CN101294157B - 一种在多孔硅胶上固定漆酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种在多孔硅胶上固定漆酶的方法。本发明涉及到将漆酶固定到一种多孔硅胶载体上的方法，属于环境微生物领域。该方法以层析用多孔硅胶为载体，通过共价结合的方法将漆酶固定在功能化多孔硅胶载体上。其固定的方法包括两个步骤：载体的制备和漆酶的固定。载体制备是将多孔硅胶与一定量的戊二醛水溶液混合，在真空超声下反应，制备出可与漆酶共价结合的功能化载体；漆酶的固定是在4摄氏度下，pH＝7.0的缓冲溶液下先固定漆酶12小时，洗涤、低温干燥后得到固定化的漆酶。本发明提供了一个高稳定性、高活性的固定化漆酶，制备方便，迅速、成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种将真菌漆酶(Laccase from Trametes versicolor)固定在功能化多孔硅胶载体上的方法。属于环境微生物应用领域。
背景技术
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在多种生物体内。漆酶作用的底物相当广泛，包括多酚、甲基替代单酚、芳香胺、苯硫醇、聚甲氧基苯，以及其他容易氧化的化合物，其作用主要是催化氧化还原反应。由于具有相当广泛的底物专一性和较好的稳定性，漆酶在废水处理、生物漂白、芳香化合物转化、环境监测等方面具有重要应用价值。
酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素如物理因素(温度、压力、磁力场)、化学因素(氧化、还原、pH、有机溶剂、离子强度、金属离子)和生物因素均可能使漆酶丧失活性，游离态漆酶即使在最适条件下，随着反应时间的延长，反应速度会逐渐下降，反应后不能回收，且难以实现重复利用。与游离态酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还存在稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控。
近年来国际上对漆酶的固定化进行了较为广泛的研究，文献(Hu X.K.et al.，Chemosphere2007，66：1618-1626)通过共价结合和物理吸附的方法把来自于Trametes versicolor真菌漆酶固定在介孔分子筛SBA-15上，并研究发现这种固定化漆酶对多种环境典型污染物(如多环芳烃类污染物)降解效果显著。文献(王炎等，高校化学工程学报，2008，22(1)：83-87)通过物理吸附把漆酶固定在介孔分子筛MCM-41上，并具有较高的表观活性和稳定性。但现有的固定化载体材料还普遍存在于合成价格昂贵，加工工艺复杂，分离效果差等缺点。
本发明的目的正是解决了上述几个问题，本发明中固定化漆酶的载体采用了多孔材料比表面积大，孔径适中的多孔硅胶作为固定化漆酶的载体，避免了纳米材料作为固定化酶载体难以分离的特点，一方面提供一种可以通过共价结合法固定漆酶的功能化的多孔硅胶载体，另一方面提供这种功能化载体固定漆酶的方法，该方法简化了制备固定化酶多孔载体的方法，降低了生产成本，同时增强了漆酶的稳定性，有助于拓宽漆酶在环境保护领域中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以功能化多孔硅胶为载体的高稳定性、高活性的固定化漆酶方法。
发明内容：是以功能化多孔硅胶为载体，将漆酶通过共价结合的方法固定在该载体上。
该方法包括两个步骤：载体的制备及漆酶的固定化。
1)载体的制备
(a)多孔硅胶先用1摩尔/升的盐酸浸泡8-12小时，然后在60-80℃下烘干；
(b)称取所需的烘干后的硅胶置于三角瓶中，向其中加入体积比为1∶3的γ-氨丙基三乙氧基硅烷和甲苯混合液，将三角瓶连入冷凝回流装置，氨基化8-12小时；
(c)将氨基化的硅胶依次用甲苯、蒸馏水和无水乙醇各清洗3-4次；
(d)将2.5％-5％质量分数的戊二醛水溶液与所需的氨基化硅胶充分混合，置于真空抽气装置；
(e)在真空状态下超声反应30分钟；
(f)置于常温常压下静置30分钟；
(g)将嫁接上醛基的多孔硅胶载体低温干燥，即获得固定化用的多孔硅胶载体；
2)漆酶的固定化
(a)将步骤1)中得到的干燥多孔硅胶载体与溶于pH＝7.0磷酸缓冲溶液的漆酶充分混合，于垂直混合器上于4℃条件下固定12小时；
(b)用pH＝7.0磷酸缓冲溶液洗涤，并收集洗涤液，直到洗涤液中没有蛋白检出；
(c)将固定化好的漆酶放置在pH＝8.0乙醇胺-盐酸缓冲溶液中静置2小时；
(d)将静置后的固定化漆酶用pH＝7.0的磷酸缓冲溶液洗涤若干次，然后低温真空干燥制备成固定化漆酶成品。
作为用于本发明的载体，多孔硅胶是优选的，对于所述的载体，孔径优选在10-50纳米左右的范围内。在孔径50纳米或者更高的情况下，载体的表面积降低造成载酶量降低而影响酶的活性，孔径过于小，容易造成酶不能充分利用里面的孔道结构。载体粒径为60-120目，优选80-100目，这样的载体有利于分离和重复利用。
附图说明
图1本发明所述载体功能化和漆酶共价结合示意图
图2固定化温度与固定化漆酶相对活性的关系示意图
图3戊二醛浓度和醛基去除对漆酶固定化的影响示意图
图4固定化漆酶使用次数与固定化漆酶相对活性的关系示意图
具体实施方式
以下通过实施例进一步描述本发明。以下的实施例具体解释本发明，本发明的范围不受实施例的限制。
实施例1：
1嫁接氨基
(1)将10.0克80目多孔硅胶和100毫升1摩尔/升的盐酸混合浸泡8小时，用去离子水洗涤若干次，放置到80℃真空干燥箱中干燥8小时。
(2)将1.0克上述处理的载体和20毫升γ-氨丙基三乙氧基硅烷、60毫升甲苯置于250毫升锥形瓶中，超声混合均匀，放置到96℃冷凝回流装置中回流11h。依次用甲苯、蒸馏水和无水乙醇各清洗3-4次。
2嫁接醛基
将1.0克上述嫁接氨基的载体与25毫升2.5％的戊二醛水溶液混合均匀，在真空条件下超声30分钟，在室温条件下静置30分钟。洗涤干燥。
3漆酶的固定化
(1)将0.7克上述制备的载体与7毫升pH＝7.0，浓度为5毫克/毫升的漆酶溶液混合均匀，置于垂直混合器于4℃中固定12小时。
(2)将经洗涤后的固定化漆酶放置到pH＝8.0的乙醇胺-盐酸溶液中静置2小时。
实施例2
1嫁接氨基
(1)10.0克100目多孔硅胶和100毫升1摩尔/升的盐酸混合浸泡8小时，用去离子水洗涤若干次，放置到80℃真空干燥箱中干燥8小时。
(2)将1.0克上述处理的载体和20毫升γ-氨丙基三乙氧基硅烷、60毫升甲苯置于250毫升锥形瓶中，超声混合均匀，放置到96℃冷凝回流装置中回流11h。依次用甲苯、蒸馏水、无水乙醇各清洗3-4次。
2嫁接醛基
将1.0克上述嫁接氨基的载体与25毫升5％的戊二醛水溶液混合均匀，在真空条件下超声30分钟，在室温条件下静置30分钟。洗涤干燥。
3漆酶固定化
将0.7克上述制备的载体与7毫升pH＝7.0，浓度为5毫克/毫升的漆酶溶液混合均匀，置于垂直混合器于4℃中固定12小时。
实施例3
1嫁接氨基
(1)将10.0克120目多孔硅胶和100毫升1摩尔/升的盐酸混合浸泡8小时，用去离子水洗涤若干次，放置到80℃真空干燥箱中干燥8小时。
(2)将1.0克上述处理的载体和20毫升γ-氨丙基三乙氧基硅烷、60毫升甲苯置于250毫升锥形瓶中，超声混合均匀，放置到96℃冷凝回流装置中回流11h。依次用甲苯、蒸馏水和无水乙醇各清洗3-4次。
2嫁接醛基
将1.0克上述嫁接氨基的载体与25毫升2.5％的戊二醛水溶液混合均匀，在真空条件下超声30分钟，在室温条件下静置30分钟。洗涤干燥。
3漆酶固定化
(1)将0.7克上述制备的载体与7毫升pH＝7.0，浓度为5毫克/毫升的漆酶溶液混合均匀，置于垂直混合器于4℃中固定12小时。
(2)将经洗涤后的固定化漆酶放置到pH＝8.0的乙醇胺-盐酸溶液中静置2小时。
实施例4
1嫁接氨基
(1)10.0克60目多孔硅胶和100毫升1摩尔/升的盐酸混合浸泡8小时，用去离子水洗涤若干次，放置到80℃真空干燥箱中干燥8小时。
(2)将1.0克上述处理的载体和20毫升γ-氨丙基三乙氧基硅烷、60毫升甲苯置于250毫升锥形瓶中，超声混合均匀，放置到96℃冷凝回流装置中回流11h。依次用甲苯、蒸馏水、无水乙醇各清洗3-4次。
2嫁接醛基
将1.0克上述嫁接氨基的载体与25毫升2.5％的戊二醛水溶液混合均匀，在真空条件下超声30分钟，在室温条件下静置30分钟。洗涤干燥。
3漆酶的固定化
(1)0.7克上述制备的载体与7毫升pH＝7.0，浓度为5毫克/毫升的漆酶溶液混合均
匀，置于垂直混合器于10℃中固定12小时。
(2)将经洗涤后的固定化漆酶放置到pH＝8.0的乙醇胺-盐酸溶液中静置2小时。
实施例5
1嫁接氨基
(1)将10.0克80目多孔硅胶和100毫升1摩尔/升的盐酸混合浸泡8小时，用去离子水洗涤若干次，放置到80℃真空干燥箱中干燥8小时。
(2)将1.0克上述处理的载体和20毫升γ-氨丙基三乙氧基硅烷、60毫升甲苯置于250毫升锥形瓶中，超声混合均匀，放置到96℃冷凝回流装置中回流11h。依次用甲苯、蒸馏水和无水乙醇各清洗3-4次。
2嫁接醛基
将1.0克上述嫁接氨基的载体与25毫升2.5％的戊二醛水溶液混合均匀，在真空条件下超声30分钟，在室温条件下静置30分钟。洗涤干燥。
3漆酶的固定化
(1)0.7克上述制备的载体与7毫升pH＝7.0，浓度为5毫克/毫升的漆酶溶液混合均匀，置于垂直混合器于20℃中固定12小时。
(2)将经洗涤后的固定化漆酶放置到pH＝8.0的乙醇胺-盐酸溶液中静置2小时。
实施例6
1嫁接氨基
(1)将10.0克100目多孔硅胶和100毫升1摩尔/升的盐酸混合浸泡8小时，用去离子水洗涤若干次，放置到80℃真空干燥箱中干燥8小时。
(2)将1.0克上述处理的载体和20毫升γ-氨丙基三乙氧基硅烷、60毫升甲苯置于250毫升锥形瓶中，超声混合均匀，放置到96℃冷凝回流装置中回流11h。依次用甲苯、蒸馏水和无水乙醇各清洗3-4次。
2嫁接醛基
将1.0克上述嫁接氨基的载体与25毫升2.5％的戊二醛水溶液混合均匀，在真空条件下超声30分钟，在室温条件下静置30分钟。洗涤干燥。
3漆酶的固定化
(1)0.7克上述制备的载体与7毫升pH＝7.0，浓度为5毫克/毫升的漆酶溶液混合均匀，置于垂直混合器于30℃中固定12小时。
(2)将经洗涤后的固定化漆酶放置到pH＝8.0的乙醇胺-盐酸溶液中静置2小时。
实施例7
1嫁接氨基
(1)将10.0克80目多孔硅胶和100毫升1摩尔/升的盐酸混合浸泡8小时，用去离子水洗涤若干次，放置到80℃真空干燥箱中干燥8小时。
(2)将1.0克上述处理的载体和20毫升γ-氨丙基三乙氧基硅烷、60毫升甲苯置于250毫升锥形瓶中，超声混合均匀，放置到96℃冷凝回流装置中回流11h。依次用甲苯、蒸馏水和无水乙醇各清洗3-4次。
2嫁接醛基
将1.0克上述嫁接氨基的载体与25毫升2.5％的戊二醛水溶液混合均匀，在真空条件下超声30分钟，在室温条件下静置30分钟。洗涤干燥。
3漆酶的固定化
(1)0.7克上述制备的载体与7毫升pH＝7.0，浓度为5毫克/毫升的漆酶溶液混合均匀，置于垂直混合器于4℃中固定24小时。
(2)将经洗涤后的固定化漆酶放置到pH＝8.0的乙醇胺-盐酸溶液中静置2小时。
Claims (3)
1.一种在多孔硅胶载体上固定化漆酶的方法，其特征在于：包括步骤如下
1)载体的制备
(a)多孔硅胶先用1摩尔/升的盐酸浸泡8-12小时，然后在60-80℃下烘干；
(b)称取所需的烘干后的硅胶置于三角瓶中，向其中加入体积比为1∶3的γ-氨丙基三乙氧基硅烷和甲苯混合液，将三角瓶连入冷凝回流装置，氨基化8-12小时；
(c)将氨基化的硅胶依次用甲苯、蒸馏水和无水乙醇各清洗3-4次；
(d)将2.5％-5％质量分数的戊二醛水溶液与所需的氨基化硅胶充分混合，置于真空抽气装置；
(e)在真空状态下超声反应30分钟；
(f)置于常温常压下静置30分钟；
(g)将嫁接上醛基的多孔硅胶载体低温干燥，即获得固定化用的多孔硅胶载体；
2)漆酶的固定化
(a)将步骤1)中得到的干燥多孔硅胶载体与溶于pH＝7.0磷酸缓冲溶液的漆酶充分混合，置于垂直混合器上于4℃条件下固定12小时；
(b)用pH＝7.0磷酸缓冲溶液洗涤，并收集洗涤液，直到洗涤液中没有蛋白检出；
(c)将固定化好的漆酶放置在pH＝8.0乙醇胺-盐酸缓冲溶液中静置2小时；
(d)将静置后的固定化漆酶用pH＝7.0的磷酸缓冲溶液洗涤若干次，然后低温真空干燥制备成固定化漆酶成品。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中：步骤1)中多孔硅胶载体粒径为80-100目。
3.根据权利要求1中所述的方法，其中：多孔硅胶载体的孔径为10-50纳米。
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