CN115678880A - 一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法及其应用 - Google Patents
一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法及其应用，属于功能材料技术领域，本发明为解决传统的葡萄糖检测方法检测过程较为复杂，而且效率较低的问题。本申请利用新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖进行检测的原理在于普鲁士蓝的类过氧化物酶的催化活性使得其在酸性条件催化过氧化氢羟基自由基，之后由羟基自由基氧化显色剂TMB产生蓝色的oxTMB，发生显色反应，并能在波长为652nm处产生明显的吸收峰。利用中空的普鲁士蓝的中空结构来搭载葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖分解产生过氧化氢，再由作为外壳的中空的普鲁士蓝纳米酶催化氧化过氧化氢，再借助显色剂TMB来达到对葡萄糖的检测。本申请提供的新型生物酶主要用来检测葡萄糖。
Description
技术领域
本发明属于功能材料技术领域，具体涉及一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法及其应用。
背景技术
目前，由于天然酶具有价格较高，制备困难，稳定性差，不易贮存等固有局限性，使得各种酶模拟物(如人工酶)得以出现和发展。其中，纳米酶作为一种具有生物酶催化性质的纳米材料，是新一代的酶模拟物。由于生物酶大多是以蛋白质为主要成分，稳定性差，容易在高温、pH过高或过低以及体内复杂环境下导致结构破坏从而失去活性，因此对环境的依赖程度高，无法在体内或其他特定环境下应用，导致催化效率低。因此，需要研发一种结构性能稳定，在高温或酸性碱性等特殊环境下依然具有高催化性质的材料，如纳米酶。
相比于生物酶，纳米酶更易于制备储存，且成本较低，稳定性高，便于进一步修饰，并且随着技术的发展，越来越多的纳米材料被成功制备，且有多种纳米材料被发现具有与天然酶和生物酶相似的催化活性，能够高效地催化生化反应，如普鲁士蓝纳米酶。纳米材料的这些优点使得纳米酶在越来越多的领域替代天然酶，成为主要研究对象。其中，类过氧化物酶由于其在生物传感和纳米医学上的广泛应用，吸引了众多科研团队，成为纳米酶领域的主要研究对象。
过氧化物酶是一种以过氧化物为底物进行催化的酶，目前在生物分析等领域有着广泛的应用。早在2006年，有团队发现四氧化三铁的磁性纳米颗子具有与过氧化物酶相似的催化活性，在过氧化物存在的情况下，该材料能使显色剂发生显色反应。除四氧化三铁磁性纳米颗粒外，有很多纳米材料被证实具有类过氧化物酶的催化活性，且已应用于过氧化氢和葡萄糖的检测，如Co3O4纳米颗粒、V2O5纳米线和ZnFe2O4磁性纳米材料。
由于自然界中存在着大量的过氧化氢，且过氧化氢的用途十分广泛。医学上日常消毒的就是过氧化氢，俗称医用双氧水，可用于物体表面的消毒，工业上常被用来做氧化剂和漂白剂或电镀液。此外，过氧化氢是生命体代谢的重要信号，因此对过氧化氢的检测研究十分重要。普鲁士蓝纳米酶被发现具有类过氧化物酶催化活性。可以通过使用显色剂，运用比色法来完成对过氧化氢的检测。
除过氧化氢外，对葡萄糖的检测也不容忽视。目前，由于生活水平的提高，罹患糖尿病的人群和糖尿病潜在患者人群数量急剧上升，因此探究对葡萄糖的检测方法是十分必要的。目前的酶固定化研究是将生物酶组装固定到纳米酶中，利用纳米酶将其包覆，能够很好的提高酶的稳定性，这些固定化酶主要集中与体外，多用作生物检测。
普鲁士蓝最早是在18世纪由一位德国的涂料工人狄斯巴赫发现，他把草木灰(主要成分为碳酸钾)和牛的血液混合，然后焙烧，再用水浸泡焙烧后所得的物质，过滤掉不溶物质，得到澄清的溶液，将溶液中的水蒸发以后，便析出一种黄色的晶体。当狄斯巴赫将得到的黄色晶体放入氯化铁的溶液中后，得到了一种颜色非常明亮的蓝色沉淀。经过进一步的实验，狄斯巴赫发现这种蓝色的沉淀性能优良，可以作为稳定的涂料使用，他将这种涂料的生产方法严格保密，并取名为普鲁士蓝。
普鲁士蓝纳米酶的的催化性能在于表面电子的传递。普鲁士蓝纳米酶是一种金属氧化物纳米酶，Fe3+/Fe2+的标准氧化还原电位是0.77V，TMB的为1.13V，Fe3+/Fe2+无法直接将电子从TMB转移到过氧化氢，且反应过程中能检测出羟基自由基的存在，因此可以推断出，Fe3+/Fe2+首先将电子转移给过氧化氢，产生羟基自由基，再由羟基自由基氧化TMB。2016年，张薇团队发现了普鲁士蓝纳米颗粒受pH的影响，呈现出多酶的活性。在酸性条件下，普鲁士蓝纳米颗粒表现出过氧化物酶的活性；而在中性及碱性环境下，表现出过氧化氢酶和超氧化歧化酶的活性。
将得到的普鲁士蓝材料经过盐酸高温腐蚀可得到中空的普鲁士蓝材料(HPB)，其所形成的中空结构为储能、装载药物提供了一定的空间。此外，中空的普鲁士蓝并不影响普鲁士蓝的内部结构，不改变它的类过氧化物酶的催化活性，仅改变了其外部样貌，而且中空的结构使得普鲁士蓝纳米酶的比表面积增大，为普鲁士蓝催化过氧化氢提供了更多的活性位点。而且中空的普鲁士蓝纳米酶很好的继承了普鲁士蓝的光热效果，并且其中空结构可以用来装载药物杀死肿瘤细胞，可以用于医学上的光热-化学协同治疗。另外，搭载药物的中空的普鲁士蓝纳米酶可为其内部药物提供一定的保护作用，避免受外界环境的影响，这在化学催化和生物医学领域具有极大的研究价值。
目前针对于葡萄糖检测方法是采用两步法，即先将葡萄糖氧化酶和葡萄糖混合均匀，孵育一段时间后，再加入类过氧化物酶和显色剂，待溶液颜色稳定后再测量吸光度，此种方法在检测过程中较为复杂，而且效率较低，因此研发一种双酶系统可以直接对葡萄进行检测是很符合实际需要。
发明内容
本发明为解决传统的葡萄糖检测方法检测过程较为复杂，而且效率较低的问题，进而提供一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法及其应用；
一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法，所述制备方法是通过如下步骤实现的：
步骤一：合成普鲁士蓝纳米酶；
步骤二：将步骤一中合成后的普鲁士蓝纳米酶进行酸化，制得中空结构的普鲁士蓝纳米酶；
步骤三：将步骤二中所得的中空结构的普鲁士蓝纳米酶作为载体搭载葡萄糖氧化酶，形成新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统；
步骤四：使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测量步骤三中新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统内的葡萄糖氧化酶含量，计算中空的普鲁士蓝中葡萄糖氧化酶的负载量，基于中空的普鲁士蓝中葡萄糖氧化酶的负载量，判断新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统中葡萄糖氧化酶的最大含量；
进一步地，所述步骤一中合成普鲁士蓝纳米酶的具体步骤是通过以下步骤实现的：
步骤一一：称取1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，32mg铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])放置在烧杯中，再加入20mL浓度为0.01M的盐酸溶液，利用磁力搅拌器搅拌成混合液，搅拌时间为4h；
步骤一二：将步骤一一中所得的混合液置于反应釜中，并将带有混合液的反应釜放入烘箱，加热温度为80℃，反应时间为24h，使混合液在反应釜中充分反应；
步骤一三：将步骤一二中反应后的混合液从反应釜中取出并冷却至室温后，将冷却后的混合液进行离心处理，离心转速为12000rpm，离心时间为15min；
步骤一四：提取步骤一三中经过离心处理后混合液的上清液，经水洗离心两次，乙醇洗离心一次，获得普鲁士蓝纳米酶(PB)溶液；
进一步地，所述步骤二中制得中空结构的普鲁士蓝纳米酶的具体步骤是通过以下步骤实现的；
步骤二一：将步骤一中所得的普鲁士蓝纳米酶(PB)溶液稀释后备用；
步骤二二：称取20mg步骤二一中所得的稀释溶液、100mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与0.1M的盐酸组成20mL的混合液，并将混合液置于磁力搅拌器上搅拌4h；
步骤二三：将步骤二二中所得的混合液装入反应釜中，并将带有混合液的反应釜放入烘箱，加热温度为140℃，反应时间为4h，使混合液在反应釜中充分反应；
步骤二四：将步骤二三中反应后的混合液从反应釜中取出并冷却至室温后，将冷却后的混合液进行离心处理，离心转速为12000rpm，离心时间为15min；
步骤二五：提取步骤二四中经过离心处理后混合液的上清液，经水洗离心两次，乙醇洗离心一次，获得中空的普鲁士蓝溶液(HPB)溶液；
进一步地，所述步骤三中制得新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统具体是通过以下步骤实现的：
步骤三一：取步骤二中所得的2.5mg中空的普鲁士蓝纳米酶放于5个样品管，每个样品管中各500μg；
步骤三二：将10mg葡萄糖氧化酶溶解于1mL水中，制备出10mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，分别取25μL、50μL、75μL、100μL、150μL的葡萄糖氧化酶溶液加入到步骤三一中的5个样品管内，使得5个样品管中的葡萄糖氧化酶含量分别为250μg、500μg、750μg、1000μg和1500μg；
步骤三三：向步骤三二中每个样品管内加入等量的蒸馏水，并将加入蒸馏水后的样品管放置在磁力搅拌器上，搅拌12h；
步骤三四：将步骤三三中搅拌完成的样品装入离心管中进行离心处理，离心转速为12000rpm，离心时间为15min；
步骤三五：提取步骤三四中经过离心处理后混合液的上清液，得到新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统；
进一步地，所述步骤四中使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测量步骤三中新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统内的葡萄糖氧化酶含量是通过以下步骤实现的；
步骤四一：取10μL蛋白标准品(5mg/mL BSA)稀释至100μL，使最终浓度为0.5mg/mL；
步骤四二：将50份的BCA试剂A和1份的BCA试剂B混合，使二者充分混匀，配制适量BCA工作液；
步骤四三：将标准品按0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL加到96孔板的标准品孔中，向96孔板品孔中加入步骤四二中所得的标准品稀释液，使标准孔内的溶液补足到20μL，相当于标准品浓度分别为0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL；
步骤四四：并将步骤三中所得的五组上清液取20μL到96孔板的样品孔中，再向各孔中分别加入200μL上述配制好的BCA工作液；
步骤四五：将步骤四五中注入BCA工作液的96孔板，放入到温度为60℃的烘箱中，保温时间为30min；
步骤四六：使用酶标仪测量步骤四五中所得溶液波长为562nm处的吸光度，做出标准曲线，根据标准曲线公式计算出样品上清液中的蛋白浓度，根据上清液体积可得出上清液中的葡萄糖蛋白酶含量，从而可以计算出中空的普鲁士蓝纳米酶中葡萄糖氧化酶的含量；
一种制备方法中制得的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的应用，利用新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统检测葡萄糖，具体检测方法是通过以下步骤实现的：
步骤A：判断搭载葡萄糖氧化酶对中空的普鲁士蓝的类过氧化物酶活性产生影响；
步骤B：判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适温度；
步骤C：判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适pH；
步骤D：判断新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖的检测的唯一性；
步骤E：根据步骤A至步骤D中所得的判断结果论证新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统在最适温度和最适pH的条件下可以对葡萄糖具有唯一检测性，将待测溶液溶于新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统中，并利用显色剂TMB对混合溶液进行显像测试，产生oxTMB，此时溶液颜色为蓝色，则判定待测溶液为葡萄糖；
进一步地，所述步骤A中判断搭载葡萄糖氧化酶对中空的普鲁士蓝的类过氧化物酶活性产生影响的过程具体如下：
步骤A1：向搭载葡萄糖氧化酶对中空的普鲁士蓝纳米酶和普通的中空的普鲁士蓝纳米酶中放入等量的过氧化氢，在室温下反应5min；
步骤A2：利用光谱仪照射步骤A1中所得的两种反应溶液，得到在500～800nm波长范围内两种溶液的紫外-可见光吸收光谱；
步骤A3：对比步骤A2中两种反应溶液的紫外-可见光吸收光谱，若二者重叠度较高，则证明搭载葡萄糖氧化酶不会对中空的普鲁士蓝的类过氧化物酶活性产生影响；
进一步地，所述步骤B中判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适温度的过程具体如下：
步骤B1：取50μL的TMB溶液、50μL的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统(HPB)溶液和20μL浓度为3mM的葡萄糖溶液混合为反应液，备用；
步骤B2：将步骤B1中所得的反应液加入缓冲剂稀释至3mL；
步骤B3：将步骤B2中所得稀释后的反应液分为7份等量的样品，并使7份等量的样品分别在温度环境为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃的条件下静置20min；
步骤B4：利用光谱仪测量步骤B3中7份等量的样品在不同温度下的吸光度，并绘制曲线，判断在何种温度条件下吸光度最佳，即该温度为最适检测温度；
进一步地，所述步骤C中判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适pH的过程具体如下：
步骤C1：取50μL的TMB溶液、50μL的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统(HPB)溶液和20μL浓度为3mM的葡萄糖溶液混合为反应液，备用；
步骤C2：将步骤C1中所得的反应液加入缓冲剂稀释至3mL；
步骤C3：将步骤C2中所得稀释后的反应液分为9份等量的样品，并使9份等量的样品分别在温度环境为pH＝2、pH＝3、pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝7、pH＝8、pH＝9和pH＝10的条件下静置20min；
步骤C4：利用光谱仪测量步骤C3中9份等量的样品在不同温度下的吸光度，并绘制曲线，判断在何种pH条件下吸光度最佳，即该pH为最适检测pH；
进一步地，所述步骤D中判断新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖的检测的唯一性的过程具体如下：
步骤D1：取50μL的TMB溶液和50μL的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统(HPB)溶液进行混合形成混合液，备用；
步骤D2：将步骤D1中所得的反应液加入缓冲剂稀释至3mL；
步骤D3：将步骤D2中所得稀释后的反应液分为5份等量的稀释基液，并在5份等量的稀释基液中分别加入浓度为1的葡萄糖溶液、浓度为10的蔗糖溶液、浓度为10的果糖溶液、浓度为10的乳糖溶液和浓度为10的麦芽糖溶液形成5份等量的对比试液；
步骤D4：观察步骤D3中5份等量的对比试液的颜色变化，若其中仅有加入浓度为1的葡萄糖溶液的对比试液发生颜色变化，而其他四份等量的对比试液颜色不变，则判定新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖的检测具有唯一性。
本申请相对于现有技术所产生的有益效果：
本专利提出一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统，使用比色检测法，利用中空普鲁士蓝纳米粒子的类过氧化物酶催化活性，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺作为显色剂，通过测量显色剂在反应结束后溶液吸光度的变化，对中空普鲁士纳米酶的类过氧化物酶催化活性进行了检测，并实现了利用中空普鲁士蓝纳米酶，在浓度为0.05～2mM范围内对过氧化氢进行检测，检测限达到0.033mM。通过进一步实验，利用中空的普鲁士蓝纳米粒子的中空结构负载葡萄糖氧化酶，构建葡萄糖氧化酶和中空普鲁士蓝纳米酶的“双酶”系统，通过中间产物过氧化氢和显色剂相互作用(葡萄糖在进入体系后被葡萄糖氧化酶氧化生成过氧化氢(H2O2)，然后H2O2被催化氧化使显色剂3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)产生蓝色物质(oxTMB)，达到检测效果)，完成了对葡萄糖在浓度为15～80μM范围内的检测，且检测限达到了11.68μM。本设计方案提出的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统可以实现一步法检测葡萄糖浓度的操作(本设计方案检测葡萄糖的方法将传统的两步法(即先将葡萄糖氧化酶和葡萄糖混合均匀，孵育一段时间后，再加入类过氧化物酶和显色剂，待溶液颜色稳定后再测量吸光度)变为为一步，既简化了实验操作的步骤，又能节省时间提高效率。)，展现出较高的材料稳定性、制备工艺简单、经济、环保等优点，在生物检测领域具有很大的应用前景。
附图说明
图1为普鲁士蓝纳米酶中葡萄糖氧化酶的标准曲线图；
图2为普鲁士蓝纳米酶中葡萄糖氧化酶的负载曲线图；
图3为中空的普鲁士蓝纳米酶的TEM图片；
图4为中空的普鲁士蓝纳米酶的透射电镜粒径分析；
图5为HPB和HPB/GOD的混合体系的紫外-可见光吸收光谱；
图6为新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统用于葡萄糖检测的示意图；
图7为15微升的TMB溶液、20微升的HPB溶液和90微升的过氧化氢溶液5min内紫外-可吸收光谱变化曲线；
图8为HPB和HPB/GOD混合体系催化过氧化氢的紫外-可将光光谱图；
图9为HPB和HPB/GOD混合体系催化过氧化氢后溶液在波长652nm处的吸光度变化对比图；
图10中(A)为不同温度下50微升的TMB溶液、50微升的HPB溶液和20微升浓度为3mM的葡萄糖溶液，加缓冲液补足到3mL，反应20min后的吸光度对比图；(B)为不同pH下50微升的TMB溶液、50微升的HPB溶液和20微升浓度为3mM的葡萄糖溶液，加缓冲液补足到3mL，反应20min后的吸光度对比图；(C)为不同温度下7份等量样品的反应颜色对比图；(C)为不同pH下9份等量样品的反应颜色对比图；
图11为HPB/GOD对葡萄糖的选择性检测的对比图；
图12为滤纸实验实物图及照片中提取颜色数据拟合曲线；
图13为浓度范围为0～0.08mM的葡萄糖反应20min后652nm处的吸光度拟合线。
具体实施方式
具体实施方式一：结合图1至图13说明本实施方式，本实施方式中提供了一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法，所述制备方法是通过如下步骤实现的：
步骤一：合成普鲁士蓝纳米酶；
步骤二：将步骤一中合成后的普鲁士蓝纳米酶进行酸化，制得中空结构的普鲁士蓝纳米酶；
步骤三：将步骤二中所得的中空结构的普鲁士蓝纳米酶作为载体搭载葡萄糖氧化酶，形成新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统；
步骤四：使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测量步骤三中新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统内的葡萄糖氧化酶含量，计算中空的普鲁士蓝中葡萄糖氧化酶的负载量，基于中空的普鲁士蓝中葡萄糖氧化酶的负载量，判断新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统中葡萄糖氧化酶的最大含量。
本实施方式中在制备新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的过程中还涉及到判断新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统中葡萄糖氧化酶含量的检测，由于中空结构的普鲁士蓝纳米酶作为葡萄糖氧化酶的载体，其本申请的负载量有限，即新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统中葡萄糖氧化酶的含量是有限的，当葡萄糖氧化酶达到中空结构的普鲁士蓝纳米酶的承载极限情况下，即使再增加葡萄糖氧化酶，也不会产生有益效果，并且还会造成了物料的浪费，因此在通过步骤四的实验确定葡萄糖氧化酶含量是十分必要的，参照图1和图2，使用500μg的中空普鲁士蓝负载葡糖糖氧化酶，当加入的葡萄糖氧化酶含量低于1000μg时，随葡萄糖氧化酶质量的增加，酶的负载量也随之增加；当加入的葡萄糖氧化酶含量高于1000μg时，随葡萄糖氧化酶含量的增加，负载量在820μg左右不再有大的上升。因此推断出820μg葡萄糖氧化酶为500μg中空的普鲁士蓝纳米酶最大的酶负载量；
基于上述方法步骤，本申请还涉及到对所制得的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统进行形貌表征，具体表征步骤如下：
将刻蚀的中空的普鲁士蓝纳米酶进行TEM表征，并进行粒径分析，结果图3和图4所示。通过图3和图4可看出，经过高温盐酸刻蚀后得到的中空的普鲁士蓝纳米酶具有明显的中空结构，且尺寸相较于普鲁士蓝纳米酶有所减小，大多集中在80～140nm之间，且尺寸在110nm左右的粒子占比最多。并且由于聚乙烯吡咯烷酮的包覆，盐酸可以在不完全破坏普鲁士蓝纳米粒子边缘结构的情况下对普鲁士蓝的内部进行腐蚀，形成中空的结构。通过翻阅文献，我们查阅到普鲁士蓝纳米粒子在生长过程中属于非经典结晶，在其结晶过程中，普鲁士蓝纳米粒子的晶格间存在一定的间隙，因此在刻蚀的过程中，盐酸可以从介晶状态的普鲁士蓝纳米粒子表面的缝隙进入粒子内部，进而对普鲁士蓝纳米粒子的内部进行腐蚀，由此可以得到中空结构的中空的普鲁士蓝纳米酶；
本申请还涉及到对所制得的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统进行紫外-可见光吸收光谱测试，具体表征步骤如下：为进一步探究中空的普鲁士蓝纳米酶对葡萄糖氧化酶是否搭载成功，我们对材料进行了紫外-可见光吸收光谱测试，测试结果如图5所示。通过翻阅文献我们可以得出中空的普鲁士蓝纳米酶的紫外-可见光吸收光谱的峰值为725nm左右，图中中空的普鲁士蓝纳米酶和HPB/GOD混合体系的吸收峰在720nm左右，由此可以证明产出的物质是中空的普鲁士蓝纳米酶，且搭载葡萄糖氧化酶不会改变中空普鲁士蓝的吸收峰值。此外由图5可以看出，同浓度下的HPB/GOD混合体系的吸收峰值明显小于单独的中空的普鲁士蓝，猜测是由于葡萄糖氧化酶存在于中空普鲁士蓝的中空结构中从而掩盖了中空普鲁士蓝自身的吸收峰。另外，文献中介绍的葡萄糖氧化酶的紫外-可见光吸收光谱在波长为377nm和455nm左右达到吸收峰值，因此，由图中300～500nm范围内两条曲线的对比可知葡萄糖氧化酶被成功负载。
具体实施方式二：结合图1至图13说明本实施方式，本实施方式与具体实施方式一不同点在于，所述步骤一中合成普鲁士蓝纳米酶的具体步骤是通过以下步骤实现的：
步骤一一：称取1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，32mg铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])放置在烧杯中，再加入20mL浓度为0.01M的盐酸溶液，利用磁力搅拌器搅拌成混合液，搅拌时间为4h；
步骤一二：将步骤一一中所得的混合液置于反应釜中，并将带有混合液的反应釜放入烘箱，加热温度为80℃，反应时间为24h，使混合液在反应釜中充分反应；
步骤一三：将步骤一二中反应后的混合液从反应釜中取出并冷却至室温后，将冷却后的混合液进行离心处理，离心转速为12000rpm，离心时间为15min；
步骤一四：提取步骤一三中经过离心处理后混合液的上清液，经水洗离心两次，乙醇洗离心一次，获得普鲁士蓝纳米酶(PB)溶液。其它组成和连接方式与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：结合图1至图13说明本实施方式，本实施方式与具体实施方式二不同点在于，所述步骤二中制得中空结构的普鲁士蓝纳米酶的具体步骤是通过以下步骤实现的；
步骤二一：将步骤一中所得的普鲁士蓝纳米酶(PB)溶液稀释后备用；
步骤二二：称取20mg步骤二一中所得的稀释溶液、100mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与0.1M的盐酸组成20mL的混合液，并将混合液置于磁力搅拌器上搅拌4h；
步骤二三：将步骤二二中所得的混合液装入反应釜中，并将带有混合液的反应釜放入烘箱，加热温度为140℃，反应时间为4h，使混合液在反应釜中充分反应；
步骤二四：将步骤二三中反应后的混合液从反应釜中取出并冷却至室温后，将冷却后的混合液进行离心处理，离心转速为12000rpm，离心时间为15min；
步骤二五：提取步骤二四中经过离心处理后混合液的上清液，经水洗离心两次，乙醇洗离心一次，获得中空的普鲁士蓝溶液(HPB)溶液。其它组成和连接方式与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：结合图1至图7说明本实施方式，本实施方式与具体实施方式三不同点在于，所述步骤三中制得新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统具体是通过以下步骤实现的：
步骤三一：取步骤二中所得的2.5mg中空的普鲁士蓝纳米酶放于5个样品管，每个样品管中各500μg；
步骤三二：将10mg葡萄糖氧化酶溶解于1mL水中，制备出10mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，分别取25μL、50μL、75μL、100μL、150μL的葡萄糖氧化酶溶液加入到步骤三一中的5个样品管内，使得5个样品管中的葡萄糖氧化酶含量分别为250μg、500μg、750μg、1000μg和1500μg；
步骤三三：向步骤三二中每个样品管内加入等量的蒸馏水，并将加入蒸馏水后的样品管放置在磁力搅拌器上，搅拌12h；
步骤三四：将步骤三三中搅拌完成的样品装入离心管中进行离心处理，离心转速为12000rpm，离心时间为15min；
步骤三五：提取步骤三四中经过离心处理后混合液的上清液，得到新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统。其它组成和连接方式与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：结合图1至图13说明本实施方式，本实施方式与具体实施方式四不同点在于，所述步骤四中使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测量步骤三中新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统内的葡萄糖氧化酶含量是通过以下步骤实现的；
步骤四一：取10μL蛋白标准品(5mg/mL BSA)稀释至100μL，使最终浓度为0.5mg/mL；
步骤四二：将50份的BCA试剂A和1份的BCA试剂B混合，使二者充分混匀，配制适量BCA工作液；
步骤四三：将标准品按0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL加到96孔板的标准品孔中，向96孔板品孔中加入步骤四二中所得的标准品稀释液，使标准孔内的溶液补足到20μL，相当于标准品浓度分别为0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL；
步骤四四：并将步骤三中所得的五组上清液取20μL到96孔板的样品孔中，再向各孔中分别加入200μL上述配制好的BCA工作液；
步骤四五：将步骤四五中注入BCA工作液的96孔板，放入到温度为60℃的烘箱中，保温时间为30min；
步骤四六：使用酶标仪测量步骤四五中所得溶液波长为562nm处的吸光度，做出标准曲线，根据标准曲线公式计算出样品上清液中的蛋白浓度，根据上清液体积可得出上清液中的葡萄糖蛋白酶含量，从而可以计算出中空的普鲁士蓝纳米酶中葡萄糖氧化酶的含量。其它组成和连接方式与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：结合图1至图13说明本实施方式，本实施方式提供一种制备方法中制得的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的应用，利用新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统检测葡萄糖，具体检测方法是通过以下步骤实现的：
步骤A：判断搭载葡萄糖氧化酶对中空的普鲁士蓝的类过氧化物酶活性产生影响；
步骤B：判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适温度；
步骤C：判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适pH；
步骤D：判断新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖的检测的唯一性；
步骤E：根据步骤A至步骤D中所得的判断结果论证新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统在最适温度和最适pH的条件下可以对葡萄糖具有唯一检测性，将待测溶液溶于新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统中，并利用显色剂TMB对混合溶液进行显像测试，产生oxTMB，此时溶液颜色为蓝色，则判定待测溶液为葡萄糖。
本实施方式中利用新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖进行检测的原理在于普鲁士蓝的类过氧化物酶的催化活性使得其在酸性条件催化过氧化氢羟基自由基，之后由羟基自由基氧化显色剂TMB产生蓝色的oxTMB，发生显色反应，并能在波长为652nm处产生明显的吸收峰。通过此项特性，可以用普鲁士蓝纳米酶和显色剂来检测过氧化氢的含量。此外，制备中空的普鲁士蓝纳米酶，可以用来检测葡萄糖的含量。利用中空的普鲁士蓝的中空结构来搭载葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖分解产生过氧化氢，再由作为外壳的中空的普鲁士蓝纳米酶催化氧化过氧化氢，再借助显色剂TMB来达到对葡萄糖的检测，具体检测过程如图6所示；
实现上述原理的首要条件是普鲁士蓝是否具有类过氧化物酶的活性，利用中空普鲁士蓝纳米酶检测过氧化氢的原理，是在适宜的条件下，中空普鲁士蓝可以催化过氧化氢分解，产生羟基自由基，再由羟基自由基氧化显色剂TMB产生oxTMB，oxTMB显现出肉眼可见的蓝色，且oxTMB的紫外光谱在波长为652nm处有明显的吸收峰。随着反应的进行，溶液中oxTMB的含量增多，因此溶液的蓝色程度逐渐变深，且紫外光谱上的吸收峰明显增强。紫外光谱随时间的变化如图7所示；
由图7可以看出随着反应时间的延长，普鲁士蓝纳米酶催化过氧化氢产生的羟基自由基浓度增大，使得溶液中oxTMB含量增多，紫外-可见吸收光谱的吸光度值变大。此外，由图5可以看出，反应在前几分钟较为剧烈，反应速度较快，这是由于反应发生时过氧化氢的含量较多，能快速的产生羟基自由基氧化TMB，随着反应的进行，过氧化氢的含量减少，导致反应速度减慢，吸光度的增加速度有所下降。通过上述实验可以证明，普鲁士蓝具有类过氧化物酶的活性。
具体实施方式七：结合图1至图13说明本实施方式，本实施方式与具体实施方式六不同点在于，所述步骤A中判断搭载葡萄糖氧化酶对中空的普鲁士蓝的类过氧化物酶活性产生影响的过程具体如下：
步骤A1：向搭载葡萄糖氧化酶对中空的普鲁士蓝纳米酶和普通的中空的普鲁士蓝纳米酶中放入等量的过氧化氢，在室温下反应5min；
步骤A2：利用光谱仪照射步骤A1中所得的两种反应溶液，得到在500～800nm波长范围内两种溶液的紫外-可见光吸收光谱；
步骤A3：对比步骤A2中两种反应溶液的紫外-可见光吸收光谱，若二者重叠度较高，则证明搭载葡萄糖氧化酶不会对中空的普鲁士蓝的类过氧化物酶活性产生影响。其它组成和连接方式与具体实施方式六相同。
结合具体实施六中记载所述，通过验证证明了普鲁士蓝纳米酶具有过氧化物酶的活性，可以用于检测过氧化氢，但是本申请所用的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统在普鲁士蓝纳米酶的基础上还搭载了葡萄糖氧化酶，由于本申请所提供的检测方法是将传统的两步法简化为一步法进行检测，其原理通过检测葡萄糖分解产生的过氧化氢含量来间接检测葡萄糖，因此判断葡萄糖氧化酶与普鲁士蓝纳米酶结合后是否会破坏普鲁士蓝纳米酶本身过氧化物酶活性也是很有必要的，通过图8和图9可以看出HPB和HPB/GOD混合体系对催化过氧化氢的能力差别不大，相同原料在相同反应条件下5min后溶液在500～800nm波长范围内的紫外-可见光吸收光谱几乎重叠，负载葡萄糖氧化酶的中空普鲁士蓝纳米酶作原料，在反应后没有产生其他的吸收峰，再次验证了负载葡萄糖氧化酶不会改变中空普鲁士蓝的结构，这也证明负载葡萄糖氧化酶后的中空普鲁士蓝纳米酶对过氧化氢的催化作用没有改变，不会对过氧化氢的检测产生影响，因此不会对间接检测葡萄糖产生影响。
具体实施方式八：结合图1至图13说明本实施方式，本实施方式与具体实施方式七不同点在于，所述步骤B中判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适温度的过程具体如下：
步骤B1：取50μL的TMB溶液、50μL的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统(HPB)溶液和20μL浓度为3mM的葡萄糖溶液混合为反应液，备用；
步骤B2：将步骤B1中所得的反应液加入缓冲剂稀释至3mL；
步骤B3：将步骤B2中所得稀释后的反应液分为7份等量的样品，并使7份等量的样品分别在温度环境为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃的条件下静置20min；
步骤B4：利用光谱仪测量步骤B3中7份等量的样品在不同温度下的吸光度，并绘制曲线，判断在何种温度条件下吸光度最佳，即该温度为最适检测温度。其它组成和连接方式与具体实施方式四相同。
具体实施方式九：结合图1至图13说明本实施方式，本实施方式与具体实施方式八不同点在于，所述步骤C中判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适pH的过程具体如下：
步骤C1：取50μL的TMB溶液、50μL的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统(HPB)溶液和20μL浓度为3mM的葡萄糖溶液混合为反应液，备用；
步骤C2：将步骤C1中所得的反应液加入缓冲剂稀释至3mL；
步骤C3：将步骤C2中所得稀释后的反应液分为9份等量的样品，并使9份等量的样品分别在温度环境为pH＝2、pH＝3、pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝7、pH＝8、pH＝9和pH＝10的条件下静置20min；
步骤C4：利用光谱仪测量步骤C3中9份等量的样品在不同温度下的吸光度，并绘制曲线，判断在何种pH条件下吸光度最佳，即该pH为最适检测pH。其它组成和连接方式与具体实施方式八相同。
结合具体实施方式八和具体实施方式九进行说明，本申请所构建的此种利用负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系检测葡萄糖的方法将传统的两步法(即先将葡萄糖氧化酶和葡萄糖混合均匀，孵育一段时间后，再加入类过氧化物酶和显色剂，待溶液颜色稳定后再测量吸光度)变为为一步，既简化了实验操作的步骤，又能节省时间提高效率。，但由于所构建的多酶体系对工作环境的要求与单独的葡萄糖氧化酶和普鲁士蓝纳米酶有所不同，因此我们需要对负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适温度和最适pH进行研究，实验结果如图10所示；
由于葡萄糖氧化酶具有生物活性，且根据图10(A)可得，负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系检测葡萄糖的最适温度为30℃。当温度高于30℃时，由于葡萄糖氧化酶失活，导致负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系对葡萄糖的检测作用明显下降，因此使用该混合体系对葡萄糖进行检测时，应选择在较低的温度环境(如室温25℃)下进行，且该混合体系不能作为高温下检测葡萄糖的检测材料使用；
根据图10(B)可得，负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系检测葡萄糖的最适宜环境为pH＝4，且具有较宽的类过氧化物酶活性pH范围，在pH为3～7范围内都有明显的类酶活性，而当pH大于7时，其类过氧化物酶的催化作用消失，这是由于中性和碱性条件下会破坏中空普鲁士蓝纳米酶的结构，而且pH过高也会使葡萄糖氧化酶失活，导致负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系失去检测葡萄糖的能力。因此后续实验对葡萄糖检测在为室温条件下，pH＝4的缓冲液中进行。
具体实施方式十：结合图1至图13说明本实施方式，本实施方式与具体实施方式九不同点在于，所述步骤D中判断新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖的检测的唯一性的过程具体如下：
步骤D1：取50μL的TMB溶液和50μL的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统(HPB)溶液进行混合形成混合液，备用；
步骤D2：将步骤D1中所得的反应液加入缓冲剂稀释至3mL；
步骤D3：将步骤D2中所得稀释后的反应液分为5份等量的稀释基液，并在5份等量的稀释基液中分别加入浓度为1的葡萄糖溶液、浓度为10的蔗糖溶液、浓度为10的果糖溶液、浓度为10的乳糖溶液和浓度为10的麦芽糖溶液形成5份等量的对比试液；
步骤D4：观察步骤D3中5份等量的对比试液的颜色变化，若其中仅有加入浓度为1的葡萄糖溶液的对比试液发生颜色变化，而其他四份等量的对比试液颜色不变，则判定新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖的检测具有唯一性。其它组成和连接方式与具体实施方式九相同。
本实施方式中所判断新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖检测的唯一性是为了提高葡萄糖检测时的准确性，由于本实验运用负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系来检测葡萄糖，如果该体系对葡萄糖的检测不具有唯一性，不能有选择性区分葡萄糖和其他材料，那负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系的检测效果将大打折扣。因此对该体系检测的选择性进行测试，结果如图11所示；
由图11可以看出只有当样品管中加入葡萄糖时，溶液在652nm的吸收峰会发生明显变化，而当加入等量的，浓度为葡萄糖溶液10倍的蔗糖、果糖、乳糖和麦芽糖溶液时，产生的吸收峰值与加入等量的水差别不大，这说明这些物质不能够促使TMB被氧化产生蓝色的oxTMB，只有加入葡萄糖后经过反应能看到明显的蓝色，这证明了负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系能够有选择性的检测葡萄糖，因而利用该混合体系检测葡萄糖具有更高的现实价值；
对滤纸实验所得的实验结果进行拍照，用绘图软件提取出各点的颜色数值，计算各点的G/(R+G+B)值，用该值与葡萄糖的浓度进行拟合，得到线性曲线如图12所示，根据图12更加证明了负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系能够有选择性的检测葡萄糖；
根据图13所示，本申请还可以对葡萄糖浓度进行进一步检测，在保证显色剂TMB的浓度不变，为0.2mg/mL，在0～0.1mM范围内，改变葡萄糖的浓度，当中空的普鲁士蓝浓度为每3mL 0.05mg时，葡萄糖的浓度与吸光度的值在15～80μM内成线性相关，其中R2＝0.996，即对葡萄糖检测的范围为15～80μM，并不逊色于已发表文献中的其他材料，并且计算出检测限为11.68μM，且检测的灵敏度也比较高。利用负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系检测葡萄糖的操作比较简单，且检测现象明显，因此利用负载葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系检测葡萄糖是一种具有很高现实实用价值的检测手段。
本发明已以较佳实施案例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可以利用上述揭示的结构及技术内容做出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施案例，但是凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施案例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属本发明技术方案范围。
Claims (10)
1.一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法，其特征在于：所述制备方法是通过如下步骤实现的：
步骤一：合成普鲁士蓝纳米酶；
步骤二：将步骤一中合成后的普鲁士蓝纳米酶进行酸化，制得中空结构的普鲁士蓝纳米酶；
步骤三：将步骤二中所得的中空结构的普鲁士蓝纳米酶作为载体搭载葡萄糖氧化酶，形成新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统；
步骤四：使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测量步骤三中新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统内的葡萄糖氧化酶含量，计算中空的普鲁士蓝中葡萄糖氧化酶的负载量，基于中空的普鲁士蓝中葡萄糖氧化酶的负载量，判断新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统中葡萄糖氧化酶的最大含量。
2.根据权利要求1所述的一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法，其特征在于：所述步骤一中合成普鲁士蓝纳米酶的具体步骤是通过以下步骤实现的：
步骤一一：称取1g聚乙烯吡咯烷酮，32mg铁氰化钾放置在烧杯中，再加入20mL浓度为0.01M的盐酸溶液，利用磁力搅拌器搅拌成混合液，搅拌时间为4h；
步骤一二：将步骤一一中所得的混合液置于反应釜中，并将带有混合液的反应釜放入烘箱，加热温度为80℃，反应时间为24h，使混合液在反应釜中充分反应；
步骤一三：将步骤一二中反应后的混合液从反应釜中取出并冷却至室温后，将冷却后的混合液进行离心处理，离心转速为12000rpm，离心时间为15min；
步骤一四：提取步骤一三中经过离心处理后混合液的上清液，经水洗离心两次，乙醇洗离心一次，获得普鲁士蓝纳米酶溶液。
3.根据权利要求2所述的一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法，其特征在于：所述步骤二中制得中空结构的普鲁士蓝纳米酶的具体步骤是通过以下步骤实现的；
步骤二一：将步骤一中所得的普鲁士蓝纳米酶溶液稀释后备用；
步骤二二：称取20mg步骤二一中所得的稀释溶液、100mg聚乙烯吡咯烷酮与0.1M的盐酸组成20mL的混合液，并将混合液置于磁力搅拌器上搅拌4h；
步骤二三：将步骤二二中所得的混合液装入反应釜中，并将带有混合液的反应釜放入烘箱，加热温度为140℃，反应时间为4h，使混合液在反应釜中充分反应；
步骤二四：将步骤二三中反应后的混合液从反应釜中取出并冷却至室温后，将冷却后的混合液进行离心处理，离心转速为12000rpm，离心时间为15min；
步骤二五：提取步骤二四中经过离心处理后混合液的上清液，经水洗离心两次，乙醇洗离心一次，获得中空的普鲁士蓝溶液溶液。
4.根据权利要求3所述的一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法，其特征在于：所述步骤三中制得新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统具体是通过以下步骤实现的：
步骤三一：取步骤二中所得的2.5mg中空的普鲁士蓝纳米酶放于5个样品管，每个样品管中各500μg；
步骤三二：将10mg葡萄糖氧化酶溶解于1mL水中，制备出10mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，分别取25μL、50μL、75μL、100μL、150μL的葡萄糖氧化酶溶液加入到步骤三一中的5个样品管内，使得5个样品管中的葡萄糖氧化酶含量分别为250μg、500μg、750μg、1000μg和1500μg；
步骤三三：向步骤三二中每个样品管内加入等量的蒸馏水，并将加入蒸馏水后的样品管放置在磁力搅拌器上，搅拌12h；
步骤三四：将步骤三三中搅拌完成的样品装入离心管中进行离心处理，离心转速为12000rpm，离心时间为15min；
步骤三五：提取步骤三四中经过离心处理后混合液的上清液，得到新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统。
5.根据权利要求4所述的一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的制备方法，其特征在于：所述步骤四中使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测量步骤三中新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统内的葡萄糖氧化酶含量是通过以下步骤实现的；
步骤四一：取10μL蛋白标准品稀释至100μL，使最终浓度为0.5mg/mL；
步骤四二：将50份的BCA试剂A和1份的BCA试剂B混合，使二者充分混匀，配制适量BCA工作液；
步骤四三：将标准品按0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL加到96孔板的标准品孔中，向96孔板品孔中加入步骤四二中所得的标准品稀释液，使标准孔内的溶液补足到20μL，相当于标准品浓度分别为0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL；
步骤四四：并将步骤三中所得的五组上清液取20μL到96孔板的样品孔中，再向各孔中分别加入200μL上述配制好的BCA工作液；
步骤四五：将步骤四五中注入BCA工作液的96孔板，放入到温度为60℃的烘箱中，保温时间为30min；
步骤四六：使用酶标仪测量步骤四五中所得溶液波长为562nm处的吸光度，做出标准曲线，根据标准曲线公式计算出样品上清液中的蛋白浓度，根据上清液体积可得出上清液中的葡萄糖蛋白酶含量，从而可以计算出中空的普鲁士蓝纳米酶中葡萄糖氧化酶的含量。
6.一种通过权利要求1至5任意一种制备方法中制得的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的应用，其特征在于：利用新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统检测葡萄糖，具体检测方法是通过以下步骤实现的：
步骤A：判断搭载葡萄糖氧化酶对中空的普鲁士蓝的类过氧化物酶活性产生影响；
步骤B：判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适温度；
步骤C：判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适pH；
步骤D：判断新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖的检测的唯一性；
步骤E：根据步骤A至步骤D中所得的判断结果论证新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统在最适温度和最适pH的条件下可以对葡萄糖具有唯一检测性，将待测溶液溶于新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统中，并利用显色剂TMB对混合溶液进行显像测试，产生oxTMB，此时溶液颜色为蓝色，则判定待测溶液为葡萄糖。
7.根据权利要求6所述的一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的应用，其特征在于：所述步骤A中判断搭载葡萄糖氧化酶对中空的普鲁士蓝的类过氧化物酶活性产生影响的过程具体如下：
步骤A1：向搭载葡萄糖氧化酶对中空的普鲁士蓝纳米酶和普通的中空的普鲁士蓝纳米酶中放入等量的过氧化氢，在室温下反应5min；
步骤A2：利用光谱仪照射步骤A1中所得的两种反应溶液，得到在500～800nm波长范围内两种溶液的紫外-可见光吸收光谱；
步骤A3：对比步骤A2中两种反应溶液的紫外-可见光吸收光谱，若二者重叠度较高，则证明搭载葡萄糖氧化酶不会对中空的普鲁士蓝的类过氧化物酶活性产生影响。
8.根据权利要求7所述的一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的应用，其特征在于：所述步骤B中判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适温度的过程具体如下：
步骤B1：取50μL的TMB溶液、50μL的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统溶液和20μL浓度为3mM的葡萄糖溶液混合为反应液，备用；
步骤B2：将步骤B1中所得的反应液加入缓冲剂稀释至3mL；
步骤B3：将步骤B2中所得稀释后的反应液分为7份等量的样品，并使7份等量的样品分别在温度环境为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃的条件下静置20min；
步骤B4：利用光谱仪测量步骤B3中7份等量的样品在不同温度下的吸光度，并绘制曲线，判断在何种温度条件下吸光度最佳，即该温度为最适检测温度。
9.根据权利要求8所述的一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的应用，其特征在于：所述步骤C中判断负载有葡萄糖氧化酶的中空的普鲁士蓝纳米酶混合体系工作环境的最适pH的过程具体如下：
步骤C1：取50μL的TMB溶液、50μL的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统溶液和20μL浓度为3mM的葡萄糖溶液混合为反应液，备用；
步骤C2：将步骤C1中所得的反应液加入缓冲剂稀释至3mL；
步骤C3：将步骤C2中所得稀释后的反应液分为9份等量的样品，并使9份等量的样品分别在温度环境为pH＝2、pH＝3、pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝7、pH＝8、pH＝9和pH＝10的条件下静置20min；
步骤C4：利用光谱仪测量步骤C3中9份等量的样品在不同温度下的吸光度，并绘制曲线，判断在何种pH条件下吸光度最佳，即该pH为最适检测pH。
10.根据权利要求9所述的一种新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统的应用，其特征在于：所述步骤D中判断新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖的检测的唯一性的过程具体如下：
步骤D1：取50μL的TMB溶液和50μL的新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统溶液进行混合形成混合液，备用；
步骤D2：将步骤D1中所得的反应液加入缓冲剂稀释至3mL；
步骤D3：将步骤D2中所得稀释后的反应液分为5份等量的稀释基液，并在5份等量的稀释基液中分别加入浓度为1的葡萄糖溶液、浓度为10的蔗糖溶液、浓度为10的果糖溶液、浓度为10的乳糖溶液和浓度为10的麦芽糖溶液形成5份等量的对比试液；
步骤D4：观察步骤D3中5份等量的对比试液的颜色变化，若其中仅有加入浓度为1的葡萄糖溶液的对比试液发生颜色变化，而其他四份等量的对比试液颜色不变，则判定新型普鲁士蓝纳米酶双酶系统对葡萄糖的检测具有唯一性。
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| CN114181695A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-03-15 | 哈尔滨工程大学 | 一种用于检测过氧化氢和葡萄糖浓度的复合型量子点的制备方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN113633660A (zh) * | 2021-08-13 | 2021-11-12 | 哈尔滨工程大学 | 一种具有原位调节肿瘤微环境及抗肿瘤效应的双金属纳米酶复合材料的制备方法 |
| CN114181695A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-03-15 | 哈尔滨工程大学 | 一种用于检测过氧化氢和葡萄糖浓度的复合型量子点的制备方法 |
| CN114414514A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-04-29 | 中山大学 | 一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法及其在酒精浓度检测中的应用 |
| CN114917354A (zh) * | 2022-06-01 | 2022-08-19 | 广西医科大学 | 一种Cu单原子纳米酶的制备及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MINGHUI LI等: "Neutrophil membrane camouflaged hybrid nanozymes for enhanced starvation/photothermal tumor therapy", NEW JOURNAL OF CHEMISTRY, vol. 46, 15 August 2022 (2022-08-15), pages 17456 - 17468 * |
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