CN115753649B - 一种硅基普鲁士蓝纳米酶、制备方法及其在比色检测谷胱甘肽中的应用 - Google Patents
一种硅基普鲁士蓝纳米酶、制备方法及其在比色检测谷胱甘肽中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种硅基普鲁士蓝纳米酶、制备方法及其在比色检测谷胱甘肽中的应用，属于还原型谷胱甘肽检测材料技术领域。本发明是先制备二氧化硅球，然后制备3‑氨丙基三乙氧基硅烷修饰后的介孔二氧化硅，最后制备普鲁士蓝锚定在介孔二氧化硅上的纳米材料。本发明制备的硅基普鲁士蓝纳米酶产率高、稳定性好，在水中的分散性良好，本发明制备的硅基普鲁士蓝纳米酶可用于GSH的检测，该纳米酶有着很强的类过氧化物酶活性，可高效催化H2O2和TMB反应产生深蓝色的氧化型TMB。
Description
技术领域
本发明属于还原型谷胱甘肽(GSH)检测材料技术领域，具体涉及一种硅基普鲁士蓝纳米酶、制备方法及其在比色检测谷胱甘肽中的应用。
背景技术
普鲁士蓝(PB)是一种常见的六氰合铁酸盐，又名亚铁氰化铁，其分子式为Fe4[Fe(CN)6]3。其合成方法简单并有着较高的生物安全性，已被美国药监局批准作为治疗铊中毒的临床药物。此外，由于其与Fe3O4类似的Fe原子的混合价态而具有较高的类过氧化物酶催化活性，引起了广泛的研究兴趣。其优良的类过氧化物酶活性能使其作为传感器广泛应用于电化学生物传感器的构建。然而，利用PB材料作为过氧化物酶模拟物用于比色生物传感器仍然存在一些问题，比如PB本色颜色的干扰、分散性差易团聚等。为了克服这些问题，扩大PB在比色生物传感器中的应用，寻找新的制备策略来扩大其应用仍然是一个巨大的挑战。
谷胱甘肽(GSH)的分子式为C10H17O6N3S，是由半胱氨酸、谷氨酸及甘氨酸组成的一种三肽。其被认为是活细胞中的主要抗氧化分子，其主要任务是清除细胞内不同情况下产生的活性氧物种(ROS)。GSH作为抗氧化剂分子是帕金森氏病、线粒体疾病或氧化应激的重要生物标记物，而目前在癌症中也被广泛研究。因此，它的检测和定量在生物医学领域引起了极大的兴趣。同时，由于GSH在化学结构有半胱氨酸的-SH基团，可以与ROS反应，另外，这种-SH基团还容易与贵金属基纳米酶的表面结合，阻碍其催化活性，利用该特性也常被用来检测其他分析物，如抗坏血酸或多巴胺。目前，关于测定GSH的方法有很多，例如电化学法、气象色谱法、高效液相色谱法等。但是，缺少一种经济便捷且快速稳定的测定方法来检测GSH，而比色法通常可用肉眼识别，并且具有快速、高效、经济的优势。在此基础上，可以用比色法来检测GSH。
纳米酶比天然酶有着稳定性高、成本低、设计灵活的优点，作为新型纳米材料，纳米酶通常会具有多酶活性，且会响应不同pH表现出不同的酶活性。其中，PB类的纳米酶具有出色的过氧化物酶活性，可在少量H2O2存在情况下快速使得3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)发生氧化变蓝，这种变化可通过酶标仪或者紫外分光光度计检测出来。综上所述，根据当前GSH检测技术的发展现状来看，迫切需要设计合成一种可高灵敏比色检测GSH的PB类纳米酶，这将会具有十分重要的现实意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种硅基普鲁士蓝纳米酶、制备方法及其在比色检测谷胱甘肽中的应用，本发明制备的硅基普鲁士蓝纳米酶产率高、稳定性好，在水中的分散性良好，且该硅基普鲁士蓝纳米酶可高效催化H2O2和TMB反应产生深蓝色的氧化型TMB(TMBOX)。
本发明首先提供一种硅基普鲁士蓝纳米酶的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备二氧化硅球：在水中加入十六烷基三甲基溴化铵得到混合体系，然后放入水浴加热锅中，依次加入无水乙醇、NaOH溶液、正硅酸乙酯反应，得到二氧化硅球；
(2)制备3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)修饰后的介孔二氧化硅：将步骤(1)中获得的二氧化硅球重新超声分散至无水乙醇中，同时加入APTES，获得的混和反应体系过夜搅拌，次日，进行离心洗涤，接着，将收集的沉淀分散至无水乙醇溶液内，加入硝酸铵冷凝回流反应，得到APTES修饰后的介孔二氧化硅纳米材料；
(3)制备硅基普鲁士蓝纳米酶：将柠檬酸和亚铁氰化钾混合得到A液，然后将水浴锅调至60℃，将水、FeCl3·6H2O、步骤(2)中APTES修饰后的介孔二氧化硅纳米材料加入，搅拌溶解，再加入柠檬酸搅拌，再滴加A液搅拌，搅拌完成后，再转移至室温条件下搅拌，得到硅基普鲁士蓝纳米酶。
优选的是，所述的步骤(1)中十六烷基三甲基溴化铵的质量g：无水乙醇的体积mL：NaOH溶液的体积μL：正硅酸乙酯的体积μL为0.05～0.2：2～3：100～200：150～200。
优选的是，所述的步骤(1)的反应温度为70℃，反应时间为2-3h。
优选的是，所述的步骤(2)中APTES的体积μL：硝酸铵的质量g为150～300：0.2～0.5。
优选的是，所述的步骤(2)冷凝回流的温度为60℃，时间为6～12h。优选的是，所述的步骤(3)中K4[Fe(CN)6]、两次柠檬酸分别用量、FeCl3·6H2O的质量比为8.0～8.6：95～100：5.2～5.6。
优选地，步骤(3)中在A液滴加过程中，反应体系始终处于搅拌状态且在60℃的水浴状态下，在A液加完后，体系在60℃下继续搅拌3～7分钟再转移至室温搅拌冷却。
本发明还提供上述制备方法得到的硅基普鲁士蓝纳米酶材料，呈直径为110～140nm的表面粗糙的规则球形纳米颗粒。
本发明还提供上述硅基普鲁士蓝纳米酶材料在比色检测谷胱甘肽中的应用。
本发明还提供了检测GSH含量的方法：将待测的GSH加入到含有硅基普鲁士蓝纳米酶、TMB、H2O2的NaAc-HAc缓冲液混合体系中，在特定条件下孵育，然后检测在652nm处的吸光度，最后计算出GSH的浓度。
本发明的有益效果
本发明提供一种硅基普鲁士蓝纳米酶、制备方法及其在比色检测谷胱甘肽中的应用，本发明制备的硅基普鲁士蓝纳米酶可用于GSH的检测，该纳米酶有着很强的类过氧化物酶活性，使TMB被氧化至溶液体系变蓝，在652nm处会有明显吸收峰。GSH可以将蓝色溶液的TMBOX还原成无色TMB，使溶液蓝色变浅，在这个过程中652nm处的吸光度会下降且与GSH的浓度在一定范围内呈线性关系。在分别以H2O2和TMB为底物时，通过米氏方程拟合曲线可以看出其符合天然酶的规律。在对GSH检测时，可以通过少量的GSH表现出较大的吸光度的差异，有着卓越的检测GSH性能。由于PB纳米酶本身就具有铁作为活性中心，所以在类过氧化物酶活性上表现出色，本发明里将PB锚定嵌合在介孔二氧化硅球体上，大大增加了PB的作用表面积，使得与底物结合能力增强，类过氧化物酶活性也有所改善。实验结果表明：采用5μg/mL的硅基普鲁士蓝纳米酶即可检测终浓度1～120μmmol/L的GSH，检测限为0.91μmmol/L。由此可见，本发明制备的硅基普鲁士蓝纳米酶在GSH的检测上，具有检测范围广、特异性强、灵敏度高等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。现将结合附图来详细说明本申请的实施方案：
图1为本发明硅基普鲁士蓝纳米酶材料制备示意图；
图2为实施例1制备的APETES修饰后的介孔二氧化硅球透射电子显微镜图像；
图3为实施例1制备的硅基普鲁士蓝纳米酶材料透射电子显微镜图像；
图4为实施例1制备的硅基普鲁士蓝纳米酶材料的紫外-可见光吸收光谱图和表面电位图；
图5为本发明实施例2中硅基普鲁士蓝纳米酶在模拟过氧化物酶活性过程中的紫外-可见光吸收光谱图；
图6为本发明实施例2硅基普鲁士蓝纳米酶的动力学测试曲线；
图7为本发明实施例2中不同pH、不同温度对硅基普鲁士蓝纳米酶类过氧化物酶活性的影响曲线；
图8为本发明实施例2以H2O2为底物时的(a)米氏方程拟合曲线以及(b)H2O2酶活双倒数曲线；
图9为本发明实施例2以TMB为底物时的(a)米氏方程拟合曲线以及(b)TMB酶活双倒数曲线；
图10为本发明实施例3利用硅基普鲁士蓝纳米酶检测GSH的机制示意图；
图11为本发明实施例3硅基普鲁士蓝纳米酶检测不同浓度GSH的(a)变化曲线图、(b)校准线性图以及(c)孵育18分钟后反应溶液的照片；
图12为本发明实施例3硅基普鲁士蓝纳米酶对GSH的选择性检测图。
具体实施方式
本发明首先提供一种硅基普鲁士蓝纳米酶的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备二氧化硅球：称取十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入到装有超纯水的三角瓶中获得混合体系，优选将混合体系超声3-5分钟至其完全呈澄清透明；后将其放入水浴加热锅中，先预热15min，依次加入无水乙醇、NaOH溶液、正硅酸乙酯(TEOS)，之后在恒定转速搅拌下反应，所述的反应温度优选为70℃，反应时间优选为2-3h，恒定转速优选为850rpm；接着离心洗涤收集沉淀，离心洗涤操作所用溶液是无水乙醇，将收集的沉淀分散至乙醇溶液内，从而获得二氧化硅球。所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量g：无水乙醇的体积mL：NaOH溶液的体积μL：正硅酸乙酯的体积μL优选为0.05～0.2：2～3：100～200：150～200，更优选为0.1:3:150:200，其中NaOH溶液浓度为2M；
(2)制备3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)修饰后的介孔二氧化硅：将(1)中获得的二氧化硅球离心后收集沉淀，重新超声分散至装有无水乙醇的三角瓶中，所述的超声时间优选为15～20分钟，同时向三角瓶加入APTES，获得的混和反应体系过夜搅拌，次日，用无水乙醇进行离心洗涤，接着，将收集的沉淀分散至无水乙醇溶液内，加入硝酸铵凝回流反应，所述的冷凝回流的温度优选为60℃，时间优选为6～12h，洗涤收集沉淀，得到APTES修饰后的介孔二氧化硅纳米材料样品。所述的APTES的体积μL：硝酸铵的质量g优选为150～300：0.2～0.5，更优选为200:0.3。
(3)制备普鲁士蓝锚定在介孔二氧化硅上的纳米材料(硅基普鲁士蓝纳米酶)：先配置A液，具体配置如下：将柠檬酸和亚铁氰化钾(K4[Fe(CN)6])加入到装有超纯水的三角瓶中，优选超声3-5分钟至体系完全澄清透亮，得到A液待用；然后，将水浴锅调至60℃，将装有超纯水三角瓶放到水浴锅内，然后将FeCl3·6H2O、步骤(2)中APTES修饰后的介孔二氧化硅纳米材料依次加入其中，搅拌完全溶解，然后加入柠檬酸，在连续搅拌5-10分钟后，在搅拌中用恒定速度将A液滴入上述体系中，此时体系为酸性状态；继续搅拌3-7分钟后，转移至室温条件下搅拌冷却至室温，最后用无水乙醇进行离心洗涤操作，所得沉淀物在真空干燥箱过夜干燥，成功制得硅基普鲁士蓝纳米酶粉末。所述的K4[Fe(CN)6]、两次柠檬酸分别用量、FeCl3·6H2O的质量比优选为8.0～8.6：95～100：5.2～5.6，更优选为8.45：98：5.4；其中柠檬酸两次所用的量相同；所述的APTES修饰后的介孔二氧化硅纳米材料的体积mL：FeCl3·6H2O的质量mg优选为5：5.4。
所述的A液采用的是恒定速度滴加，可采用注射泵来辅助，滴加速度优选在4.5～5.0mL/min；在确定体系是否为酸性的操作可采用pH试纸检测即可，pH值应在3左右；
本发明还提供上述制备方法得到的硅基普鲁士蓝纳米酶材料，呈直径为110～140nm的表面粗糙的规则球形纳米颗粒，有着很强的类过氧化物酶活性。
本发明还提供上述硅基普鲁士蓝纳米酶材料在比色检测谷胱甘肽中的应用。
本发明成功制备的硅基普鲁士蓝纳米酶可用于GSH的检测，该纳米酶有着很强的类过氧化物酶活性，在分别以H2O2和TMB为底物时，通过米氏方程拟合曲线可以看出其符合天然酶的规律。在对GSH检测时，可以通过少量的GSH表现出较大的吸光度的差异，有着卓越的检测GSH性能。
本发明还提供了检测GSH含量的方法：
将待测的GSH加入到含有硅基普鲁士蓝纳米酶、TMB、H2O2的NaAc-HAc缓冲液混合体系中，在特定条件下孵育一段时间，然后检测在652nm处的吸光度，最后计算处GSH的浓度。
本发明制备的硅基普鲁士蓝纳米酶可以与H2O2共同作用发挥出类过氧化物酶活性，使TMB被氧化至溶液体系变蓝，在652nm处会有明显吸收峰。GSH可以将蓝色溶液的TMBOX还原成无色TMB，使溶液蓝色变浅，在这个过程中652nm处的吸光度会下降且与GSH的浓度在一定范围内呈线性关系。
按照本发明，事先配置好浓度200μg/mL的硅基普鲁士蓝纳米酶样品，40mmol/L的TMB，800mmol/L的H2O2，其中TMB用无水乙醇配制，其余均用超纯水配制；检测GSH的反应体系体积为1mL，其中硅基普鲁士蓝纳米酶样品、TMB、H2O2分别为25μL、12.5μL、25μL，以及912.5μL的NaAc-HAc缓冲液(pH＝4)，最后加入不同浓度的25μL的GSH溶液；
按照本发明，所述孵育条件优选为37℃水浴18分钟，检测使用酶标仪测试652nm处的吸光度值，检测GSH的线性范围为1～120μmol/L，检测限为0.91μmol/L；
下面将结合具体实施例来进一步阐述本申请，应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下面结合附图及实例对本申请作进一步描述：
实施例1硅基普鲁士蓝纳米酶的制备
本实施例合成了一种硅基普鲁士兰纳米酶材料，制备示意图如图1所述。具体制备方法如下：
(1)制备二氧化硅球：称取0.1g CTAB加入到装有20mL超纯水的三角瓶中获得混合体系，将混合体系超声5分钟至其完全呈澄清透明；后将其放入70℃水浴加热锅中预热15分钟，接着，依次加入3mL无水乙醇、150uL NaOH溶液(2mol/L)、200uL TEOS(逐滴加入)，之后在850rpm恒定转速搅拌下反应2小时；反应结束，冷却10分钟；加无水乙醇10mL左右，9500rpm，15分钟离心；再加20mL无水乙醇涡旋震荡，9500rpm，15分钟离心，重复上次离心操作；最后分散于20mL乙醇中，从而获得二氧化硅球。
(2)制备APTES修饰后的介孔二氧化硅：将(1)中获得的二氧化硅球离心后收集沉淀，重新超声分散至装有20mL无水乙醇的三角瓶中，同时向三角瓶加入200uL的APTES，获得的混和反应体系过夜搅拌即反应时间需要≥12小时。次日，进行离心洗涤，参考步骤(1)中操作。接着，将收集的沉淀分散至50mL的无水乙醇溶液内，加入0.3g的硝酸铵，在60℃下冷凝回流8小时，用乙醇离心洗涤操作参照前面步骤(离心2次)，最后离心后倒去上清，重悬于10mL超纯水中，得到APTES修饰后的介孔二氧化硅纳米材料样品。
(3)制备硅基普鲁士蓝纳米酶即将普鲁士蓝锚定在介孔二氧化硅上的操作步骤：先配置A液，将98mg柠檬酸和8.45mg K4[Fe(CN)6]加入到装有20mL超纯水的三角瓶中，超声5分钟至体系完全澄清透亮，得到A液待用。然后，将水浴锅调至60℃，将装有10mL超纯水三角瓶放到水浴锅内，然后加入5.4mg FeCl3·6H2O以及步骤(2)中5mL的样品，850rpm下搅拌至完全溶解，然后加入98mg的柠檬酸。在连续搅拌10分钟后，在搅拌中用恒定速度5mL/min将A液滴入上述体系中，此时体系为酸性状态，用pH试纸测得pH在3左右；在60℃，850rpm下继续搅拌5分钟后，转移至室温条件下搅拌30分钟冷却至室温，最后进行离心洗涤操作，等体积的无水乙醇加入到上述样品中；9500rpm离心15分钟，弃去上清，接着沉淀通过超声处理将纳米颗粒重新分散在20mL蒸馏水中，并通过添加20mL的无水乙醇再次离心。纯化过程再重复3次，所得沉淀物在烘箱中在50℃下真空干燥过夜，得到硅基普鲁士蓝纳米酶材料的蓝色粉末。
对本实施例1所得的APTES修饰后的介孔二氧化硅球(如图2)和硅基普鲁士蓝纳米酶材料(如图3)分别进行了透射电镜分析，通过对比可以看出PB已经成功锚定嵌合在介孔二氧化硅球上，最后得到的硅基普鲁士蓝纳米酶材料是一种直径在110～140nm的纳米级颗粒，这种颗粒呈表面不规则的球体状，整体的尺寸较为均匀。
为了进一步确认硅基普鲁士蓝纳米酶材料的成功合成，测定了单独PB纳米材料、APTES修饰后的介孔二氧化硅球以及硅基普鲁士蓝纳米酶材料的紫外-可见光吸收光谱图(如图4a)以及二氧化硅球、APTES修饰后二氧化硅球、APTES修饰后的介孔二氧化硅球、单独PB、硅基普鲁士蓝纳米酶材料的表面电位(如图4b)。从图4a中，1：APTES修饰后的介孔二氧化硅球，2：PB纳米材料，3：硅基普鲁士蓝纳米酶材料的紫外-可见光吸收光谱图可以看出，硅基普鲁士蓝纳米酶材料和PB纳米材料有相似的吸收峰(700nm处)，而APTES修饰后的介孔二氧化硅球则没有该峰，再结合上述透射电镜结果来看，进一步证明PB已经成功锚定嵌合在介孔二氧化硅球上。从图4b中，1：二氧化硅，2：APTES修饰后二氧化硅球，3：APTES修饰后的介孔二氧化硅球，4：单独PB，5：硅基普鲁士蓝纳米酶材料的表面电位可以看出，随着制备过程中每一步的进行，每个阶段的材料都对应着表面电位发生了相应的变化，最终硅基普鲁士蓝纳米酶材料和单独PB的表面电位几乎相同，再次证明了PB已经成功锚定嵌合在介孔二氧化硅球上。综合以上所有结果分析来看，硅基普鲁士蓝纳米酶材料证明被成功制备。
实施例2硅基普鲁士蓝纳米酶的模拟过氧化物酶活性模型建立
本实施例模拟过氧化酶的具体过程包括以下步骤：
(1)配制硅基普鲁士蓝纳米酶悬浊液：将实施例1获得的硅基普鲁士蓝纳米酶材料粉末研磨后溶于超纯水中，配成浓度为200μg/mL，然后对悬浮液进行超声处理20～30分钟，使其均匀分散在水溶液中制得深蓝色纳米酶悬浮液；
(2)配制浓度800μmol/L H2O2水溶液和浓度为40mmol/L的TMB无水乙醇溶液，在接下来测试中用来稀释不同倍数备用；
(3)在以H2O2为底物时，反应体系的终浓度为0.5mmol/L TMB，5μg/mL的硅基普鲁士蓝纳米酶材料，H2O2浓度为0.1，0.5，1，2，3，4，5，6，10，15，20，25mmol/L，用NaAc-HAc(pH＝4)缓冲液缓冲液提供酸性环境，在37℃下孵育30分钟后，用酶标仪测其在652nm处的吸收值；
(4)在以TMB为底物时，反应体系的终浓度为20mmol/L H2O2，5μg/mL的硅基普鲁士蓝纳米酶材料，TMB浓度为0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，1.0mmol/L，用NaAc-HAc(pH＝4)缓冲液缓冲液提供酸性环境，在37℃下孵育20分钟后，用酶标仪测其在652nm处的吸收值；
结果分析，为了证明硅基普鲁士蓝纳米酶有过氧化物活性酶，如图5可以看出，1：单独硅基普鲁士蓝纳米酶，2：硅基普鲁士蓝纳米酶+H2O2，3：硅基普鲁士蓝纳米酶+TMB在652nm处均无吸收峰值，只有4：硅基普鲁士蓝纳米酶+H2O2+TMB都存在才会在652nm处表现出明显特征吸收峰，由此可以证明硅基普鲁士蓝纳米酶是由有过氧化物活性的。值得注意的是，图5这里硅基普鲁士蓝纳米酶浓度为5μg/mL却没有在700nm出现吸收峰，同时也证明了该浓度下硅基普鲁士蓝纳米酶不会对模拟过氧化物酶活性测试造成干扰。
图6为本发明实施例2硅基普鲁士蓝纳米酶的动力学测试曲线；从图6的动力学测试中可以看出，1：硅基普鲁士蓝纳米酶+H2O2，2：硅基普鲁士蓝纳米酶+TMB的组合在652nm处的吸收值没有随时间发生明显变化，只有3：硅基普鲁士蓝纳米酶+H2O2+TMB的吸光值急剧上升，进一步证明了该纳米酶材料在模拟过氧化物酶活性上表现出色。
为了进一步探究该纳米酶活性最佳条件，从图7可以看出该纳米酶在pH＝4(图7a)、37℃(图7b)的条件下相对酶活性最高。基于上述结果以及测试步骤，在最适条件下，得到了H2O2酶的Michaelis-Menten拟合曲线(图8a)、H2O2酶活双倒数曲线(图8b)以及TMB酶的米氏方程拟合曲线(图9a)以及TMB酶活双倒数曲线(图9b)，经计算得知H2O2酶和TMB酶的Km分别为1.08mmol/L、0.45mmol/L，均表现出对酶底物很强的结合力，该结果要远好于天然酶，侧面证明了该纳米酶的高催化活性。综合上述酶动力学结果分析来看，硅基普鲁士蓝纳米酶材料有着优异的类过氧化物酶催化活性。
实施例3硅基普鲁士蓝纳米酶材料在GSH检测中的应用
在实施例2中利用硅基普鲁士蓝纳米酶材料成功构建了其模拟过氧化物酶活性的模型，基于此，利用其来构建检测GSH的平台，具体硅基普鲁士蓝纳米酶检测GSH的机制示意图如图10所示。
由于硅基普鲁士蓝纳米酶材料有着出色的类过氧化物酶活性，在酸性条件下，H2O2会被催化分解产生羟基自由基，进而使得无色TMB氧化成蓝色TMBox，GSH刚好可以将蓝色TMBOX还原成无色TMB，使溶液由蓝色变浅，在这个过程中652nm处的吸光度会下降且与GSH的浓度在一定范围内呈线性关系。在该实施中，首先先配置好浓度200μg/mL的硅基普鲁士蓝纳米酶悬浊液，40mmol/L的TMB无水乙醇溶液，800mmol/L的H2O2水溶液待用；接着，进行检测GSH，该反应体系体积为1mL，其中硅基普鲁士蓝纳米酶样品、TMB、H2O2的加入量分别为25μL、12.5μL、25μL，以及912.5μL的NaAc-HAc缓冲液(pH＝4)，最后加入不同浓度的25μL的GSH溶液；最后，该体系中硅基普鲁士蓝纳米酶样品、TMB、H2O2终浓度为5μg/mL、0.5mmol/L、20mmol/L，GSH的终浓度范围为1～250μmol/L。然后，将该体系混合均匀后，在37℃下孵育18分钟，在酶标仪下测得在652nm处的吸收值。
结果分析，如图11a得到了在加入不同浓度GSH的体系的△A变化曲线图(△A：A0-A，A0：GSH为0μmol/L的吸收值，A：不同浓度对应的吸收值)，可以看出在低浓度段有良好的线性关系(图11b)，另外肉眼也可以明显观察出不同GSH浓度下体系的颜色变化，如图11c。这说明了，在这个GSH浓度范围内，对GSH可以进行准确检测。通过对数据分析，得出线性回归方程为：y＝0.01138×[GSH]-0.0009984([GSH]表示GSH浓度，单位μmol/L)，R2＝0.99,通过公式计算出检测限LOD(S/N＝3)为0.91μmol/L，检测范围为1～120μmol/L。
为了进一步验证该方法检测GSH的选择性，将GSH换成了与GSH浓度相同的其他干扰小分子、氨基酸或金属离子(均为250μmol/L)，图12为本发明实施例3硅基普鲁士蓝纳米酶对GSH的选择性检测图。从图12可以看出，大部分小分子、氨基酸以及金属离子不会对GSH的造成干扰；其中半胱氨酸(Cys)和AA会对GSH的测定有不利影响，考虑到生物体内Cys的浓度远远低于GSH且AA主要靠外界食物获取体内含量极低，若要是在体外细胞水平上进行GSH检测其AA的损耗高达96％，几乎可以忽略不计。综上所述，硅基普鲁士蓝纳米酶材料可用于GSH的检测，具有合理的选择性，甚至可以应用到生理体液(血液、唾液、尿液等)、细胞内中的GSH的检测，是一种方便、高效、灵敏以及经济的检测GSH的手段。因此，可以将其应用到实际的GSH浓度的检测之中，对与GSH相关的生物分析和临床诊断有一定的应用价值。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式可以进行多种变化、修改、替换和变型，但仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种硅基普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)制备二氧化硅球：在水中加入十六烷基三甲基溴化铵得到混合体系，然后放入水浴加热锅中，依次加入无水乙醇、NaOH溶液、正硅酸乙酯反应，得到二氧化硅球；
(2)制备3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)修饰后的介孔二氧化硅：将步骤(1)中获得的二氧化硅球重新超声分散至无水乙醇中，同时加入APTES，获得的混和反应体系过夜搅拌，次日，进行离心洗涤，接着，将收集的沉淀分散至无水乙醇溶液内，加入硝酸铵冷凝回流反应，得到APTES修饰后的介孔二氧化硅纳米材料；
(3)制备硅基普鲁士蓝纳米酶：将柠檬酸和亚铁氰化钾K4[Fe(CN)6]混合得到A液，然后将水浴锅调至60℃，将水、FeCl3·6H2O、步骤(2)中APTES修饰后的介孔二氧化硅纳米材料加入，搅拌溶解，再加入柠檬酸搅拌，再滴加A液搅拌，搅拌完成后，再转移至室温条件下搅拌，得到硅基普鲁士蓝纳米酶。
2.根据权利要求1所述的一种硅基普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中十六烷基三甲基溴化铵的质量g：无水乙醇的体积mL：NaOH溶液的体积μL：正硅酸乙酯的体积μL为0.05～0.2：2～3：100～200：150～200。
3.根据权利要求1所述的一种硅基普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)的反应温度为70℃，反应时间为2-3h。
4.根据权利要求1所述的一种硅基普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中APTES的体积μL：硝酸铵的质量g为150～300：0.2～0.5。
5.根据权利要求1所述的一种硅基普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)冷凝回流的温度为60℃，时间为6～12h。
6.根据权利要求1所述的一种硅基普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中K4[Fe(CN)6]、两次柠檬酸分别用量、FeCl3·6H2O的质量比为8.0～8.6：95～100：5.2～5.6。
7.根据权利要求1所述的一种硅基普鲁士蓝纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中在A液滴加过程中，反应体系始终处于搅拌状态且在60℃的水浴状态下，在A液加完后，体系在60℃下继续搅拌3～7分钟再转移至室温搅拌冷却。
8.权利要求1所述的制备方法得到的硅基普鲁士蓝纳米酶材料，呈直径为110～140nm的表面粗糙的规则球形纳米颗粒。
9.权利要求8所述的硅基普鲁士蓝纳米酶材料在比色检测谷胱甘肽中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的检测GSH含量的方法包括：将待测的GSH加入到含有硅基普鲁士蓝纳米酶、TMB、H2O2的NaAc-HAc缓冲液混合体系中，在特定条件下孵育，然后检测在652nm处的吸光度，最后计算处GSH的浓度。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 二硫化钼-普鲁士蓝纳米酶的制备及其对胆固醇的电化学传感;薛中华;彭昊;薛新;罗明月;安鹏莉;;西北师范大学学报(自然科学版);20190515(03);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115753649A (zh) | 2023-03-07 |
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