CN112161979A - 一种过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种过氧化物酶活性Imm‑Fe3+‑IL纳米酶的应用。所述的Imm‑Fe3+‑IL作为过氧化物酶进行使用。基于Imm‑Fe3+‑IL纳米材料的过氧化物酶活性，可以检测H2O2，其线性范围为1～200μmol/L，最低检测限为0.35μmol/L；Imm‑Fe3+‑IL纳米酶当与葡萄糖氧化酶(GOx)偶联时，葡萄糖可以在10～200μmol/L的范围内呈现良好的线性关系，葡萄糖最低检测限为3.31μmol/L；Imm‑Fe3+‑IL纳米酶用于牛奶中的H2O2检测，可以满足牛奶中H2O2的测定，并且具有较高的准确性和重复性，这些发现意味着Imm‑Fe3+‑IL纳米材料具有构建低成本和简单的生物传感器的有巨大潜力，可被广泛应用于可产生H2O2的生物分子(如葡萄糖、胆固醇、黄嘌呤、葡萄糖、乳酸、胆碱、丙酮酸和谷氨酸等)的比色法测定中。

Description

一种过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用
技术领域
本发明涉及一种过氧化物酶，特别是一种过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用。
背景技术
过氧化氢(H2O2)作为环境和生物过程中的关键中间体，以及细胞信号转导的信使，在生物体中起着重要作用。葡萄糖是人体内不可缺少的一种物质，是细胞新陈代谢的能量来源。人类的生理健康和疾病都与葡萄糖的浓度密切相关，如糖尿病、中风、失明、肾衰竭、周围神经病变等疾病。在生物体内，在葡萄糖氧化酶(GOx)的作用下将葡萄糖氧化葡萄糖醛酸和H2O2；在过氧化物酶的催化作用下，将H2O2分解为氧气或氧化合适的底物。因此，H2O2和葡萄糖的准确检测在食品，制药，临床，工业和环境保护等许多领域都非常重要。
酶是由活细胞产生的一类具有催化功能的有机分子，过氧化物酶属于天然酶，具有催化效率高、底物专一、反应条件温和等特点。由于酶的化学本质是蛋白质，在酸、碱、热等非生理环境中容易发生结构变化而失。而纳米材料模拟酶具有成本低、稳定性好和易于存储的优点，所以具有酶类活性的纳米材料日益成为研究的热点。比色法是一种快速，方便的H2O2和葡萄糖检测方法。与其他荧光、化学发光、电化学，比色分析方法具有成本低、方便、快速、实用等特点，并且可以用肉眼观察到底物的颜色变化。Wang等通过共沉淀法制备了磁性纳米材料(Fe3O4MNPs)具有过氧化物酶活性，在H2O2存在下，将制备好的Fe3O4 MNP催化过氧化物酶底物ABTS氧化成有色产物。使用GOx和Fe3O4 MNP开发了一种灵敏且选择性的葡萄糖检测方法。其葡萄糖的线性范围为5×10-5～1×10-3mol/L，检测限为3×10-5mol/L。Guo等通过共沉淀法制备Fe3(PO4)2·8H2O纳米花具有过氧化物酶的活性。研究表明：Fe3(PO4)2·8H2O纳米花比HRP对H2O2和TMB具有更强的结合亲和力。开发了基于Fe3(PO4)2·8H2O纳米花的比色平台，以确定H2O2和葡萄糖。H2O2和葡萄糖的线性范围分别为1×10-8～2.5×10-3mol/L和8×10-7～1.2×10-3mol/L，LOD分别低至5nmol/L和35nmol/L。Aghayan等通过溶胶-凝胶法制备的Fe-MSN纳米材料具有过氧化物酶的活性。采用制备的Fe-MSN模拟过氧化物酶催化H2O2氧化底物TMB产生可溶性的蓝色产物。联合GOx建立了H2O2和葡萄糖的比色检测平台。其H2O2和葡萄糖的线性范围分别为7.2～100μmol/L和4.1～100μmol/L，最低检测限分别为1.2μmol/L和1.2μmol/L。迄今为止，已发现许多过氧化物酶模拟物如Fe3O4-Cu2+、PCN-222(Fe)、GQDs/CuO、NiFe-LDHNS、ATP-Fe3O4纳米粒子和PDI-Fe3O4纳米粒子，并成功开发并应用于H2O2和葡萄糖的检测。
离子液体具有独特的溶剂性能，可以溶解有机、无机、金属化合物和气体，固载功能化离子液体是一类集功能化离子液体和载体的优点于一身的新材料和催化剂。SiO2固载咪唑鎓离子液体金属催化剂，可以催化Heck反应、Suzuki反应、烯烃的环氧化、不对称环氧化和烯丙位氧化反应，但是未见其用于H2O2和葡萄糖的检测。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用。本发明具有通过溶胶-凝胶法制备的Imm-Fe3+-IL纳米材料，已经证明其具有高效的内在过氧化物酶样活性，在H2O2存在下催化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的氧化并产生蓝色反应；动力学分析表明，符合典型的米氏方程和遵循乒乓机制；基于Imm-Fe3+-IL纳米材料的过氧化物酶活性，可以检测H2O2，其线性范围为1～200μmol/L，最低检测限为0.35μmol/L；Imm-Fe3+-IL纳米酶当与葡萄糖氧化酶(GOx)偶联时，比色法检测葡萄糖可以在10～200μmol/L的范围内呈现良好的线性关系，葡萄糖最低检测限为3.31μmol/L；Imm-Fe3+-IL纳米酶用于牛奶中的H2O2检测，具有较高的准确性和重复性，可以满足牛奶中H2O2的测定。这些发现意味着Imm-Fe3+-IL纳米酶具有构建低成本和简单的生物传感器的有巨大潜力，可被广泛应用于可产生H2O2的生物分子(如葡萄糖、胆固醇、黄嘌呤、葡萄糖、乳酸、胆碱、丙酮酸和谷氨酸等)的比色法测定中。
本发明的技术方案：一种过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，所述Imm-Fe3 +-IL纳米酶的结构式为：
Figure BDA0002712816100000031
,
该Imm-Fe3+-IL纳米酶作为过氧化物酶进行使用；
所述Imm-Fe3+-IL纳米酶为硅胶固载1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑-四氯化铁。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于比色法检测H2O2。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，所述Imm-Fe3+-IL纳米酶在H2O2存在下催化过氧化物酶底物的氧化并产生蓝色反应；所述过氧化物酶底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，所述Imm-Fe3+-IL纳米酶用于检测H2O2，其线性范围为1～200μmol/L，最低检测限为0.35μmol/L。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于检测H2O2，包括以下步骤：①将3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、Imm-Fe3+-IL和H2O2溶液加入到乙酸盐缓冲液；②将混合溶液温育；③用紫外分光光度计在652nm处测量所得反应混合物的吸光度。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，将Imm-Fe3+-IL纳米酶与葡萄糖氧化酶联用检测葡萄糖。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，所述Imm-Fe3+-IL纳米酶与葡萄糖氧化酶联用检测葡萄糖，其线性范围为10～200μmol/L，葡萄糖最低检测限为3.31μmol/L。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，所述的是葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化产生葡萄糖醛酸和H2O2，并在Imm-Fe3+-IL纳米酶和H2O2存在下催化氧化过氧化物酶底物成为蓝色产物；所述过氧化物酶底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，将Imm-Fe3+-IL纳米酶与葡萄糖氧化酶联用检测葡萄糖，葡萄糖的检测包括有以下步骤：①将葡萄糖氧化酶和葡萄糖加入磷酸盐缓冲液中混合，温育，得混合物；②将3,3',5,5'-四甲基联苯胺、Imm-Fe3+-IL纳米酶和乙酸盐缓冲液中加入到上述的混合物中，温育，最后用紫外分光光度计在652nm处测量其混合物的吸光度。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于牛奶中的H2O2检测。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于牛奶中的H2O2检测，包括有以下步骤：①首先通过向牛奶样品中添加三氯乙酸(1％,v/v)并超声处理，去除牛奶样品中的蛋白质，离心，将上清液通过膜过滤以除去脂质，得处理后的牛奶样品；②将3,3',5,5'-四甲基联苯胺、Imm-Fe3+-IL纳米酶和乙酸盐缓冲液加入到上述的处理后的牛奶样品中，温育，最后用紫外分光光度计在652nm处测量其混合物的吸光度。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，将Imm-Fe3+-IL纳米酶作为过氧化物酶测定时，样品处理条件是：pH为2～3,温度为40～60℃,Imm-Fe3+-IL纳米酶用量≧0.35mg/mL,3,3',5,5'-四甲基联苯胺用量5～10mM。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，将Imm-Fe3+-IL纳米酶作为过氧化物酶测定时，样品处理条件是：pH为3,温度为50℃，Imm-Fe3+-IL纳米酶用量≧0.35mg/mL,3,3',5,5'-四甲基联苯胺用量7mM。
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，所述Imm-Fe3+-IL纳米酶的合成路线为：
Figure BDA0002712816100000051
前述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用中，所述Imm-Fe3+-IL是这样制备的：
将新蒸馏的N-甲基咪唑0.05mol(4mL)加入到带有回流装置的50mL干燥的两口烧瓶中，在搅拌下向烧瓶中缓慢滴加12mL(0.05mol)3-氯丙基三乙氧基硅烷，20min内滴完，在110℃条件下搅拌，用TLC(展开剂：V甲醇：V二氯甲烷＝1:1)跟踪反应，反应48h后结束，体系呈淡黄色粘稠液体，将体系冷却至室温，向混合产物中加入3×10mL乙醚搅拌洗涤，然后静置移走上层液体，再在30℃下旋蒸除去乙醚溶剂，最后在60℃下真空干燥6h得到纯的1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑氯鎓盐中间体；
将1.02g(2.8mmol)十六烷基三甲基溴化铵、6.15mL(160mmol)NH3·H2O和36mLH2O加入到100mL圆底烧瓶中，在80℃下搅拌30min，然后向上述溶液中滴加4.16mL(20mmol)原硅酸四乙酯和1.13g(1.6mmol)1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑氯鎓盐中间体，在80℃下搅拌4h后将温度升高到100℃陈化24h，反应完后，待冷却至室温后，进行过滤用，H2O洗涤滤饼，然后在60℃下真空干燥24h。将所得固体加入150mL乙醇和5mLHCl(37％,重量百分比)的溶液中，并将混合物在50℃中搅拌6h除去表面活性剂，然后过滤并用3×20mL乙醇洗涤，并在60℃下干燥24h，得到白色粉末材料Imm-IL；
将上述制备的Imm-IL 0.5g和无水的三氯化铁0.5g，在乙腈中回流24h，最后过滤并用乙醇洗涤，在真空60℃干燥6h，得到淡黄色的产物Imm-Fe3+-IL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以N-甲基咪唑和3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPTES)为原料合成中间体为1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑氯鎓盐，在碱性条件下与模板剂CTAB存在下，通过溶胶-凝胶法制得硅胶固载1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑氯鎓，再与无水FeCl3进行配位螯合，制得硅胶固载1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑-四氯化铁，表示为Imm-Fe3+-IL。
通过溶胶-凝胶法制备的Imm-Fe3+-IL纳米材料具有类过氧化物酶的活性，能够催化过氧化氢(H2O2)快速氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)产生相应的颜色变化。稳态动力学分析表明，Imm-Fe3+-IL纳米材料遵循典型的Michaelis-Menten模型和乒乓机理。与辣根过氧化物酶(HRP)相比，Imm-Fe3+-IL纳米材料对底物TMB具有更强的亲和性。联合葡萄糖氧化酶建立了H2O2和葡萄糖的比色检测方法。
基于Imm-Fe3+-IL纳米材料的过氧化物酶活性，可以用比色法检测H2O2，其线性范围为1～200μmol/L，最低检测限为0.35μmol/L。Imm-Fe3+-IL纳米酶当与葡萄糖氧化酶(GOx)偶联时，可以选择性地检测葡萄糖，可以在10～200μmol/L的范围内呈现良好的线性关系，葡萄糖最低检测限为3.31μmol/L；Imm-Fe3+-IL纳米酶用于牛奶中的H2O2检测，回收率为96～108.3％，RSD值为3.1～8.6％，具有较高的准确性和重复性，可以满足牛奶中H2O2的测定。这些发现意味着Imm-Fe3+-IL纳米酶具有构建低成本和简单的生物传感器的有巨大潜力，可被广泛应用于可产生H2O2的生物分子(如葡萄糖、胆固醇、黄嘌呤、葡萄糖、乳酸、胆碱、丙酮酸和谷氨酸等)的比色法测定中。
1、实验证明：
1.1试剂与仪器
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、蔗糖、葡萄糖和麦芽糖，上述均为分析纯试剂，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；98％葡萄糖氧化酶(GOx，来源于黑曲霉，购自北京百灵威科技有限公司)；无水乳糖(分析纯)，乙酸钠三水合物(优级纯)，购自苏州市麦克林医疗器械制品有限公司；30％过氧化氢(H2O2，分析纯)，购自贵州博奥瑞杰生物科技有限公司；磷酸二氢钠、CTAB和γ-氯丙基三乙氧基硅烷，均为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸，无水三氯化铁，均为分析纯试剂，购自萨恩化学技术(上海)有限公司；N-甲基咪唑(分析纯)，购自常州市中凯化工有限公司；氨水(分析纯)，购自成都金山化学试剂有限公司，原硅酸四乙酯(TEOS，分析纯)购自成都科龙化工试剂。
采用S-3400N型扫描电子显微镜(SEM，HITACHI(日立)公司)对产物的表面微观形态进行表征；采用Nicolet is5型傅里叶转换红外光谱图(FTIR，美国赛默飞世尔)对产物进行红外光谱扫描；UV-9000型紫外可见光分光光度计(UV-vis，上海元析仪器有限公司)。
1.2实验方法
1.2.1 Imm-Fe3+-IL纳米材料的制备
Imm-Fe3+-IL的制备路线如图1所示。
1.2.1.1中间体1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑氯鎓盐(IL)的合成
首先制备中间体，具体步骤如下：将新蒸馏的N-甲基咪唑(0.05mol，4mL)加入到回流装置的50mL干燥的两口烧瓶中，在搅拌下向烧瓶中缓慢滴加(20min内滴完)0.05mol(12mL)3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPTES)，在110℃条件下剧烈搅拌，用TLC(展开剂V(甲醇)：V(二氯甲烷)＝1:1)跟踪反应，反应48h后结束，体系呈淡黄色粘稠液体。将体系冷却至室温，向混合产物中加入3×10mL乙醚洗涤使其剧烈搅拌，然后静置移走上层液体，再在30℃下旋蒸除去乙醚溶剂，最后在60℃下真空干燥6h得到纯的1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑氯鎓盐中间体(IL)。
1.2.1.2 Imm-IL合成
将1.02g(2.8mmol)CTAB、6.15mL(160mmol)NH3·H2O和36mLH2O加入到100mL圆底烧瓶中在80℃下搅拌30min，然后向上述溶液中滴加4.16mL(20mmol)TEOS和1.13g(1.6mmol)IL的混合溶液，在80℃下搅拌4h后将温度升高到100℃陈化24h。反应完后，待冷却至室温后，进行过滤用H2O洗涤滤饼，然后在60℃下真空干燥24h。将所得固体下加入150mL乙醇和5mLHCl(37％)的溶液中，并将混合物在50℃中搅拌6h除去表面活性剂。然后过滤并用乙醇(3×20mL)洗涤，并在60℃下干燥24h。得到白色粉末材料(Imm-IL)。
1.2.1.3 Imm-Fe3+-IL的合成
将上述制备的Imm-IL(0.5g)和无水的三氯化铁(0.5g，FeCl3)在乙腈中回流24h，最后过滤并洗涤，在真空60℃下干燥6h，得到淡黄色的产物(Imm-Fe3+-IL)。
1.3 Imm-Fe3+-IL的类过氧化物酶的催化活性研究
1.3.1溶液配制与紫外检测参数
1)TMB(8mmol/L)储备液的配制
TMB(8mmol/L)＝A液+B液
A液：0.01970g TMB+100μL DMSO
B液：24.3mL，0.1mol/L柠檬酸+5.7mL，0.2mol/L磷酸氢钠用水定容至100mL
2)H2O2储备液的配制
(1)取H2O2(95％)0.0802mL用水定容至10mL，浓度为80mmol/L。
(2)不同浓度H2O2的配制，见表1；
表1 牛奶中H2O2加标信息
Figure BDA0002712816100000091
3.乙酸盐缓冲溶液的制备
称取3.402g乙酸钠加水定容至500mL，加HCl调pH至3，配得50mmol/L的乙酸钠缓冲溶液。
4.紫外检测参数
石英比色皿(10mm)，加样量一般至比色皿的三分之二。
652nm处出峰(起始波长350-800nm，扫描间隔2.0nm)。
1.3.2 Imm-Fe3+-IL的类过氧化物酶活性实验
通过在H2O2存在下，Imm-Fe3+-IL纳米材料作为模拟酶催化底物TMB的氧化来评估其过氧化物酶的催化活性。催化实验如下：混合物由300μLImm-Fe3+-IL(0.35mg/mL)，300μLH2O2(80mmol/L)，300μLNaAc缓冲溶液(pH＝3、50mmol/L)和300μLTMB(7mmol/L)在50℃下孵育20min。然后，记录了在652nm处的UV-Vis吸收光谱。
此外，研究了缓冲溶液pH(2～9)、孵育温度(20～80℃)和催化剂Imm-Fe3+-IL浓度(0～0.5mg/mL)对Imm-Fe3+-IL的过氧化物酶活性的影响。
1.4动力学分析
为了研究Imm-Fe3+-IL的稳态动力学，通过许多实验计算了两个最重要的动力学参数：米氏常数(Km，单位为mmol/L)和最大反应速率(Vmax，单位为mol/(L·s))。首先，保持TMB浓度恒定并改变H2O2浓度(0.1～1.0mmol/L)，混合溶液由乙酸钠缓冲液(300μL，50mmol/L，pH＝3)、Imm-Fe3+-IL(300μL，0.35mg/mL)以及TMB和H2O2溶液，并在50℃下反应20分钟。最后，通过UV-Vis在652nm处记录混合物的吸光度。类似地，通过在相同条件下保持H2O2浓度和改变TMB浓度来研究用于以H2O2为底物进行动力学分析。
通过从Michaelis-Menten方程导出的Lineweaver-Burk图以计算酶动力学参数，详见公式(1)和(2)：
A＝kbc (1)
Figure BDA0002712816100000101
其中V是反应的初始速度，Vmax是最大反应速率(mol/(L·s))，[S]是底物的浓度(mmol/L)，Km是代表酶亲和力的米氏常数(mmol/L)。在此，根据Lambert-Beer定律对Ox-TMB浓度进行定量，其中，A为吸光度，b为溶液的厚度(cm)，c为Ox-TMB的浓度(mmol/L)，k为摩尔吸收系数。通常被认为是39000cm-1。
1.5 H2O2和葡萄糖的检测
在典型的检测和测量中：①将300μLTMB(7.0mmol/L)，300μLImm-Fe3+-IL储备溶液(0.35mg/mL)和不同浓度的H2O2溶液(0.001～1mmol/L)加入到2mL乙酸盐缓冲液(pH＝3.0，50mmol/L)；②将混合溶液在50℃温育20min；③用分光光度计测量所得反应混合物的吸光度。
为了证明Imm-Fe3+-IL纳米酶可用于真实样品(牛奶)中的H2O2检测。实验如下：首先通过向牛奶样品中添加1％(v/v)三氯乙酸并超声处理20分钟，去除牛奶样品中的蛋白质。将样品以12000rpm离心10分钟后，将上清液通过0.22μm膜(Whatman)过滤以除去脂质。将处理后的牛奶样品分成四份，各放入5mL玻璃试管中，向其中三个试管中添加不同体积的H2O2储备溶液(2μM、5μM、10μM)，可以制备出含不同浓度H2O2的牛奶样品。根据上述步骤进行反应，测量其吸光度，通过H2O2的溶液的标准曲线计算出每个样品中H2O2的含量。
葡萄糖的检测步骤：①将200μL，浓度为1.0mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOx)和1.0mL的不同葡萄糖浓度加入1mL的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.0)中混合并在37℃下温育30min。②将300μL的TMB(4mmol/L)，浓度为0.35mg/mL的Imm-Fe3+-IL纳米酶和2mL的乙酸盐缓冲液中(50mmol/L，pH为3)加入到上述的混合物中并在50℃下温育20min，最后用紫外分光光度计下测量其混合物的吸光度的变化。
为了评估Imm-Fe3+-IL纳米材料的长期储存稳定性，将Imm-Fe3+-IL纳米材料在含有0.35mg/mL的水溶液中室温条件下储存7天，每天记录其吸光度值得变化。
为了测试葡萄糖检测的选择性，使用蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖代替葡萄糖进行对照实验，对照样品的浓度是葡萄糖的浓度的5倍。
2结果与讨论
2.1 Imm-Fe3+-IL的表征
通过溶胶-凝胶法合Imm-Fe3+-IL纳米材料，产物的颜色为淡黄色粉末并且能够很好地分散在水中。图2为Imm-IL和Imm-Fe3+-IL的傅里叶转换红外光谱图。
从图中可以得出，1575cm-1出现的振动峰归因于咪唑环上的C＝C的吸收峰；1636cm-1左右的峰是吸附水的弯曲振动峰；3405cm-1是可能含有少量的水中OH的伸缩振动峰；1077cm-1左右的峰归因于咪唑的H—C—N的弯曲振动；2978、2738和1390cm-1左右的峰带分别为甲基上的C—H的反对称伸缩振动、对称伸缩振动和弯曲振动；802cm-1左右的峰归因于Si—O—Si的伸缩振动；728cm-1左右的峰是FeCl4的峰。这证明了已经成功合成了Imm-Fe3 +-IL。
Imm-Fe3+-IL的扫描电子显微镜的表征(SEM)(如图3所示)，所制备的Imm-Fe3+-IL呈颗粒状，颗粒轮廓分明，并且的表面光滑柔软(图3A)；通过放大到3000倍时候，可以显示出非常均匀的颗粒(图3B)。
2.2 Imm-Fe3+-IL纳米材料的过氧化物酶活性
在H2O2存在下，通过在过氧化物酶底物TMB的催化氧化下来评估Imm-Fe3+-IL的过氧化物酶活性。过氧化物酶底物TMB是一种典型的生色试剂，经常与过氧化物酶一起使用，以将H2O2还原为H2O，用于检测Imm-Fe3+-IL纳米材料的过氧化物酶样活性。如图4所示，图4谱线a是H2O2+TMB+Imm-Fe3+-IL体系，在H2O2和TMB混合溶液中添加Imm-Fe3+-IL之后，体系呈现明显的蓝色，并在652nm处出现很大的吸收峰。图4谱线b是TMB+Imm-Fe3+-IL体系，可以看出在没有H2O2的情况下，体系在652nm有特征吸收峰。表明在没有H2O2的存在下，Imm-Fe3+-IL表现出过氧化氢酶的活性。图4谱线c是H2O2+Imm-Fe3+-IL体系，没有TMB存在，所以在652nm处无TMB的特征吸收。表明Imm-Fe3+-IL在H2O2存在下能氧化TMB使溶液变蓝，并且在652nm处有最大吸收，具有很好的类过氧化物酶活性。
2.3 Imm-Fe3+-IL催化条件的优化
天然的HRP和其他基于纳米材料的过氧化物酶的催化活性取决于pH和温度。因此，进一步研究了pH、孵育温度、H2O2的浓度、TMB的浓度和催化剂浓度对Imm-Fe3+-IL的催化活性的影响。考察了pH在2～9之间，温度从20～80℃变化对Imm-Fe3+-IL的过氧化物酶样活性的影响，结果发现，当pH＝3、反应温度为50℃时，体系的吸光度达到最大值。其中，pH值对体系反应的影响较大，当pH逐渐增加时，其吸光度值逐渐降低，当pH值为7～9时，基本没有反应活性。当反应温度20～50℃，体系的吸光度随着温度的增加而增加；当温度达到50℃时，体系的吸光度达到最大值；当反应温度在50～80℃时，体系的吸光度逐渐降低。表明了合成的Imm-Fe3+-IL具有类似酶的活性。因此，选择了pH＝3和50℃作为后续实验的标准条件。表明，在652nm处的吸光度值会随着H2O2或TMB浓度或催化剂浓度的增加而增加。另外，在催化剂浓度达到0.5mg/mL或H2O2浓度高达100mmol/L或TMB浓度高达10.0mmol/L时，没有发现Imm-Fe3+-IL催化反应的抑制，表明Imm-Fe3+-IL在高催化剂浓度或高H2O2或TMB浓度下也表现出稳定的催化活性。因此，将Imm-Fe3+-IL纳米酶作为过氧化物酶测定时，样品处理条件是：pH为2～3,温度为40～60℃,Imm-Fe3+-IL纳米酶用量≧0.35mg/mL,3,3',5,5'-四甲基联苯胺用量5～10mM。样品处理条件是：pH为3,温度为50℃，Imm-Fe3+-IL纳米酶用量≧0.35mg/mL,3,3',5,5'-四甲基联苯胺用量7mM。实验数据见：图5是本发明的Imm-Fe3+-IL作为过氧化物酶的反应条件pH的优化图；图6是本发明的Imm-Fe3+-IL作为过氧化物酶的温度的优化图；图7是本发明的Imm-Fe3+-IL作为过氧化物酶用量(以浓度计)的优化图；图8是本发明的Imm-Fe3+-IL作为过氧化物酶的H2O2浓度的优化图；图9是本发明的Imm-Fe3+-IL作为过氧化物酶考察底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺的用量图。
2.4 Imm-Fe3+-IL的稳态动力学测定
为了开发基于过氧化物酶的传感器，重要的是确定表观稳态动力学参数，例如Michaelis-Menten常数(Km)和最大反应初始速度(Vmax)。观察到TMB和H2O2的典型Michaelis-Menten曲线和相应的Lineweaver-Burk，Michaelis-Menten常数(Km)和最大反应初始速度(Vmax)。所有线的斜率是平行的，表明符合典型的乒乓机制。表明了Imm-Fe3+-IL纳米材料首先与第一底物结合并反应，生成第一产物，然后与第二底物反应。Km是米氏常数，它反映了纳米酶对其底物的亲和力。Km值越高，对底物的亲和力越低，反之，Km值越低，对底物的亲和力越高。动力学参数的总结，Imm-Fe3+-IL对TMB的Km和Vmax值为0.324mmol/L和8.03×10-8mol/(L·s)，对H2O2的值为0.467mmol/L和1.79×10-8mol/(L·s)。值得注意的是，Imm-Fe3+-IL与TMB和H2O2的Km值低于HRP，表明Imm-Fe3+-IL对TMB和H2O2的亲和力高于对HRP的亲和力，Imm-Fe3+-IL纳米材料与其他报道的纳米酶和HRP的Km和Vmax参数的比较见表2，对于底物H2O2和TMB，该催化剂Imm-Fe3+-IL的Km值都低于其它具有过氧化物酶活性的纳米材料Pt/PCN、H2TCPP-Fe3O4、β-CD-CuNCs、GO-Fe3O4、Ag@Fe3O4。这进一步证实了Imm-Fe3+-IL纳米材料可以用作替代过氧化物酶的人工模拟酶。
表2 Imm-Fe3+-IL纳米材料与其他报道的纳米酶和HRP的Km和Vmax参数的比较
Figure BDA0002712816100000151
2.5用制备的Imm-Fe3+-IL纳米材料检测H2O2和葡萄糖
Imm-Fe3+-IL纳米材料的催化活性依赖于H2O2浓度，开发了基于Imm-Fe3+-IL纳米材料的传感器，用于比色定量检测H2O2。图10显示了在最佳条件下，当H2O2浓度从1μmol/L到0.1mmol/L，在652nm处测量的典型H2O2浓度-响应曲线。从该图中，可以观察到随着H2O2浓度增加，吸光度逐渐增加。此外，同源线性校准曲线(图11)表现出H2O2浓度在1～200μmol/L范围内的线性相关性，其线性方程为y＝0.0557+1.30082x(y是吸收值，x是H2O2浓度)，相关系数为0.99458。检测限(LOD)为0.35μmol/L，根据信号计算，相当于空白标准偏差的3倍。其中LOD的精确度(相对标准偏差(RSD％))计算为0.213％(n＝5)。与其他铁基过氧化物酶模拟物相比，例如Fe3O4、PDI-Fe3O4、Fe3O4-Cu2+、PDI-Fe3O4、PCN-222(Fe)、Fe-MSN以及CoFe-LDHs，Imm-Fe3+-IL具有一个更宽的线性检测范围和低的检测限，如表3所示。
表3 比较了检测H2O2的传感材料的性能
Figure BDA0002712816100000161
现如今，葡萄糖的鉴定和检测是非常必要的，特别是在化学，制药和医疗行业的各个部分。此外，H2O2是葡萄糖氧化酶(GOx)催化葡萄糖氧化的主要产物之一；开发了基于纳米材料具有过氧化物酶活性的比色传感器，用于间接检测葡萄糖。一般机制包括两个步骤，首先葡萄糖与GOx和O2相互作用，产生葡萄糖醛酸和H2O2，并在Imm-Fe3+-IL存在下用H2O2催化过氧化物酶底物TMB氧化成蓝色产物(图12)。
图13显示了在最佳条件下在652nm处测量了葡萄糖浓度从1μmol/L到0.1mmol/L的典型葡萄糖浓度-响应曲线。从该图13中，可以观察到随着葡萄糖浓度增加，吸光度逐渐增加的明显趋势。此外，同源线性校准曲线(图14)表现出葡萄糖浓度在10～200μmol/L范围内的线性相关性，其线性方程为y＝0.04767+0.26221x(y是吸收值，x是葡萄糖浓度)，相关系数为0.9929。检测限(LOD)为3.31μmol/L，根据信号计算，相当于空白标准偏差的3倍。其中LOD的精确度(相对标准偏差(RSD％))计算为0.34％(n＝5)。与表4中列出的其他酶类纳米材料如Fe3O4，NiFe-LDHNS，ATP-Fe3O4 MNPs，N-GQDs，CuNCs和Cu-SBA-15相比，Imm-Fe3+-IL纳米材料具有更灵敏的线性范围和低的检测限。
表4 检测葡萄糖的纳米材材料的性能比较
Figure BDA0002712816100000171
2.6 Imm-Fe3+-IL检测葡萄糖的选择性
为了测试葡萄糖检测的选择性，使用蔗糖，果糖，乳糖和麦芽糖进行对照实验。比色法的选择性如图15所示。即使对照样品的浓度是葡萄糖浓度的5倍，含葡萄糖样品的吸光度也远高于对照样品。此外，肉眼观察到葡萄糖样品的蓝色变化，而对照样品的颜色变化可忽略不计。因此，此处开发的比色法显示出对葡萄糖检测的高选择性。
2.7 Imm-Fe3+-IL的稳定性
Imm-Fe3+-IL模拟酶显示出比天然过氧化物酶更好的稳定性。为了评估长期储存稳定性，将Imm-Fe3+-IL以浓度为0.35mg/mL的水溶液在室温下储存在含有以浓度为0.35mg/mL的水溶液中超过7天，结果表明催化剂达到了约85％的初始活性，表明Imm-Fe3+-IL具有良好的长期储存稳定性(图16)。
2.8 Imm-Fe3+-IL用于牛奶中H2O2的检测
H2O2通常被用作添加到生乳中的保鲜剂，特别是在冷藏不广泛的地区。但是，向牛奶中过量添加H2O2不仅会导致维生素(例如叶酸)和某些必需氨基酸的降解，降低牛奶的营养价值，还会导致胃肠道疾病。基于Imm-Fe3+-IL的固有过氧化物酶样活性的H2O2比色传感器来确定牛奶中的H2O2。结果列于表5所示，使用Imm-Fe3+-IL的线性相关性y＝0.0557+1.30082x，R 2＝0.99458，测得的牛奶样品中H2O2的回收率为96～108.3％，表明该方法可以满足牛奶中H2O2的测定，并且具有较高的准确性和重复性。表明Imm-Fe3+-IL纳米材料在实际样品分析中的可能性和潜在应用。
表5 用Imm-Fe3+-IL纳米酶测定牛奶样品中的H2O2
Figure BDA0002712816100000181
注：a:average value(n＝3)±standard deviation；b:RSD反应条件：将300μLTMB(7.0mM)，各300μL Imm-Fe 3+-IL储备溶液(0.35mg/mL)和不同浓度牛奶样品中H2O2的溶液加入到2mL乙酸盐缓冲液(pH＝3.0，50mM)，将混合溶液在50℃温育20分钟并用分光光度计测量所得反应混合物的吸光度。
3结论
通过溶胶-凝胶法制备的Imm-Fe3+-IL纳米材料，已经证明其具有高效的内在过氧化物酶样活性，在H2O2存在下催化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的氧化并产生蓝色反应。动力学分析表明，符合典型的米氏方程和遵循乒乓机制。基于Imm-Fe3+-IL纳米材料的过氧化物酶活性，可以检测H2O2，其线性范围为1～200μmol/L，最低检测限为0.35μmol/L。当与葡萄糖氧化酶(GOx)偶联时，葡萄糖可以在10～200μmol/L的范围内呈现良好的线性关系，葡萄糖最低检测限为3.31μmol/L。Imm-Fe3+-IL纳米酶用于牛奶中的H2O2检测，可以满足牛奶中H2O2的测定，并且具有较高的准确性和重复性。这些发现意味着Imm-Fe3+-IL纳米酶具有构建低成本和简单的生物传感器的有巨大潜力。
综上所述，本发明具有通过溶胶-凝胶法制备的Imm-Fe3+-IL纳米材料，已经证明其具有高效的内在过氧化物酶样活性，在H2O2存在下催化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的氧化并产生蓝色反应；动力学分析表明，符合典型的米氏方程和遵循乒乓机制；基于Imm-Fe3+-IL纳米材料的过氧化物酶活性，可以检测H2O2，其线性范围为1～200μmol/L，最低检测限为0.35μmol/L；Imm-Fe3+-IL纳米酶当与葡萄糖氧化酶(GOx)偶联时，葡萄糖可以在10～200μmol/L的范围内呈现良好的线性关系，葡萄糖最低检测限为3.31μmol/L；Imm-Fe3+-IL纳米酶用于牛奶中的H2O2检测，可以满足牛奶中H2O2的测定，并且具有较高的准确性和重复性，这些发现意味着Imm-Fe3+-IL纳米材料具有构建低成本和简单的生物传感器的有巨大潜力，可被广泛应用于可产生H2O2的生物分子(如葡萄糖、胆固醇、黄嘌呤、葡萄糖、乳酸、胆碱、丙酮酸和谷氨酸等)的比色法测定中。
附图说明
图1是本发明的Imm-Fe3+-IL纳米酶的制备路线图；
图2是本发明的Imm-IL和Imm-Fe3+-IL的傅里叶转换红外光谱图；
图3是本发明的Imm-Fe3+-IL的扫描电子显微镜的表征(SEM)图；
图4是本发明的不同反应体系溶液的紫外可见吸收图谱，插图为相应的颜色变化照片，其中(a)H2O2+TMB+Imm-Fe3+-IL；(b)TMB+Imm-Fe3+-IL；(c)H2O2+Imm-Fe3+-IL；
图5是本发明的Imm-Fe3+-IL作为过氧化物酶的反应条件pH的优化图；
图6是本发明的Imm-Fe3+-IL作为过氧化物酶的温度的优化图；
图7是本发明的Imm-Fe3+-IL作为过氧化物酶用量(以浓度计)的优化图；
图8是本发明的Imm-Fe3+-IL作为过氧化物酶的H2O2浓度的优化图；
图9是本发明的Imm-Fe3+-IL作为过氧化物酶考察底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺的用量图；
图10是本发明的(A)H2O2浓度1μmol/L和0.1mmol/L与吸光度的剂量-响应曲线图；
图11是本发明的(A)H2O2浓度1μmol/L和0.1mmol/L与吸光度的剂量-(B)同源性校准曲线图；
图12是本发明的Imm-Fe3+-IL与葡萄糖氧化酶(GOx)联用进行葡萄糖比色测定的示意图；
图13是本发明的葡萄糖浓度1μmol/L和0.1mmol/L与吸光度的剂量-响应曲线图；
图14是本发明的葡萄糖浓度1μmol/L和0.1mmol/L与吸光度的剂量-(B)同源性校准曲线；
图15是本发明的(A)与其他糖(对照样品)相比，葡萄糖检测的选择性图；
图16是本发明的(B)Imm-Fe3+-IL的长期储存稳定性(误差棒表示3次试验的标准偏差)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例。Imm-Fe3+-IL纳米酶是这样制备的：将新蒸馏的N-甲基咪唑0.05mol、4mL加入到回流装置的50mL干燥的两口烧瓶中，在搅拌下向烧瓶中缓慢滴加，20min内滴完0.05mol、12mL 3-氯丙基三乙氧基硅烷，在110℃条件下搅拌，用TLC展开剂-V甲醇：V二氯甲烷＝1:1-跟踪反应，反应48h后结束，体系呈淡黄色粘稠液体，将体系冷却至室温，向混合产物中加入3×10mL乙醚洗涤，使其搅拌，然后静置移走上层液体，再在30℃下旋蒸除去乙醚溶剂，最后在60℃下真空干燥6h得到纯的1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑氯鎓盐中间体；
将1.02g的2.8mmol十六烷基三甲基溴化铵、6.15mL的160mmolNH3·H2O和36mLH2O加入到100mL圆底烧瓶中在80℃下搅拌30min，然后向上述溶液中滴加4.16mL的20mmol原硅酸四乙酯和1.13g的1.6mmol1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑氯鎓盐中间体的混合溶液，在80℃下搅拌4h后将温度升高到100℃陈化24h，反应完后，待冷却至室温后，进行过滤用H2O洗涤滤饼，然后在60℃下真空干燥24h，将所得固体下加入150mL乙醇和5mL 37％HCl的溶液中，并将混合物在50℃中搅拌6h除去表面活性剂，然后过滤并用3×20mL乙醇-洗涤，并在60℃下干燥24h，得到白色粉末材料Imm-IL；
将上述制备的Imm-IL0.5g和无水的三氯化铁0.5g，在乙腈中回流24h，最后过滤并洗涤，在真空60℃下干燥6h，得到淡黄色的产物Imm-Fe3+-IL纳米酶。
将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于检测H2O2，在典型的检测和测量中：①将300μLTMB(7.0mmol/L，甲醇溶液)，300μL Imm-Fe3+-IL储备溶液(0.35mg/mL，水分散液)和不同浓度的H2O2溶液(0.001～1mmol/L，水溶液)加入到2mL乙酸盐缓冲液(pH＝3.0，50mmol/L)；②将混合溶液在50℃温育20min；③用紫外分光光度计在652nm处测量所得反应混合物的吸光度。
将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于对未知样品中H2O2检测和测量中：①将300μL TMB(7.0mmol/L)，300μL Imm-Fe3+-IL储备溶液(0.35mg/mL)和不同浓度的H2O2溶液(0.001～1mmol/L)加入到2mL乙酸盐缓冲液(pH＝3.0，50mmol/L)；②将混合溶液在50℃温育20min；③用紫外分光光度计在652nm处测量所得反应混合物的吸光度。通过H2O2溶液标准曲线，可以计算出样品中H2O2的含量。
将Imm-Fe3+-IL纳米酶与葡萄糖氧化酶联用检测葡萄糖，葡萄糖的检测步骤：①将200μL，浓度为1.0mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOx)和1.0mL的不同葡萄糖浓度加入1mL的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.0)中混合并在37℃下温育30min。②将300μL的TMB(4mmol/L)，浓度为0.35mg/mL的Imm-Fe3+-IL纳米酶和2mL的乙酸盐缓冲液中(50mmol/L，pH为3)加入到上述的混合物中并在50℃下温育20min，最后用紫外分光光度计在652nm下测量其混合物的吸光度。
将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于对未知样品中葡萄糖检测和测量中：①将200μL，浓度为1.0mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOx)和1.0mL经过前处理的样品加入1mL的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.0)中混合并在37℃下温育30min。②将300μL的TMB(4mmol/L)，浓度为0.35mg/mL的Imm-Fe3+-IL纳米酶和2mL的乙酸盐缓冲液中(50mmol/L，pH为3)加入到上述的混合物中并在50℃下温育20min，最后用紫外分光光度计在652nm下测量其混合物的吸光度。通过葡萄糖溶液标准曲线，可以计算出样品中葡萄糖的含量。
将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于牛奶中的H2O2检测，包括有以下步骤：①首先通过向牛奶样品中添加1％(v/v)三氯乙酸并超声处理20分钟，去除牛奶样品中的蛋白质。将样品以12000rpm离心10分钟后，将上清液通过0.22μm膜(Whatman)过滤以除去脂质。②将300μL的TMB(4mmol/L)，浓度为0.35mg/mL的Imm-Fe3+-IL纳米酶和2mL的乙酸盐缓冲液中(50mmol/L，pH为3)加入到上述的混合物中并在50℃下温育20min，最后用紫外分光光度计在652nm处测量其混合物的吸光度，通过H2O2溶液标准曲线，可以计算出样品中H2O2的含量。

Claims (13)

1.一种过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：所述Imm-Fe3+-IL纳米酶的结构式为：
Figure FDA0002712816090000011
,
该Imm-Fe3+-IL纳米酶作为过氧化物酶进行使用；
所述Imm-Fe3+-IL纳米酶为硅胶固载1-甲基-3-(3-三乙氧基硅丙基)咪唑-四氯化铁。
2.根据权利要求1所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于比色法检测H2O2。
3.根据权利要求2所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：所述Imm-Fe3+-IL纳米酶在H2O2存在下催化过氧化物酶底物的氧化并产生蓝色反应；所述过氧化物酶底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
4.根据权利要求2所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：所述Imm-Fe3+-IL纳米酶用于检测H2O2，其线性范围为1～200μmol/L，最低检测限为0.35μmol/L。
5.根据权利要求1所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于检测H2O2，包括以下步骤：①将3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、Imm-Fe3+-IL和H2O2溶液加入到乙酸盐缓冲液；②将混合溶液温育；③用紫外分光光度计在652nm处测量所得反应混合物的吸光度。
6.根据权利要求1所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：将Imm-Fe3+-IL纳米酶与葡萄糖氧化酶联用检测葡萄糖。
7.根据权利要求6所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：所述Imm-Fe3+-IL纳米酶与葡萄糖氧化酶联用检测葡萄糖，其线性范围为10～200μmol/L，葡萄糖最低检测限为3.31μmol/L。
8.根据权利要求6所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：所述的是葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化产生葡萄糖醛酸和H2O2，并在Imm-Fe3+-IL纳米酶和H2O2存在下催化氧化过氧化物酶底物成为蓝色产物；所述过氧化物酶底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
9.根据权利要求1所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：将Imm-Fe3+-IL纳米酶与葡萄糖氧化酶联用检测葡萄糖，葡萄糖的检测包括有以下步骤：①将葡萄糖氧化酶和葡萄糖加入磷酸盐缓冲液中混合，温育，得混合物；②将3,3',5,5'-四甲基联苯胺、Imm-Fe3+-IL纳米酶和乙酸盐缓冲液中加入到上述的混合物中，温育，最后用紫外分光光度计在652nm处测量其混合物的吸光度。
10.根据权利要求1所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于牛奶中的H2O2检测。
11.根据权利要求1所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：将Imm-Fe3+-IL纳米酶用于牛奶中的H2O2检测，包括以下步骤：①首先通过向牛奶样品中添加三氯乙酸并超声处理，去除牛奶样品中的蛋白质，离心，将上清液通过膜过滤以除去脂质，得处理后的牛奶样品；②将3,3',5,5'-四甲基联苯胺、Imm-Fe3+-IL纳米酶和乙酸盐缓冲液加入到上述的处理后的牛奶样品中，温育，最后用紫外分光光度计在652nm处测量其混合物的吸光度。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：将Imm-Fe3+-IL纳米酶作为过氧化物酶测定时，样品处理条件是：pH为2～3,温度为40～60℃,Imm-Fe3+-IL纳米酶用量≧0.35mg/mL,3,3',5,5'-四甲基联苯胺用量5～10mM。
13.根据权利要求12所述的过氧化物酶活性Imm-Fe3+-IL纳米酶的应用，其特征在于：将Imm-Fe3+-IL纳米酶作为过氧化物酶测定时，样品处理条件是：pH为3,温度为50℃，Imm-Fe3 +-IL纳米酶用量≧0.35mg/mL,3,3',5,5'-四甲基联苯胺用量7mM。
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