CN114414514A - 一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法及其在酒精浓度检测中的应用 - Google Patents
一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法及其在酒精浓度检测中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于酒精浓度检测材料技术领域，具体涉及一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法及其在酒精浓度检测中的应用，本发明通过共沉淀法合成高纯度、纳米尺寸的锰类普鲁士蓝材料，该方法操作简单，成本低廉，不需苛刻的操作环境，而且产率高，能够在常温常压下实现材料的制备。同时，工艺简单，成本低廉，便于实现工业化。此外，本发明利用该锰类普鲁士蓝优秀的过氧化物酶活性与天然的酒精氧化酶通过级联反应构建可检测不同酒精浓度的平台，该平台可准确且稳定的检测酒精浓度，室温下对酒精检测有着检测浓度范围大，极限检测浓度低等优点，且本发明基于锰类普鲁士蓝纳米酶的酒精浓度检测平台对酒精检测的应用具有良好的特异性。
Description
技术领域
本发明属于酒精浓度检测材料技术领域，具体涉及一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法及其在酒精浓度检测中的应用。
背景技术
酒精，是乙醇的俗称，最初来源于酿酒造酒中谷物的发酵。当今社会，酒精在各行各业都有着特有的作用，比如食品制造、医用消毒、国防化工等行业。而在一些低酒精浓度的使用环境下，如何精准地获得酒精的浓度是一个亟需解决的问题。目前，主要是通过酒精试剂盒进行酒精浓度的检测，常用的酒精试剂盒主要是采用酶比色法，即通过酒精经乙醇氧化酶氧化生成过氧化氢，再经乙醇分析探针产生颜色，最后通过分光光度计或者荧光分析得到结果。这种方法具有优秀的特异性和出色的检测精度，但同时也需要较高的检测成本。
纳米酶作为一种新型的纳米材料，具有成本低、环境耐受性好，模拟酶反应时信号灵敏等多种优点。因为特定的纳米酶时常会具备多酶活性，从而在不同的pH条件下发挥不同的酶催化活性。其中，普鲁士蓝类纳米酶通常具备出色的过氧化物酶活性，且能够通过较少的量在过氧化氢存在的情况下使得TMB发生颜色的改变，这种颜色的改变可通过紫外分光光度计较好的检测出来。而且利用纳米酶来检测相关物质的信号，一方面可以很好地节约成本，另一面其对温度和pH的耐受性也能利用其更好地模拟酶的催化活性。因此，开发一种可用于酒精浓度检测的普鲁士蓝类纳米酶具有重要的应用价值。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法。
本发明的第二个目的是提供采用上述制备方法制备得到的锰类普鲁士蓝纳米酶在酒精浓度检测中的应用。以锰铁作为双活性中心的锰类普鲁士蓝作为酒精浓度检测材料的应用，在室温下对不同浓度的酒精表现出了较好的线性和准确性，对乙醇也表现出不错的特异性。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：
一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1、将二价铁盐溶于水中制成铁源溶液A；
S2、将二价锰盐溶于水中制成锰源溶液B；
S3、将步骤S1的铁源溶液A缓慢加入步骤S2的锰源溶液B中，使铁源和锰源在恒温下发生共沉淀反应，滴加完毕后继续恒温反应一段时间；反应后冷却至温室，经离心、洗涤和干燥后制备得到锰类普鲁士蓝纳米酶。
优选地，所述二价铁盐包括亚铁氰化钾。
优选地，所述二价锰盐包括乙酸锰。
优选地，所述二价铁盐在铁源溶液A中的浓度为1mmol/15-25mL。具体地，所述二价铁盐在铁源溶液A中的浓度为1mmol/20mL。
优选地，所述二价锰盐在锰源溶液B中的浓度为1mmol/70-90mL。具体地，所述二价锰盐在锰源溶液B中的浓度为1mmol/80mL。
优选地，所述恒温的温度为50-70℃；滴加完毕后继续反应30-60min。具体地，所述恒温的温度为60℃；滴加完毕后继续反应45min。
本发明还提供了采用所述制备方法制备得到的锰类普鲁士蓝纳米酶。
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：
所述的锰类普鲁士蓝纳米酶在酒精浓度检测中的应用。
本发明制备的用于酒精检测的纳米酶材料，所用的纳米材料组分为锰类普鲁士蓝，并且，该锰类普鲁士蓝纳米颗粒有着出色的过氧化物酶的活性，且与过氧化氢和TMB的结合符合天然酶的规律，具有能通过较少的量检测出较强的信号等优点，展现出优异的检测酒精的性能。本发明利用制备得到的锰类普鲁士蓝纳米酶进行酒精浓度检测，由于该锰类普鲁士蓝纳米酶本身具有锰和铁的活性中心，使其具有过氧化物酶的特性以及较好的反应活性。仅用终浓度为12.5μg/mL的锰类普鲁士蓝即可准确地检测出25μmmol/L～2.5mmol/L终浓度的酒精样品，同时检测结果符合米氏方程，且在低浓度区域有着较好的信号，最终检测限(LOD)值为7.23μmmol/L。可见，本发明通过锰类普鲁士蓝进行酒精浓度检测时，具有检测范围大、准确性高、特异性好等优点。
本发明还提供了一种检测酒精浓度的方法，即将待测酒精与含有酒精氧化酶的缓冲液进行混合，孵育后加入由所述锰类普鲁士蓝纳米酶制成的悬浮液，NaAc-HAc缓冲液和TMB溶液，然后在652nm的波长下检测吸光度，最后计算得到酒精浓度。
本发明以制备得到的锰类普鲁士蓝作为纳米酶，模拟过氧化物酶的催化活性，在酒精和酒精氧化酶反应生成的过氧化氢共同作用下，氧化TMB发生颜色变化，可通过反馈颜色信号应用于检测酒精的有无，且在酸性条件下与H2O2、TMB的混合溶液在652nm下有较强的光吸收峰，可用于检测并计算酒精的浓度。同时，本发明的锰类普鲁士蓝在不同的pH和温度下表现出优异的稳定性，对乙醇表现出出色的特异性。
优选地，所述孵育为37℃恒温条件下孵育30min。
优选地，含有酒精氧化酶的缓冲液、锰类普鲁士蓝纳米酶悬浮液、NaAc-HAc缓冲液和TMB溶液的体积比为5：5：80：5。
优选地，含有酒精氧化酶的缓冲液中，天然酶的浓度为2.5U，锰类普鲁士蓝纳米酶悬浮液的浓度为0.25mg/mL，NaAc-HAc缓冲液的pH为3.5，TMB溶液的浓度为10mmol/L。
优选地，检测吸光度采用紫外分光光度进行，检测的波长为652nm。
优选地，酒精浓度的检测极限值LOD为7.23μmol/L。
优选地，所述酒精浓度的检测范围为25μmmol/L～2.5mmol/L。
还提供了一种用于检测酒精浓度的试剂盒，所述试剂盒包括所述的锰类普鲁士蓝纳米酶。
优选地，锰类普鲁士蓝纳米酶为由锰类普鲁士蓝纳米酶制成的悬浮液。
优选地，所述试剂盒还包括含有酒精氧化酶的缓冲液、锰类普鲁士蓝纳米酶悬浮液、NaAc-HAc缓冲液和TMB溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法，本发明通过共沉淀法合成高纯度、纳米尺寸的锰类普鲁士蓝材料，本发明利用共沉淀法制备锰类普鲁士蓝纳米酶的方法操作简单，成本低廉，不需苛刻的操作环境，而且产率高，能够在常温常压下实现材料的制备。同时，本发明的锰类普鲁士蓝纳米酶制备方法，工艺简单，成本低廉，便于实现工业化。此外，本发明利用上述锰类普鲁士蓝优秀的过氧化物酶活性与天然的酒精氧化酶通过级联反应构建可检测不同酒精浓度的平台，该平台可准确且稳定的检测酒精浓度，室温下对酒精检测有着检测浓度范围大，极限检测浓度低等优点，且本发明基于锰类普鲁士蓝纳米酶的酒精浓度检测平台对酒精检测的应用具有良好的特异性。
附图说明
图1为锰类普鲁士蓝纳米酶的X射线衍射图；
图2为锰类普鲁士蓝纳米酶的扫描电子显微镜图；
图3为锰类普鲁士蓝纳米酶模拟过氧化物酶活性过程中的吸收光谱图；
图4为锰类普鲁士蓝纳米酶的动力学测试曲线；
图5为锰类普鲁士蓝纳米酶随温度的活性变化图；
图6为通过锰类普鲁士蓝纳米酶检测酒精浓度的原理图；
图7为锰类普鲁士蓝纳米酶检测不同浓度酒精时的活性变化曲线；
图8为锰类普鲁士蓝纳米酶对不同醇类的检测特异性曲线。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1锰类普鲁士蓝纳米酶的制备
本实施采用锰源溶液和铁源溶液共沉淀的方法来制备锰类普鲁士蓝纳米酶。其中采用的锰盐是Mn(CH3COO)2·4H2O(乙酸锰)，铁盐是K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，采用的水都是去离子水，反应容器都为玻璃烧杯。具体制备方法包括以下步骤：
(1)称取1mmol二价铁盐K4[Fe(CN)6]，室温下搅拌溶解于20mL水中，配制成铁源溶液A；
(2)称取1mmol二价锰盐Mn(CH3COO)2·4H2O，室温下搅拌溶解于80mL水中，配制成锰源溶液B；
(3)将步骤(1)中的溶液A用滴管恒速逐滴地滴入步骤(2)的溶液B中，控制滴速为1mL/min，滴加过程中在60℃的恒温下进行共沉淀反应；在这一反应中逐滴加入的铁盐和锰盐开始结晶，并形成纳米级的晶体，滴加完毕后在60℃的恒温条件下反应45min；
(4)将步骤(3)中的混合溶液冷却至室温，转移后进行离心分离，离心分离采用的速度为12000r/min，离心后的溶液用去离子水洗涤，重复三次。将三次离心后带有少量水分的样品放入冷冻干燥机中，冷冻干燥72h使水分完全除去，得到粉白色的锰类普鲁士蓝纳米酶材料。
对本实施例所得的锰类普鲁士蓝纳米酶材料进行X射线衍射、扫描电子显微镜分析。其中，X射线衍射图如图1所示，表明制备得到的锰类普鲁士蓝纳米酶符合该类物质的晶型；扫描电子显微镜图如图2所示，可见锰类普鲁士蓝是一种直径约20～50nm的纳米级颗粒，这种颗粒具有不规则的形状，但总体的直径大小较为均匀。
实施例2模拟过氧化物酶模型的建立
本实施例模拟过氧化酶的具体过程包括以下步骤：
(1)纳米酶悬浮液的配制：取实施例1的锰类普鲁士蓝纳米酶(简称PB)，将其溶于去离子水中，浓度为0.25mg/mL，然后对悬浮液进行超声处理，使纳米酶均匀分散在水溶液中制得纳米酶悬浮液；
(2)配制初始浓度为1mol/L的H2O2溶液和初始浓度为5mmol/L的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液，以及使用0.2mol/L的NaAc溶液和0.2mol/L的HAc溶液配制的NaAc-HAc(pH＝4.5)缓冲液。
(3)取10μL纳米酶悬浮液，150μL NaAc-HAc(pH＝4.5)缓冲液，20μL H2O2溶液，20μLTMB溶液加入比色皿中，即完成模拟过氧化物酶的配制。
选取本实施例中获得的模拟过氧化物酶模型采用紫外分光光度计进行活性测试，其中选择480nm-760nm波段测量吸收峰；选择波长为652nm的条件进行酶活性动力学测试，测试结果如图3与图4所示。从图3可以看出，在未加入锰类普鲁士蓝类材料时，其他组分在652nm处几乎无明显的吸收峰，而纳米酶材料加入后，产生了强度较高的吸收峰，表现为无色的TMB被氧化转变成蓝色。从图4可以看出，在动力学测试中，具有纳米酶组分的溶液吸光度急剧地上升，证明该类材料具有出色的过氧化物酶活性。而后测试了在不同温度变化(25℃-43℃)下锰类普鲁士蓝的催化活性，测试结果如图5所示。从图5可以看出，在较宽的温度范围下，锰类普鲁士蓝纳米酶材料仍能较好地发挥过氧化物酶活性，具有出色的稳定性，远优于天然酶。
实施例3锰类普鲁士蓝纳米酶在酒精浓度检测中的应用
以实施例2中基于锰类普鲁士蓝纳米酶材料获取的模拟过氧化物酶模型来构建酒精浓度检测平台进行酒精浓度的检测实验，检测的原理如图6所示。由于基于锰类普鲁士蓝纳米酶材料具有过氧化物酶的特性，酸性条件下，在H2O2存在的情况下，TMB会被氧化，同时发生从无色到蓝色的显色反应。而酒精在酒精氧化酶存在的条件下，会被氧化为乙醛同时生成H2O2，这就为该试验的实施提供了条件。在该实施中，选取50μL不同初始浓度的酒精(500、250、100、50、20、10、5、1、0.5mmol/L)与50μL含有酒精氧化酶的缓冲液(含天然酶2.5U，即往1.36μL的酒精氧化酶中加入10mM PBS缓冲溶液48.64μL制得)进行混合，在37℃的恒温条件下孵育30min，而后加入50μL初始浓度为0.25mg/mL的锰类普鲁士蓝纳米酶悬浮液，800μLNaAc-HAc(pH＝3.5)的缓冲液，50μL初始浓度为10mmol/L的TMB溶液，然后在波长为652nm的条件下进行动力学测试。不同浓度的酒精样品加入后的活性测试结果如图7所示，可以看出总体曲线的趋势符合米氏方程，同时在低浓度段(25μmmol/L～2.5mmol/L终浓度的酒精)具有良好的线性，说明在这一浓度范围下，可以有效准确地检测酒精的浓度。同时，通过公式计算检测极限值LOD(S/N＝3)，得出LOD值为7.23μmol/L。计算公式如下：
LOD＝3×N/(ΔA/ΔM)；
其中，N为20个空白样的标准偏差，此处为2×10-4；ΔA/ΔM为在一定时间内吸光度随样品浓度的变化趋势，可由图7的直线部分可换算得到此处的ΔA/ΔM为0.083。
根据上述的线性关系，在25μmmol/L～2.5mmol/L终浓度的酒精浓度范围内，可通过公式(v＝k/39000*108，v为速度，单位为10-9M·s-1；k为特定浓度下吸光度变化曲线的斜率，)测量得到酒精的浓度，即首先通过实施例2的检测方法采用紫外分光光度计测量不同浓度待测酒精的吸光度，获取其斜率k，然后将k代入上述公式即可得到v，将v值代入速度-浓度曲线(图7)，即可得到对应的酒精浓度。
随后对该种纳米酶检测酒精的特异性进行测定。选取200mmol/L不同种醇类的作为最初的样品(甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、苯甲醇、戊醇)，加入测试环境中进行测试。特异性测试的结果如图8所示，可以看出该类纳米酶对于乙醇有着极为出色的特异性。在相同的加入浓度下，经过相同的时间，采用乙醇的样品吸光度有着更加明显的上升，相比之下，大部分醇类没有明显的信号上升，只有少量与乙醇结构相似的醇类会有较弱的信号。
综上所述可知，基于本发明制备的锰类普鲁士蓝纳米酶材料构建的酒精浓度测定平台具有优秀的检测活性，较宽的检测范围，明显的信号响应。针对于不同的温度变化，该类材料具有良好的模拟酶稳定性；针对于不同的醇类，该类材料具有出色的特异性，能运用到实际的酒精浓度检测当中。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将二价铁盐溶于水中制成铁源溶液A；
S2、将二价锰盐溶于水中制成锰源溶液B；
S3、将步骤S1的铁源溶液A缓慢加入步骤S2的锰源溶液B中，使铁源和锰源在恒温下发生共沉淀反应，滴加完毕后继续恒温反应一段时间；反应后冷却至温室，经离心、洗涤和干燥后制备得到锰类普鲁士蓝纳米酶。
2.根据权利要求1所述的一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述二价铁盐包括亚铁氰化钾。
3.根据权利要求1所述的一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述二价锰盐包括乙酸锰。
4.根据权利要求1所述的一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述二价铁盐在铁源溶液A中的浓度为1mmol/15-25mL。
5.根据权利要求1所述的一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述二价锰盐在锰源溶液B中的浓度为1mmol/70-90mL。
6.根据权利要求1所述的一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述恒温的温度为50-70℃；滴加完毕后继续反应30-60min。
7.采用权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的锰类普鲁士蓝纳米酶。
8.权利要求7所述的锰类普鲁士蓝纳米酶在酒精浓度检测中的应用。
9.一种检测酒精浓度的方法，其特征在于，将待测酒精与含有酒精氧化酶的缓冲液进行混合，孵育后加入由权利要求7所述的锰类普鲁士蓝纳米酶制成的悬浮液，NaAc-HAc缓冲液和TMB溶液，然后在652nm的波长下检测吸光度，最后计算得到酒精浓度。
10.一种用于检测酒精浓度的试剂盒，其特征在于，包括权利要求7所述的锰类普鲁士蓝纳米酶。
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