CN111321135A - 一种集成酶气凝胶复合材料及其制备方法以及葡萄糖含量的检测方法 - Google Patents
一种集成酶气凝胶复合材料及其制备方法以及葡萄糖含量的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种集成酶气凝胶复合材料，由双亲气凝胶通过吸附法将天然酶和模拟酶同时固定在三维网状结构中制备得到，所述天然酶是能够催化目标物分解产生过氧化氢的酶；所述模拟酶是具有类过氧化物酶活性的物质。本发明利用聚乙烯醇为主要原料、顺丁烯二酸为辅助交联剂，同时加入少量多壁碳纳米管以改善产物机械性能，最终合成出具备双亲性质的气凝胶，可同时吸附水相和有机溶剂相。根据这一性质，将溶于有机相和水相的氯化血红素和葡萄糖氧化酶，分别吸附于气凝胶胶体内部，实现对级联反应的催化。气凝胶作为天然酶固定化的载体，提高了酶的稳定性，防止酶在催化过程中的泄漏，简化了催化反应的步骤，缩短了反应时间，更利于葡萄糖含量检测。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种集成酶气凝胶复合材料及其制备方法以及葡萄糖含量的检测方法。
背景技术
天然酶是一类非常重要的生物催化剂，它可以在温和的条件下高效特异地催化化学反应。天然酶的催化作用依赖于酶的一级结构和空间结构的完整。由于天然酶的本质是蛋白质或者RNA，所以天然酶存在容易变性、稳定性差、难以回收利用和生产成本高等问题。将游离酶修饰于固体材料上或限制在一定区域内，可以提高其稳定性，易于催化反应的控制与催化剂的回收，降低成本。固定化酶在生物工业、化学分析、医学及临床诊断、环境保护、能源开发与基础研究方面发挥了重要作用。
目前，将酶固定在载体上的方法主要有包埋法、共价结合法和交联法。
其中，包埋法的基本原理是载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化的方法。该方法需要通过引发剂进行聚合反应进行包埋，操作相对繁琐，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，因此对一些反应不适用。
共价结合法是指酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团通过形成化学共价键实现不可逆结合的酶固定方法，又称载体偶联法。该方法下固定的酶，易发生不可逆失活。
交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键的一种酶固定方法。该方法属于化学固定化法，需要通过化学反应进行固定，与酶分子上的官能团反应时无法保证活性中心不受影响，因此，易导致酶的失活。
发明内容
鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种集成酶气凝胶复合材料及其制备方法以及葡萄糖含量的检测方法，通过吸附法将天然酶和模拟酶同时固定在双亲气凝胶三维网状结构中，制备的集成酶气凝胶具有优异的机械性能，被固定的酶不易发生泄漏，并且具有高效的催化效率；同时，气凝胶作为酶载体，在一定程度上提高了酶的热稳定性。
本发明提供了一种集成酶气凝胶复合材料，由双亲气凝胶通过吸附法将天然酶和模拟酶同时固定在双亲气凝胶三维网状结构中制备得到，
所述天然酶是能够催化目标物反应产生过氧化氢的酶；
本发明中，所述模拟酶指模拟天然酶活性的物质，是具有类过氧化物酶活性的物质。
所述天然酶和模拟酶共同负载于载体双亲气凝胶的三维网状结构中，组成了集成酶。
集成酶是指将催化级联反应的两种或几种酶集成到一起，使第一个催化反应的产物直接作为第二个催化反应的底物。
本发明中，所述集成酶的选择可以根据目标物任意安排，例如葡萄糖氧化酶催化葡萄糖分解，乳酸氧化酶催化乳酸分解。因此，任意可以产生过氧化氢的反应物都可以作为目标物，然后将催化目标物分解的酶与过氧化物酶组合。
在本发明的一些具体实施例中，所述天然酶是葡萄糖氧化酶，所述目标物是葡萄糖。
在本发明的另外一些具体实施例中，所述天然酶是乳酸氧化酶，所述目标物是乳酸。
在本发明的另外一些具体实施例中，所述天然酶是胆固醇氧化酶，所述目标物是胆固醇。
在本发明的另外一些具体实施例中，所述天然酶是胆碱氧化酶，所述目标物是胆碱。
所述模拟酶优选为氯化血红素。氯化血红素可以用其他具有类过氧化物酶活性的模拟酶代替，如四氧化三铁纳米粒子，氧化石墨烯，金属有机框架材料。
所述双亲气凝胶是指表面既亲水又亲油的气凝胶。
优选的，所述双亲气凝胶为以聚乙烯醇为主要原料合成的双亲性质的气凝胶。
本发明提供了集成酶气凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1)将聚乙烯醇、辅助交联剂顺丁烯二酸，和多壁碳纳米管、无机酸混合，反应得到双亲气凝胶；
S2)将双亲气凝胶依次在模拟酶溶液中、天然酶溶液中充分浸润，得到集成酶气凝胶复合材料。
优选的，所述步骤S1)中，反应的温度为120-200℃，反应的时间为16-48h。
在本发明的一些具体实施例中，反应在200℃烘箱中进行。
优选的，所述步骤S1)具体为：
在聚乙烯醇水溶液中，加入辅助交联剂顺丁烯二酸，搅拌溶解，然后加入多壁碳纳米管和无机酸，搅拌均匀，进行反应。
所述聚乙烯醇水溶液的浓度优选为8wt％。
所述辅助交联剂顺丁烯二酸和聚乙烯醇的比例关系优选为顺丁烯二酸中的-COOH与聚乙烯醇中的-OH的比例为1％～100％，例如1％、30％、50％、70％、100％，更优选为30％。
所述多壁碳纳米管优选为水分散液。
优选的，所述多壁碳纳米管水分散液浓度为2mg/mL，其体积与反应液总体积比至少为1:10。
所述无机酸优选为浓硫酸，
优选的，所述浓硫酸体积与反应液总体积比为1:10-1:20。
优选的，所述步骤S1)还包括：
将得到的双亲气凝胶在去离子水中浸泡至溶液呈中性，经过冷冻干燥、超临界法干燥或自然晾干。
然后将得到的双亲气凝胶依次在模拟酶溶液中、天然酶溶液中得到充分浸润，以获得集成酶气凝胶复合材料。
优选的，所述步骤S2)具体为：
将双亲气凝胶浸没于模拟酶溶液中，待胶体充分浸润后，取出干燥；然后浸没于天然酶溶液中，充分浸润后，取出干燥，得到集成酶气凝胶复合材料。
所述模拟酶、天然酶的种类同上，在此不再赘述。
所述模拟酶溶液的溶剂优选为二甲基亚砜；所述天然酶溶液的溶剂优选为水。
所述模拟酶溶液的浓度优选为5-30mM，更优选为25mM。所述天然酶溶液的浓度优选为5-45mg/mL，更优选为40mg/mL。
本发明合成的双亲气凝胶具有优异的机械性能、高的孔隙率、大的比表面积和亲水亲油性质。除此以外，其具有以下优势：
第一、亲水亲油的特性，相比于只亲水或只亲油的气凝胶具有更广泛的应用。
第二、该双亲气凝胶的三维网状结构和高的孔隙率为集成酶提供了保护作用。与游离酶相比，固定后的酶提高了热稳定性。
第三、气凝胶表面含有丰富的含氧基团(包括酯基、羧基、羟基和环氧基)，有利于与天然酶或模拟酶形成多位点的非共价键相互作用(包括氢键、静电作用、疏水基团间的相互作用等)，起到酶固定作用，同时不影响酶活性。
第四、在湿润环境中浸泡一定时间，气凝胶中负载的集成酶不会发生大量泄漏和遗失，依然可以保持大部分的催化活性。因此，该气凝胶是非常理想的固定化酶的载体材料。
第五、优异的机械性能使气凝胶材料更适合应用于实际场景中。在湿润环境中对气凝胶进行循环压缩，其内部的酶不会发生大量泄漏和遗失，依然可以保持大部分的催化活性，更有利于实际生活中的应用。
本发明采用吸附法制备集成酶气凝胶，与其他固定酶的方法相比，吸附法操作简单，固定效果好，不影响酶活性，而且吸附过程更为迅速。
实验结果表明，本发明制备的双亲气凝胶具有优异的机械性能，在形变50％的情况下，反复20次仍能保持结构完整。集成酶气凝胶在干燥及溶液中按压30次，其催化活性不受影响。
所述双亲气凝胶在200℃条件下合成，而且具有高孔隙率。在高温下(70-100℃)，为葡萄糖氧化酶和氯化血红素提供了很好的保护作用，使酶的稳定性提高。因此，与游离酶相比，集成酶具有更高的热稳定性。
本发明将级联催化的两种酶集成在气凝胶中，简化了催化反应的步骤，缩短了反应时间，更利于葡萄糖含量检测。
基于此，本发明提供了一种目标物含量的检测方法，包括以下步骤：
A)将上述集成酶气凝胶或上述制备方法制备的集成酶气凝胶，和含目标物的样本接触，并加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺进行显色；
B)通过检测652nm处的紫外吸收峰的强度，定量样本中目标物含量。
本发明中，所述含目标物的样本可以为汗液、血液或缓冲液等本领域技术人员熟知的样本形式。
具体的，本发明提供了一种葡萄糖含量的检测方法，包括以下步骤：
A)将上述集成酶气凝胶或上述制备方法制备的集成酶气凝胶，和含葡萄糖的样本接触，并加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺进行显色；
B)通过检测652nm处的紫外吸收峰的强度，定量样本中葡萄糖含量。
所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)被氧化后oxTMB显蓝色，在652nm处可检测到紫外吸收峰。
本发明中，所述接触可以为混合。
本发明中集成酶气凝胶材料的合成及其催化过程如图1所示。
本发明采用集成酶气凝胶材料，将葡萄糖氧化酶和氯化血红素集成到气凝胶中，可以简化级联催化的过程。在有葡萄糖存在的溶液中，葡萄糖氧化酶首先发挥催化作用将葡萄糖分解成过氧化氢，继而氯化血红素催化过氧化氢分解成羟基自由基，与此同时氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色。检测652nm处的紫外吸收峰的强度，以此来定量葡萄糖的含量。
本发明中，所述含葡萄糖的样本可以为汗液、血液或缓冲液等本领域技术人员熟知的样本形式。
本发明中，信号输出为比色法，采用比色法检测比较直观，肉眼可观测并初步判断反应进程。
与现有技术相比，本发明提供了一种集成酶气凝胶复合材料，由双亲气凝胶通过吸附法将天然酶和模拟酶同时固定在三维网状结构中制备得到，所述天然酶是能够催化目标物分解产生过氧化氢的酶；所述模拟酶是具有类过氧化物酶活性的物质。本发明利用聚乙烯醇为主要原料、顺丁烯二酸为辅助交联剂，同时加入少量多壁碳纳米管以改善产物机械性能，最终合成出具备双亲性质的气凝胶，可同时吸附水相和有机溶剂相。利用这一性质，可以同时吸附水相中的葡萄糖氧化酶和有机相中的氯化血红素。同时因其具有比表面积大和孔隙率高的优点，所以也是一种优良的酶载体。相比于其他只亲水或只亲油的气凝胶，具有更广泛的应用。
附图说明
图1为集成酶气凝胶材料的合成及其催化过程示意图；
图2为实施例1制备的双亲气凝胶的扫描电镜图(a)，实施例3制备的负载氯化血红素的双亲气凝胶的扫描电镜图(b)，负载氯化血红素和葡萄糖氧化酶的双亲气凝胶(集成酶气凝胶)的扫描电镜图(c)；
图3为实施例1制备的双亲气凝胶的比表面积柱状图(a)，气凝胶与水滴接触角测试(b)；
图4为集成酶气凝胶与游离酶在高温处理5分钟后酶活性比较柱状图(a)，集成酶气凝胶在50℃和100℃下的热扩散系数(b)，双亲气凝胶形变50％时循环20次应力与应变关系图(c)，集成酶气凝胶在空气中压缩0次，10次，20次和30次酶活性比较柱状图(d)，集成酶气凝胶在水相中压缩0次，10次，20次和30次酶活性比较柱状图(e)，集成酶气凝胶在缓冲溶液中浸泡时间与催化活性关系图(f)；
图5为集成酶气凝胶在检测葡萄糖含量时浓度与吸收的关系图(a)，检测葡萄糖的选择性实验柱状图(b)；
图6为集成酶气凝胶重复使用三次的催化活性柱状图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的集成酶气凝胶复合材料及其制备方法以及葡萄糖含量的检测方法进行详细描述。
实施例1
制备双亲气凝胶
在11mL聚乙烯醇水溶液(质量浓度8wt％)中，加入辅助交联剂顺丁烯二酸，控制顺丁烯二酸的加入量，使顺丁烯二酸中的-COOH与聚乙烯醇中的-OH的比例依次为1％、30％、50％、70％、100％，搅拌溶解，然后加入多壁碳纳米管水溶液1mL(浓度2mg/mL)和无机酸1mL(浓硫酸)，混合均匀。最后将溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，放入200℃烘箱，反应24h。所得气凝胶在去离子水中浸泡除去杂质，冷冻干燥。得到双亲气凝胶，记为1-1～1-5。
采用扫描电镜对制备的双亲气凝胶进行表征，扫描电镜图如图2中图a所示。
测试双亲气凝胶的比表面积，结果如图3中图a所示，图a为五种双亲气凝胶的比表面积柱状图。其中，X代表-COOH/-OH的比值，-COOH来自于顺丁烯二酸，-OH来自于聚乙二醇。
可以看出，随着-COOH/-OH的比值逐渐增大，气凝胶的比表面积先增大后降低，在X的值为30％的时候比表面积达到峰值。
实施例2
制备双亲气凝胶
按照实施例1的方法，控制顺丁烯二酸的加入量，使顺丁烯二酸中的-COOH与聚乙烯醇中的-OH的比例依次为1％、30％、50％、70％、100％，制备得到双亲气凝胶，记为2-1～2-5。
测试双亲气凝胶与水的接触角，结果如图3中图b所示。其中，X代表-COOH/-OH的比值，-COOH来自于顺丁烯二酸，-OH来自于聚乙二醇。可以看出，随着顺丁烯二酸的量逐渐增大，水滴与气凝胶的接触角逐渐减小，X的值大于或者等于30％时接触角为零，说明随着顺丁烯二酸的量逐渐增多，气凝胶的亲水性质越来越好，当X≧30％时，气凝胶均具有双亲性质。
实施例3
集成酶气凝胶的制备
葡萄糖氧化酶溶解在水中(质量浓度40mg/mL)，氯化血红素溶解在二甲基亚砜有机溶剂中(物质的量浓度25mM)。双亲气凝胶1-2首先浸没于氯化血红素溶液中，吸附饱和后用镊子夹出，自然干燥。然后将上述气凝胶再浸没于葡萄糖氧化酶溶液中，吸附饱和后取出，自然干燥。得到集成酶气凝胶。
分别将负载氯化血红素、负载葡萄糖氧化酶后的双亲气凝胶进行形貌检测，负载氯化血红素的双亲气凝胶的扫描电镜图如图2中图b所示，负载氯化血红素和葡萄糖氧化酶的双亲气凝胶(集成酶气凝胶)的扫描电镜图如图2中图c所示。
对制备得到的集成酶气凝胶和游离酶(葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶)同时进行高温处理，分别在70℃，80℃，90℃和100℃下保持5min，然后在pH值4.5，温度50℃下催化葡萄糖分解。
酶活性比较如图4中图a所示，可以看出，游离酶在高温处理后，酶活性迅速降低。集成酶因气凝胶的保护作用对于高温有一定耐受能力，酶活性缓慢降低。在100℃下处理5min，集成酶对葡萄糖的催化活性是游离酶的270倍。如图4中b所示，考察集成酶气凝胶分别在50℃和100℃下的热扩散系数，在高温下热扩散系数低，低温下热扩散系数高，100℃下的热扩散系数是50℃下的41.6％，说明凝胶基质内的传热速度随着温度升高而降低，这有利于在高温下保护气凝胶内部负载的天然酶和模拟酶。
使集成酶气凝胶发生形变50％，并重复20次，应力与应变关系如图4中图c所示。可以看出，双亲气凝胶具有优异的机械性能，在形变量为50％、循环压缩20次，仍然可以保持结构完整。
对集成酶气凝胶在空气中压缩0次、10次、20次、30次，检测其酶活性，结果如图4中图d所示，可以看出，集成酶气凝胶在负载两种酶之后，其机械性能没有受到影响，压缩10次，20次和30次之后，对葡萄糖的催化性能与没经过压缩的气凝胶相比没有明显差别。
对集成酶气凝胶在水相中压缩0次、10次、20次、30次，检测其酶活性，结果如图4中图e所示，可以看出，两种酶通过吸附法固定到气凝胶中的效果很好，气凝胶与两种酶之间的非共价键作用力使得酶没有大量的泄露和遗失。在水相中压缩30次，催化活性仍高达初始值的91.6％。如图4中图f所示，集成酶气凝胶在缓冲溶液中浸泡18h，其催化活性依旧保持在初始状态的77％以上。
实施例4
利用集成酶气凝胶检测缓冲溶液中的葡萄糖
利用实施例3制备的集成酶气凝胶与不同浓度的葡萄糖反应，加入TMB进行显色，通过检测652nm处的紫外吸收峰的强度，定量葡萄糖含量。
缓冲液：10mM醋酸缓冲溶液，pH值为4.5，温度为37℃。葡萄糖浓度分别为0，0.05mM，0.1mM，0.2mM，0.4mM，0.8mM，1.2mM，1.6mM。
在葡萄糖的浓度为0-1.6mM的范围内，随着葡萄糖浓度的增加，652nm的吸收值越来越大。在0.05-0.8mM的线性范围内，葡萄糖的浓度与吸收值符合方程Y＝2.85X+0.0592(R2＝0.992)。通过计算，葡萄糖的检出限为11.4μM。如图5中图a所示，图a为集成酶气凝胶在检测葡萄糖含量时浓度与吸收的关系图。
实施例5
考察检测葡萄糖的选择性
葡萄糖的类似物包括蔗糖、麦芽糖、乳糖和果糖。
集成酶气凝胶分别与葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和果糖反应，加入TMB进行显色，通过检测652nm处的紫外吸收峰的强度，定量被检测物含量。
如图5中图b所示，这四种类似物在反应体系下响应信号很低，说明对葡萄糖的检测基本没有影响。
实施例6
同一集成酶气凝胶在多次催化作用中，催化性能变化测试
利用实施例3制备的集成酶气凝胶与葡萄糖反应，加入TMB进行显色，通过检测652nm处的紫外吸收峰的强度，定量葡萄糖含量。同一块气凝胶连续催化同一反应三次。
如图6中所示，集成酶气凝胶最少可以使用两次进行葡萄糖定量。
实施例7
用集成酶气凝胶检测汗液中的葡萄糖含量。
首先收集两个运动志愿者的汗液样本，采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪检测汗液中的葡萄糖含量，结果分别为8.2μM和14.1μM，将其作为汗液中葡萄糖的理论值。然后在20％的汗液中分别加入50μM和100μM的葡萄糖标准品，采用比色法进行检测，所得回收率在95.6％-104.4％之间。说明20％的汗液基质对该方法的检测准确性没有影响。结果如表1所示。表1超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪与比色法检测汗液中葡萄糖含量结果对比
注：联用仪检测的是汗液中葡萄糖含量，比色法检测的是20％汗液中加标葡萄糖的含量。
实施例8
利用集成酶气凝胶检测血液中的葡萄糖
首先利用血糖仪对全血中的葡萄糖进行定量，测得血糖含量为6.44mM。
经计算，1.0％全血，1.5％全血和2.0％的全血中葡萄糖的含量分别为64.4μM，96.6μM和128.8μM。
然后利用比色法检测1.0％全血，1.5％全血和2.0％全血中葡萄糖的含量，所得回收率在94.8％-105.3％之间。
进一步在稀释的全血样品中加入相应的葡萄糖标准品，然后再利用比色法进行检测，所得回收率在97.2％-99.2％之间。
说明该方法具有良好的生物基质抗干扰性和在全血中准确定量葡萄糖含量的能力。
检测结果如表2所示。
表2血糖仪与比色法检测全血中葡萄糖含量结果对比。
由上述实施例可知，本发明提供的葡萄糖含量的检测方法具有较高的准确性，是一种新的葡萄糖含量的检测方法。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种集成酶气凝胶复合材料，由双亲气凝胶通过吸附法将天然酶和模拟酶同时固定在三维网状结构中制备得到，
所述天然酶是能够催化目标物分解产生过氧化氢的酶；
所述模拟酶是具有类过氧化物酶活性的物质。
2.根据权利要求1所述的集成酶气凝胶复合材料，其特征在于，所述天然酶是葡萄糖氧化酶，所述目标物是葡萄糖；
或者所述天然酶是乳酸氧化酶，所述目标物是乳酸；
或者所述天然酶是胆固醇氧化酶，所述目标物是胆固醇；
或者所述天然酶是胆碱氧化酶，所述目标物是胆碱；
所述模拟酶是氯化血红素，四氧化三铁纳米粒子，氧化石墨烯或金属有机框架材料。
3.根据权利要求1所述的集成酶气凝胶复合材料，其特征在于，所述双亲气凝胶为以聚乙烯醇为主要原料合成的双亲性质的气凝胶。
4.一种集成酶气凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1)将聚乙烯醇、辅助交联剂顺丁烯二酸，和多壁碳纳米管、无机酸混合，反应得到双亲气凝胶；
S2)将双亲气凝胶依次在模拟酶溶液中、天然酶溶液中充分浸润，得到集成酶气凝胶复合材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1)还包括：
将得到的双亲气凝胶在去离子水中浸泡至溶液呈中性，冷冻干燥、超临界法干燥或自然晾干。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述天然酶为葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶；所述模拟酶为氯化血红素。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述模拟酶溶液的溶剂为二甲基亚砜；所述天然酶溶液的溶剂为水。
8.一种目标物含量的检测方法，包括以下步骤：
A)将权利要求1～3任一项所述的集成酶气凝胶或权利要求4～7任一项所述的制备方法制备的集成酶气凝胶，和含目标物的样本接触，并加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺进行显色；
B)通过检测652nm处的紫外吸收峰的强度，定量样本中目标物含量。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述含目标物的样本为汗液、血液或缓冲液。
10.一种葡萄糖含量的检测方法，包括以下步骤：
A)将权利要求1～3任一项所述的集成酶气凝胶或权利要求4～7任一项所述的制备方法制备的集成酶气凝胶，和含葡萄糖的样本接触，并加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺进行显色；
B)通过检测652nm处的紫外吸收峰的强度，定量样本中葡萄糖含量。
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