mn(OAc)3等金属氧化剂催化合成白藜芦醇二聚体，如：黄开胜等将白藜芦醇溶于甲醇溶液，加入过量的FeCl3搅拌反应，分别得到ε-viniferin和7a，8a-cis-viniferin，产率分别是20％和2.7％。生物酶催化合成主要利用辣根过氧化物酶、大豆脂肪氧化酶、漆酶等氧化酶合成白藜芦醇二聚体。Lnagckae.P等1977年用辣根酶(horseardish peroxidase)和H2O2氧化α-viniferin及反式4-羟基二苯乙烯，得到了系列viniferin类化合物；Nicotra S等用嗜热甲烷八叠球菌和绒毛栓菌产生的漆酶分别与白藜芦醇作用，催化合成δ-viniferin，反应24小时后产量分别为21％和18％。
由于酶催化合成的步骤少，是一种很有前途的仿生合成方法。但是目前酶促合成白藜芦醇二聚体存在的主要问题是氧化酶类专一性较低、反应时间长、转化率普遍不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反应时间短、转化率高的白藜芦醇二聚体(viniferin)的制备方法，其合成时间短、工艺条件稳定、转化效率高，适于规模生产。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
本发明白藜芦醇二聚体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、酶促合成白藜芦醇二聚体
先将白藜芦醇溶解于质量浓度为20％～50％的丙酮或乙酸乙酯溶液中，加入固定化漆酶，在35℃～45℃条件下反应1～5小时，反应结束后固液分离；将含有固定化漆酶的固相再加至溶解有白藜芦醇的丙酮或乙酸乙酯溶液中继续反应，反复使用，收集反应液，直到固定化漆酶的酶活降低一半后换之。所述的固定化漆酶可选择具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环，其用量为白藜芦醇质量的2～5倍；所述反应的合适反应温度为40℃，反应时间为4小时；
步骤二、分离白藜芦醇二聚体
将收集的反应液用有机溶剂或中性盐沉淀蛋白，固液分离后将液相浓缩，再加入乙酸乙酯萃取，将萃取液再浓缩，干燥后即得白藜芦醇二聚体。所述的有机溶剂优选甲醇、乙醇或是三氯甲烷；所述的中性盐优选硫酸钠、硫酸铵或是硫酸锌。
所述的具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环的制备方法，包括以下步骤：先以CuBr2为催化剂、2，2’-联吡啶为配体、2-溴丙酸乙酯为自由引发剂，以多孔烧结玻璃环为载体，制备具有甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝聚合功能的多孔烧结玻璃环；再将该多孔烧结玻璃环加至漆酶溶液中，于30℃条件下震荡或搅拌16～24小时后，加入终浓度为1％的戊二醛溶液，室温下交联1小时，过滤后纯水洗涤，去除未吸附的游离酶，再离心去除表面水分，即得具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环。
对本发明所得产物白藜芦醇二聚体进行检测鉴定，确定得到的白藜芦醇二聚体是所需要的产物viniferin。采用高效液相色谱法鉴定，将产物用甲醇溶解后定容稀释，用0.22μm微孔滤膜过滤后进样，色谱条件：①色谱柱：C18柱4.6×150mm，②流动相∶乙腈-水＝30∶70，③波长：305nm，④流速：0.8mL/min，检测是否有对应峰；其次，采用LC-MS鉴定法对产物检测，确认分子量。最后，对合成产物分离，取样进行核磁共振鉴定，鉴定其1H谱和13C谱检测，以便最后确定产物的结构。
由于传统的白藜芦醇二聚体制备方法直接用漆酶反应，是一次性投料、一次性反应，不但效率低，而且漆酶与底物混合在一起，造成原料损失过大、转化率不高、产物分离困难，且工艺条件难以稳定，无法规模生产。本发明的制备方法，采用固定化漆酶进行白藜芦醇二聚体的合成，可使合成时间大大缩短(从24小时缩短为1～4小时)，转化效率显著提高(从18～21％提高到35～38％)，效果显著。实验证明，本发明制备的白藜芦醇二聚体viniferin口服毒性小，毒性限量大于5g/kg动物体重。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明。
本发明所述的具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环，可按以下方法获得。
步骤一、以CuBr2为催化剂，2，2’-联吡啶为配体，2-溴丙酸乙酯为自由引发剂，以多孔烧结玻璃环为载体，制备具有甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝聚合功能的多孔烧结玻璃环，具体过程如下：
先取5Kg的多孔烧结玻璃环加入15L二氯甲烷溶剂，然后搅拌并真空脱气后，加入0.5Kg的三乙胺和1Kg的引发剂2-溴基异丁酰溴，常温反应24小时，反应结束后离心分离出固体，用二氯甲烷、四氢呋喃和丙酮溶剂依次洗涤，经真空干燥，即得化学键合有引发剂2-溴基异丁酰溴的多孔烧结玻璃环。再取2Kg的该多孔烧结玻璃环加至5L环己酮溶剂中，搅拌并真空脱气后，加入1.5Kg的甲基丙烯酸缩水甘油酯、0.75Kg的配体2，2’-联吡啶、60g的催化剂CuBr2，以及0.1Kg的自由引发剂2-溴丙酸乙酯；然后，通入高纯氮气30分钟驱除空气，再于盐冰浴(-5℃～5℃)中抽真空后，升温至室温再通入高纯氮气，如此反复三次，以彻底除去空气；最后，在氮气保护并搅拌下，30℃进行恒温接枝聚合反应，反应结束后将反应体系冷却至常温，离心分离反应产物，即得具有甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝聚合功能的多孔烧结玻璃环。
步骤二、取25L质量浓度为2％的真菌漆酶溶液(上海戴迪实业发展有限公司的L10漆酶)，加入1Kg上述制备的多孔烧结玻璃环，在30℃条件下震荡或搅拌16小时后，加入终浓度为1％的戊二醛溶液，室温下交联1小时，过滤后纯水洗涤，去除未吸附的游离酶，再离心去除表面水分，即得到吸附交联在多孔烧结玻璃环上的固定化漆酶，并测得酶活为0.9696u/g。
实施例一、
步骤一、酶促合成白藜芦醇二聚体
先将白藜芦醇1kg溶解于8L质量浓度为40％的丙酮溶液中，加入3kg具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环，在35℃条件下反应2小时，反应结束后放出反应液；在反应器中(留有固定化漆酶固相)再加入溶解有白藜芦醇的丙酮溶液继续反应，固定化漆酶可反复使用(随着酶活的降低，反应时间可加长)，收集反应液，直到固定化漆酶的酶活降低一半后换之。
步骤二、分离白藜芦醇二聚体
将收集的反应液用有机溶剂三氯甲烷(也可选用甲醇或乙醇)沉淀蛋白，过滤后将液相浓缩至原体积的四分之一，再加入乙酸乙酯萃取，将萃取液再浓缩，干燥后即得白藜芦醇二聚体，收率35％。
实例二、
步骤一、酶促合成白藜芦醇二聚体
先将白藜芦醇1kg溶解于9L质量浓度为50％的丙酮溶液中，加入3.5kg具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环，在40℃条件下反应3小时，反应结束后放出反应液；在反应器中(留有固定化漆酶固相)再加入溶解有白藜芦醇的丙酮溶液继续反应，固定化漆酶可反复使用(随着酶活的降低，反应时间可加长)，收集反应液，直到固定化漆酶的酶活降低一半后换之。
步骤二、分离白藜芦醇二聚体
将收集的反应液用有机溶剂甲醇(也可选用三氯甲烷或乙醇)沉淀蛋白，离心后将液相浓缩至原体积的四分之一，再加入乙酸乙酯萃取，将萃取液再浓缩，干燥后即得白藜芦醇二聚体，收率36％。
实例三、
步骤一、酶促合成白藜芦醇二聚体
先将白藜芦醇1kg溶解于9L质量浓度为30％的乙酸乙酯溶液中，加入4kg具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环，在45℃下反应3小时，反应结束后放出反应液；在反应器中(留有固定化漆酶固相)再加入溶解有白藜芦醇的乙酸乙酯溶液继续反应，固定化漆酶可反复使用(随着酶活的降低，反应时间可加长)，收集反应液，直到固定化漆酶的酶活降低一半后换之。
步骤二、分离白藜芦醇二聚体
将收集的反应液用中性盐硫酸钠(也可选用硫酸铵或硫酸锌)沉淀蛋白，离心后将液相浓缩至原体积的五分之一，再加入乙酸乙酯萃取，将萃取液再浓缩，干燥后即得白藜芦醇二聚体，收率36％。
实例四、
步骤一、酶促合成白藜芦醇二聚体
先将白藜芦醇1kg溶解于10L质量浓度为40％的乙酸乙酯溶液中，加入4kg具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环，在40℃下反应4小时，反应结束后放出反应液；在反应器中(留有固定化漆酶固相)再加入溶解有白藜芦醇的乙酸乙酯溶液继续反应，固定化漆酶可反复使用(随着酶活的降低，反应时间可加长)，收集反应液，直到固定化漆酶的酶活降低一半后换之。
步骤二、分离白藜芦醇二聚体
将收集的反应液用中性盐硫酸锌(也可选用硫酸铵或硫酸钠)沉淀蛋白，离心后将液相浓缩至原体积的五分之一，再加入乙酸乙酯萃取，将萃取液再浓缩，干燥后即得白藜芦醇二聚体，收率38％。
Claims (3)
1.一种白藜芦醇二聚体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、酶促合成白藜芦醇二聚体
先将白藜芦醇溶解于质量浓度为20％～50％的丙酮或乙酸乙酯溶液中，加入固定化漆酶，在35℃～45℃条件下反应1～5小时，反应结束后固液分离；将含有固定化漆酶的固相再加至溶解有白藜芦醇的丙酮或乙酸乙酯溶液中继续反应，反复使用，收集反应液；所述的固定化漆酶为具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环，其用量为白藜芦醇质量的2～5倍；
所述具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环的制备方法，包括以下步骤：取5Kg的多孔烧结玻璃环加入15L的二氯甲烷溶剂，搅拌并真空脱气后，加入0.5Kg的三乙胺和1Kg的引发剂2-溴基异丁酰溴，常温反应24小时后离心分离出固体，用二氯甲烷、四氢呋喃和丙酮溶剂依次洗涤，经真空干燥，即得到键合有引发剂2-溴基异丁酰溴的多孔烧结玻璃环；再取2Kg的该多孔烧结玻璃环加至5L环己酮溶剂中，搅拌并真空脱气后，加入1.5Kg的甲基丙烯酸缩水甘油酯、0.75Kg的配体2，2’-联吡啶、60g的催化剂CuBr2以及0.1Kg的自由引发剂2-溴丙酸乙酯；通入高纯氮气30分钟驱除空气，于-5℃～5℃盐冰浴条件下抽真空后，升温至室温后再通入高纯氮气，如此反复三次；最后，在氮气环境并搅拌下，30℃进行恒温接枝聚合反应，反应结束后将反应体系冷却至常温，离心分离反应产物，得具有甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝聚合功能的多孔烧结玻璃环；再取25L质量浓度为2％的真菌漆酶溶液，加入1Kg的该多孔烧结玻璃环，在30℃条件下震荡或搅拌16小时后，加入终浓度为1％的戊二醛溶液，室温下交联1小时，过滤后纯水洗涤，去除未吸附的游离酶，再离心去除表面水分，即得具有固定化漆酶的多孔烧结玻璃环；
步骤二、分离白藜芦醇二聚体
将收集的反应液用有机溶剂或中性盐沉淀蛋白，固液分离后将液相浓缩，再加入乙酸乙酯萃取，将萃取液再浓缩，干燥后即得白藜芦醇二聚体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的反应温度为40℃，反应时间为4小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇或是三氯甲烷；所述的中性盐为硫酸钠、硫酸铵或是硫酸锌。
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