CN104857954A

CN104857954A - 底物高亲和力氧化石墨烯负载纳米铂模拟过氧化物酶及其制备方法

Info

Publication number: CN104857954A
Application number: CN201510180524.8A
Authority: CN
Inventors: 陈伟; 林小青; 邓豪华; 彭花萍; 刘爱林
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2015-04-16
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2035-04-16
Also published as: CN104857954B

Abstract

本发明公开一种底物高亲和力氧化石墨烯负载纳米铂模拟过氧化物酶及其制备方法。氧化石墨烯作为稳定剂控制纳米铂粒子的生成。本发明是一种新型复合纳米材料的制备方法，具有制备简单环保，无需高温，无需添加表面活性剂的优点。所得的铂纳米粒子平均粒径为9.0nm。制备方法重现性好，所得产物可保持4个月以上的稳定性。同时，合成的氧化石墨烯-纳米铂复合材料具有良好的模拟过氧化物酶活性，可催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色。对底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和过氧化氢均具有高亲和力。可用于检测低浓度的过氧化氢，催化产物吸光度与过氧化氢浓度在0.1-25mmol/L范围内呈线性相关，检测限为0.03561mmol/L。

Description

底物高亲和力氧化石墨烯负载纳米铂模拟过氧化物酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及以氧化石墨烯为载体制备铂纳米粒子复合材料的方法，该复合材料具有底物高亲和力模拟过氧化物酶特性，属于纳米技术和仿生技术领域。

背景技术

纳米材料具有表面效应、量子尺寸效应、体积效应以及宏观量子隧道效应等优越性能，在催化、磁性、光吸收和热阻等方面表现出奇特的物理和化学性能。贵金属铂，是化学性质最稳定的元素之一，在本体尺度上呈现化学惰性，但纳米级的铂粒子却具有特殊的物理化学性能，使其在生物传感器、光化学与电化学催化、半导体荧光探针、光电子器件等领域有着极其广阔的应用前景。近年来，研究者们致力于用不同的方法制备各种结构和性能的铂纳米材料。然而在实际应用中，铂纳米材料呈现出了制约其进一步应用的缺陷，如溶液中的低分散性、易产生团聚沉降现象、应用中电子传递途径易被部分阻断及表面活性位点易被掩盖等，因此在不破坏纳米粒子本身特性的情况下，深入研究进一步探索溶液体系分散稳定性的新型纳米材料具有重要的意义。

氧化石墨烯，作为石墨烯的衍生物之一，是由石墨经过层间剥离氧化，得到氧化石墨进一步超声而获得。由于氧化石墨烯的片层状表面含有大量的含氧活性基团，如羟基、羧基、羰基、环氧基等，使其具有良好的生物相容性和水溶性。因此，为了稳定铂纳米粒子表面的高能量特性，本发明在室温常压下以氧化石墨烯为支架载体，通过原位合成方法，制备氧化石墨烯-纳米铂复合材料。氧化石墨烯作为稳定剂控制纳米铂的形貌和尺寸。

酶是对其特异底物有高效催化作用的蛋白质和核酸，以前者为主，其在维持生物体内各种有条不紊的生命活动和化学反应等基本过程发挥着重要作用。然而，天然酶来源有限，提纯复杂困难，保存条件苛刻，操作过程易受多种物理、化学环境影响导致变性失活等，这些缺陷大大地限制了天然酶进一步的应用。近年来，人工模拟酶的研究开发与应用受到了人们的广泛关注。过氧化物酶主要是催化过氧化氢或有机过氧化物，对多种有机物或无机物产生氧化作用。目前，对人工模拟过氧化物酶的研究主要集中在对模拟酶的结构、功能、催化特性和分析应用等方面上。本发明提供了一种基于氧化石墨烯-纳米铂复合材料的底物高亲和力、高活性、高稳定性模拟过氧化物酶。

发明内容

本发明的目的是在室温常压下以氧化石墨烯为支架载体，通过原位合成方法，制备氧化石墨烯-纳米铂复合材料。所得的氧化石墨烯-纳米铂复合材料具有底物高亲和力模拟过氧化酶的特性。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：所述的底物高亲和力氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶，其特征是能催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色，氧化石墨烯-纳米铂复合材料对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐具有高亲和力，其米氏常数为0.04064 mmol/L，同时对过氧化氢也具有高亲和力，其米氏常数为10.19 mmol/L。

上述所得到的铂纳米粒子负载在氧化石墨烯片层表面，铂纳米粒子的平均粒径为9.0 nm。

上述所得到的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液放置4个月以上无沉降物出现。

上述所得到的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液能催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色产物，该产物在652 nm处有最大吸收峰。

上述的氧化石墨烯-纳米铂复合纳米材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的活性在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲盐溶液pH范围在4.5-5.0，温度为30℃，反应时间为10分钟，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的浓度为 0.1244 mmol/L时达到最大。

上述的氧化石墨烯-纳米铂复合材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的显色产物吸光值与过氧化氢浓度在0.1-25 mmol/L范围内的呈线性相关，相关系数r=0.9886，检测限为0.03561 mmol/L。

本发明所述的底物高亲和力氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶的制备方法，其特征是由以下步骤组成：在氧化石墨烯水溶液中加入氯铂酸水溶液，搅拌混匀后加入硼氢化钠，常温下磁力搅拌反应4小时，将所得的氧化石墨烯-纳米铂水溶液冷冻干燥得到氧化石墨烯-纳米铂粉末。

上述所使用的基底氧化石墨烯制备方法为：称取325目鳞片石墨1.2 g，加入到144 mL浓硫酸和16 mL磷酸的混合溶液中，充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将7.2 g高锰酸钾以少量多次方式缓慢加入到以上混合溶液中进行低温插层反应，保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至35℃温水浴进行中温反应，控温反应1小时，再将得到的混悬液转移至50℃温水浴进行高温深度氧化，控温12小时，得到的紫黑色混悬液缓慢加入到160 mL冰水混合物中，剧烈搅拌1小时，继而往溶液中逐滴滴加4.8 mL 30wt%过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色，所得溶液经G1砂芯漏斗过滤，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液；在沉淀中加入80 mL 双蒸水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入80 mL 30wt%盐酸充分振荡洗涤，经G1砂芯漏斗过滤去除不溶颗粒，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经G5砂芯漏斗过滤，滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。取100 mg氧化石墨溶解于50 mL双蒸水，常温下超声5小时，充分剥离后得到2 mg/mL透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液。

上述氧化石墨烯水溶液浓度为2 mg/mL，氯铂酸水溶液浓度为10 mg/mL，硼氢化钠溶液浓度为5 mg/mL，所述氧化石墨烯水溶液、氯铂酸水溶液、硼氢化钠溶液的体积比为369:23:8。

具体地说，本发明采用技术方案为：

（一）氧化石墨烯的制备：称取325目鳞片石墨，加入到体积比为9:1的浓硫酸和磷酸混合溶液中。充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中进行低温插层反应。磁力搅拌3小时后，将所得的墨绿色混悬液转移至35℃温水浴进行中温反应，控温反应1小时。再将得到的混悬液转移至50℃温水浴进行高温深度氧化，控温12小时。得到的紫黑色混悬液缓慢加入到冰水混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加30%过氧化氢溶液，至溶液颜色突变为亮黄色。所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，继而4000转每分钟离心30分钟，分别经过一次水洗和一次酸洗后，醇洗至中性，最后用乙醚冲洗后经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到氧化石墨。将所得氧化石墨分散于双蒸水，常温下超声5小时，充分剥离后得到氧化石墨烯水溶液。

（二）氧化石墨烯-纳米铂复合材料的制备：往9.225 mL浓度为2 mg/mL的氧化石墨烯溶液中加入0.575 mL浓度为10 mg/mL的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15分钟后，逐滴加入0.2 mL浓度为5 mg/mL硼氢化钠水溶液，磁力搅拌4小时。得到的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液呈深棕色，将得到的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液用双蒸水稀释50倍待用，置于4 ℃保存。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。

（三）氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶活性：

通过氧化石墨烯-纳米铂复合材料催化过氧化物酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐产生蓝色底物，验证和比较其过氧化物酶活性。在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中依次加入过氧化氢、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液，混匀后温浴10分钟，肉眼观察颜色的变化或测定652 nm波长处的吸光度值。根据溶液颜色或通过测定吸光度值确定其过氧化物酶活性。

（四）氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶检测过氧化氢：

通过氧化石墨烯-纳米铂复合材料催化过氧化物酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐产生蓝色底物，检测低浓度过氧化氢。在最优条件下，在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中依次加入过氧化氢、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液，混匀后温浴10分钟，测定652 nm波长处的吸光度值。通过吸光度值标准曲线对过氧化氢浓度进行定量。

本发明的优点：

（1）本发明制备方法绿色环保，操作简便快速。

（2）本发明制备的铂纳米粒子仅分布在氧化石墨烯表面，无其他形式的副产物生成，得到的铂纳米粒子平均粒径小。合成过程重现性好，水溶液分散性和稳定性高。

（3）本发明氧化石墨烯-纳米铂复合材料具有良好的过氧化物酶活性。

（4）本发明氧化石墨烯-纳米铂复合材料同时对底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和过氧化氢具有高亲和力。

（5）本发明氧化石墨烯-纳米铂复合材料能定量检测过氧化氢，检测限低，灵敏度高。

附图说明

图1为反应后放置0和120小时后氧化石墨烯-纳米铂溶液和纳米铂溶液的外观图。其中，A和C为纳米铂溶液，B和D为氧化石墨烯-纳米铂溶液。

图2为氧化石墨烯-纳米铂溶液和纳米铂溶液的紫外可见吸收光谱图，图中a为有纳米铂时，b为有氧化石墨烯-纳米铂时。

图3为氧化石墨烯-纳米铂复合材料的拉曼光谱图。

图4为氧化石墨烯-纳米铂复合材料的透射电镜图。

图5为氧化石墨烯-纳米铂复合材料的X射线光电子能谱图。

图6为氧化石墨烯-纳米铂复合材料的X射线衍射图谱。

图7为氧化石墨烯-纳米铂复合材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的外观颜色变化图。

图8为氧化石墨烯-纳米铂复合材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的紫外吸收光谱图，图中a为无氧化石墨烯-纳米铂时，b为有氧化石墨烯-纳米铂时。

图9为pH值对氧化石墨烯-纳米铂复合材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响。

图10为温度对氧化石墨烯-纳米铂复合材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响。

图11为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐浓度对氧化石墨烯-纳米铂复合材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响。

图12氧化石墨烯-纳米铂复合材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系随时间的变化图。

图13为氧化石墨烯-纳米铂复合材料浓度对氧化石墨烯-纳米铂复合材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响。

图14为氧化石墨烯-纳米铂复合材料对于过氧化氢的稳态动力学曲线。

图15为氧化石墨烯-纳米铂复合材料对于3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的稳态动力学曲线。

图16为氧化石墨烯-纳米铂复合材料检测过氧化氢标准曲线。

具体实施方式

实例1：

称取325目鳞片石墨1.2 g，加入到144 mL浓度为18.4 mol/L的浓硫酸和16 mL浓度为14.7 mol/L的磷酸的混合溶液中。充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将7.2 g高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中进行低温插层反应。保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿色混悬液转移至35℃温水浴进行中温反应，控温反应1小时。再将得到的混悬液转移至50℃温水浴进行高温深度氧化，控温12小时。得到的紫黑色混悬液缓慢加入到160 mL冰水混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加4.8 mL 30wt%过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色。所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，滤液4000转/分钟离心30分钟，弃去上清液；在沉淀中加入80 mL 双蒸水充分振荡洗涤，4000转/分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入80 mL 30wt%盐酸充分振荡洗涤，经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤去除不溶颗粒，滤液4000转/分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000转/分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。取100 mg氧化石墨溶解于50 mL双蒸水，常温下超声5小时，充分剥离后得到2 mg/mL透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液。

实例2：

在9.225 mL浓度为2 mg/mL的氧化石墨烯溶液中加入0.575 mL浓度为10 mg/mL的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15分钟后，逐滴加入0.2 mL浓度为5 mg/mL的硼氢化钠水溶液，磁力搅拌4小时。在没有氧化石墨烯的条件下得到的纳米铂水溶液呈棕色，而氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液呈深棕色（见图1中的A和B）。放置120小时后，纳米铂溶液出现完全沉降现象，而氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液仍呈现良好的分散性（见图1中的C和D）。扫描纳米铂和氧化石墨烯-纳米铂的紫外可见吸收光谱，氧化石墨烯-纳米铂水溶液在230 nm处有最大吸收值，而没有氧化石墨烯的条件下得到的纳米铂水溶液则未显现吸收峰（见图2）。

实例3：

在9.225 mL浓度为2 mg/mL的氧化石墨烯溶液中加入0.575 mL浓度为10 mg/mL的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15分钟后，逐滴加入0.2 mL浓度为5 mg/mL的硼氢化钠水溶液，磁力搅拌4小时。所得的溶液冷冻干燥后，取所得的粉末进行拉曼光谱表征，在1336 cm^-1 和1593 cm^-1处出现氧化石墨烯的D峰和G峰（见图3）。

实例4：

在9.225 mL浓度为2 mg/mL的氧化石墨烯溶液中加入0.575 mL浓度为10 mg/mL的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15分钟后，逐滴加入0.2 mL浓度为5 mg/mL的硼氢化钠水溶液，磁力搅拌4小时。将所得溶液滴涂在铜网上进行透射电镜检测，铂纳米粒子平均粒径为9.0 nm，并呈不规则形状（见图4）。

实例5：

在9.225 mL浓度为2 mg/mL的氧化石墨烯溶液中加入0.575 mL浓度为10 mg/mL的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15分钟后，逐滴加入0.2 mL浓度为5 mg/mL的硼氢化钠水溶液，磁力搅拌4小时。所得的溶液冷冻干燥后，取所得的粉末进行X射线光电子能谱测定，在71.88 eV和75.33 eV出现铂的4f峰（见图5）。

实例6：

在9.225 mL浓度为2 mg/mL的氧化石墨烯溶液中加入0.575 mL浓度为10 mg/mL的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15分钟后，逐滴加入0.2 mL浓度为5 mg/mL的硼氢化钠水溶液，磁力搅拌4小时。所得的水溶液冷冻干燥后，取所得的粉末进行X射线衍射测定，如图6所示，在9.1o和15.7o处出现氧化石墨烯的特征峰，在39.8o、46.4o和67.7o处出现的特征峰分别对应铂的晶面（111）、（200）和（220）。

实例7：

在9.225 mL浓度为2 mg/mL的氧化石墨烯溶液中加入0.575 mL浓度为10 mg/mL的氯铂酸水溶液，混匀剧烈搅拌15分钟后，逐滴加入0.2 mL浓度为5 mg/mL的硼氢化钠水溶液，磁力搅拌4小时。将得到的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液用双蒸水稀释50倍（铂含量为4.33×10^-3g/L），在放置4个月以上无沉淀物出现。

实例8：

在3.67 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH=5.0，10 mmol/L）中依次加入0.25 mL浓度为0.5 mol/L的过氧化氢，0.03 mL浓度为16.58 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和0.05 mL氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液（铂含量为4.33×10^-3g/L），混匀后30 ℃温浴10分钟。如图7所示，随着体系反应，溶液由无色变为蓝色。对反应后的溶液进行紫外可见吸收光谱测定，在652 nm处有一显著的吸收峰（见图8）。

实例9：

在3.67 mL不同pH值磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（10 mmol/L）中依次加入0.25 mL浓度为0.5 mol/L的过氧化氢，0.03 mL浓度为16.58 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和0.05 mL实例7制备的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液（铂含量为4.33×10^-3g/L），混匀后30 ℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。如图9所示，氧化石墨烯-纳米铂复合材料相对催化活性在磷酸盐缓冲液pH值为4.5-5.0时达到最大。

实例10：

在3.67 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH=5.0，10 mmol/L）中依次加入0.25 mL浓度为0.5 mol/L的过氧化氢，0.03 mL浓度为16.58 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和0.05 mL实例7制备的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液（铂含量为4.33×10^-3g/L），混匀后分别在不同温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。如图10所示，在温度为20℃-30℃间，吸光值增大的幅度甚微，但当高于30℃，吸光值有明显的下降趋势，且随着温度的继续增大，溶液呈现的颜色偏黄，所以本实验选取30℃为该体系的控温条件。

实例11：

在3.67 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH=5.0，10 mmol/L）中依次加入0.25 mL浓度为0.5 mol/L的过氧化氢，0.03mL不同浓度的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和0.05 mL实例7制备的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液（铂含量为4.33×10^-3g/L），混匀后30℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。如图11所示，当3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的浓度为 0.1244 mmol/L，吸光值达到最大。

实例12：

在3.67 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH=5.0，10 mmol/L）中依次加入0.25 mL浓度为0.5 mol/L的过氧化氢，0.03 mL浓度为16.58 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和0.05 mL实例7制备的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液（铂含量为4.33×10^-3g/L），混匀后30 ℃温浴不同时间（1分钟、3分钟、5分钟、7分钟、10分钟、15分钟、20分钟），测定652 nm波长处吸光度。如图12所示，氧化石墨烯-纳米铂复合材料相对催化活性随着反应时间变长而增大，到10分钟后逐渐趋于平衡，为了保证实验的检测效率，本体系选取了10分钟作为反应时间。

实例13：

在3.67 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH=5.0，10 mmol/L）中依次加入0.25 mL浓度为0.5 mol/L的过氧化氢、0.03 mL浓度为16.58 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和0.05 mL不同浓度的实例7制备的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液，混匀后30 ℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。如图13所示，随着体系里催化剂的浓度增大，吸光值也呈现线性的增长，但当催化剂的浓度达到54.1461 μg/L时，体系的吸光值趋于平缓。

实例14：

在3.67mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH=5.0，10 mmol/L）中依次加入0.25 mL不同浓度的过氧化氢、0.03 mL浓度为16.58 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和0.05 mL实例7制备的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液（铂含量为4.33×10^-3g/L），混匀后30 ℃温浴1分钟，测定652 nm波长处吸光度，计算初速度。如图14所示，通过米氏方程拟合，可以得出氧化石墨烯-纳米铂复合材料对底物过氧化氢的米氏常数为10.19 mmol/L。

实例15：

在3.67mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH=5.0，10 mmol/L）中依次加入0.25 mL浓度为0.5 mol/L的过氧化氢、0.03 mL不同浓度的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和0.05 mL实例7制备的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液（铂含量为4.33×10^-3g/L），混匀后30 ℃温浴1分钟，测定652 nm波长处吸光度，计算初速度。如图15所示，通过米氏方程拟合，可以得出氧化石墨烯-纳米铂复合材料对底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的米氏常数为0.04064 mmol/L。

实例16：

在3.67mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH=5.0，10 mmol/L）中依次加入0.25 mL不同浓度的过氧化氢、0.03 mL浓度为16.58 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和0.05 mL实例7制备的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液（铂含量为4.33×10^-3g/L），混匀后30℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。如图16所示，过氧化氢浓度在0.1-25 mmol/L范围内，显色产物的吸光度与过氧化氢浓度呈线性相关（r=0.9886），检测限为0.03561 mmol/L。

Claims

1.一种底物高亲和力氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶，其特征是能催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色，氧化石墨烯-纳米铂复合材料对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐具有高亲和力，其米氏常数为0.04064 mmol/L，同时对过氧化氢也具有高亲和力，其米氏常数为10.19 mmol/L。

2.根据权利要求1所述的一种底物高亲和力氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶，其特征是所得到的铂纳米粒子负载在氧化石墨烯片层表面，铂纳米粒子的平均粒径为9.0 nm。

3.根据权利要求1所述的一种底物高亲和力氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶，其特征是所得到的氧化石墨烯-纳米铂复合材料水溶液放置4个月以上无沉降物出现。

4.根据权利要求1所述的一种底物高亲和力氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶，其特征是能催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色产物，该产物在652 nm处有最大吸收峰。

5.根据权利要求1或4所述的一种底物高亲和力氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶，其特征是氧化石墨烯-纳米铂复合纳米材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的活性在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲盐溶液pH范围在4.5-5.0，温度为30℃，反应时间为10分钟，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的浓度为 0.1244 mmol/L时达到最大。

6.根据权利要求5所述的一种底物高亲和力氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶，其特征是氧化石墨烯-纳米铂复合材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的显色产物吸光值与过氧化氢浓度在0.1-25 mmol/L范围内的呈线性相关，相关系数r=0.9886，检测限为0.03561 mmol/L。

7.一种底物高亲和力氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶的制备方法，其特征是由以下步骤组成：在氧化石墨烯水溶液中加入氯铂酸水溶液，搅拌混匀后加入硼氢化钠，常温下磁力搅拌反应4小时，将所得的氧化石墨烯-纳米铂水溶液冷冻干燥得到氧化石墨烯-纳米铂粉末。

8.根据权利要求7所述的一种底物高亲和力氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶的制备方法，其特征是它所使用的基底氧化石墨烯制备方法为：称取325目鳞片石墨1.2 g，加入到144 mL浓硫酸和16 mL磷酸的混合溶液中，充分搅拌后，置于在0℃冰浴中;

将7.2 g高锰酸钾以少量多次方式缓慢加入到以上混合溶液中进行低温插层反应，保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至35℃温水浴进行中温反应，控温反应1小时，再将得到的混悬液转移至50℃温水浴进行高温深度氧化，控温12小时，得到的紫黑色混悬液缓慢加入到160 mL冰水混合物中，剧烈搅拌1小时，继而往溶液中逐滴滴加4.8 mL 30wt%过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色，所得溶液经G1砂芯漏斗过滤，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液；在沉淀中加入80 mL 双蒸水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入80 mL 30wt%盐酸充分振荡洗涤，经G1砂芯漏斗过滤去除不溶颗粒，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经G5砂芯漏斗过滤，滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯;

取100 mg氧化石墨溶解于50 mL双蒸水，常温下超声5小时，充分剥离后得到2 mg/mL透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液。

9.根据权利要求7或8所述的一种底物高亲和力氧化石墨烯-纳米铂复合材料模拟过氧化物酶的制备方法，其特征是氧化石墨烯水溶液浓度为2 mg/mL，氯铂酸水溶液浓度为10 mg/mL，硼氢化钠溶液浓度为5 mg/mL，所述氧化石墨烯水溶液、氯铂酸水溶液、硼氢化钠溶液的体积比为369:23:8。