CN110160975A - 一种氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶及其检测葡萄糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶及其检测葡萄糖的方法；通过对Fe3O4纳米模拟酶进行含氮物质尿素修饰合成N‑Fe3O4纳米模拟酶并对其催化活性进行研究；氮元素的引入较其他修饰物可显著提高Fe3O4纳米模拟酶的过氧化物酶活性和催化效率；通过N‑Fe3O4纳米模拟酶的‑NH2与H2O2之间形成稳定的氢键，进而提高与H2O2的亲和力；利用其催化H2O2的特性，结合葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖产生H2O2，建立一种快速检测葡萄糖含量的方法，该方法较现有技术具有更低的检出限，更宽的线性范围以及更好的特异性，为实际样品中葡萄糖含量的测定提供一种更好的方法。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶及其检测葡萄糖的方法。
背景技术
生物酶是具有高度专一性和催化活性的生物大分子，可提高化学反应的效率。大多生物酶是蛋白质，具有稳定性差、难提纯、易失活等缺点，限制其广泛应用，因此开发稳定性好、催化活性高和低成本的具有生物酶催化活性的材料，逐渐成为研究热点。具有模拟酶催化活性的纳米材料，称为纳米模拟酶。2007年，首次报道四氧化三铁(Ferroferricoxide,Fe3O4)磁性纳米颗粒具有辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)活性，此后纳米模拟酶在科研领域的地位和重要性与日俱增。纳米模拟酶的制造成本低，可通过多种途径调控来获得特定的催化效果，因此被广泛应用于生化分析、肿瘤诊断与治疗和环境检测等领域。
Fe3O4纳米模拟酶在酸性条件下显示出类似HRP的活性，但是未经修饰的Fe3O4纳米模拟酶对于底物亲和力仍然较低。为了提高Fe3O4纳米模拟酶的催化效率和选择性，可采用改变尺寸，形态，掺杂和表面修饰等方面。例如使用组氨酸进行修饰，利用组氨酸模拟天然酶的酶促微环境，进而增加底物的亲和能力；利用氧化石墨烯进行修饰，合成石墨烯-Fe3O4复合纳米材料，获得酶活力较高的纳米模拟酶；通过不同处理获得具有较低的Km值的纳米模拟酶，从而进一步提高Fe3O4纳米模拟酶催化活性。为进一步提高Fe3O4纳米模拟酶的过氧化物酶活性和催化效率，快速检测葡萄糖含量，有必要设计一种氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶及其检测葡萄糖的方法。
发明内容
本发明的发明目的在于克服现有技术存在的缺点，提出设计一种氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶及其检测葡萄糖的方法，利用含氮化合物尿素对Fe3O4纳米模拟酶进行修饰，获得氮修饰Fe3O4(NitrogendopedFe3O4，N-Fe3O4)纳米模拟酶，并利用Fe3O4纳米模拟酶构建一种简单、廉价和选择性高的比色分析新方法，实现样品中葡萄糖含量的测定。
本发明涉及的氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶的制备工艺包括以下步骤：
(1)按重量组分称取六水合三氯化铁、尿素、聚乙二醇和乙二醇；六水合三氯化铁、尿素、聚乙二醇加入乙二醇中，搅拌拌均匀，然后加入到水热合成反应釜中，置于200-260℃干燥箱中反应5-24h；
(2)然后将步骤(1)反应后的产物转移到盛有无水乙醇溶液的烧杯中，利用超声在无水乙醇溶液中将合成的颗粒进行分散，时间为6min，然后进行磁分离，弃去上清液；
(3)再用去离子水将步骤(2)中弃去上清液的产物清洗3次，并用去离子水重新分散后保存，即得不同修饰物不同浓度的Fe3O4纳米模拟酶。
本发明所述的氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶的各重量组分为：六水合三氯化铁2-4份、乙二醇85-90份、聚乙二醇1.5-3.0份、尿素1.0-4.0份、无水乙醇90-120份。
一种氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶检测葡萄糖的方法，其步骤工艺为：
(1)预处理：将葡萄糖溶液通过离心、超滤的方法进行预处理；
(2)稀释：利用pH为3.0-4.5缓冲体系稀释预处理后的葡萄糖溶液至所需浓度备用；
(3)水浴：取经步骤(2)稀释后的溶液50μL，并加入10mLpH为7.0的磷酸盐缓冲液中，加入5μL40mg/mL葡萄糖氧化酶，37℃水浴20-60分钟，得反应液；
(4)测定：取30μL反应液于2.4mLpH为3.0-4.5缓冲体系中，然后依次加入120μL浓度为10mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)、240μL浓度为2mg/mLN-Fe3O4的纳米模拟酶，混匀，30-50℃水浴20min，待反应结束后于652nm波长处测定吸光度值。
本发明所述的步骤(2)中稀释后的葡萄糖溶液的浓度为5×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3、5×10-3和1×10-2mol/L。
本发明所述的缓冲体系为醋酸盐缓冲体系(例如醋酸钠缓冲液)、碳酸盐缓冲体系(例如碳酸钠缓冲体系)和磷酸盐缓冲体系(例如磷酸盐缓冲体系)；所述的磷酸盐缓冲液为磷酸钠缓冲液。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明通过对Fe3O4纳米模拟酶进行含氮物质尿素修饰合成N-Fe3O4纳米模拟酶并对其催化活性进行研究；氮元素的引入较其他修饰物可显著提高Fe3O4纳米模拟酶的过氧化物酶活性和催化效率；通过N-Fe3O4纳米模拟酶的-NH2与H2O2之间形成稳定的氢键，进而提高与H2O2的亲和力；利用其催化H2O2的特性，结合葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖产生H2O2，建立一种快速检测葡萄糖含量的方法，该方法较现有技术具有更低的检出限，更宽的线性范围以及更好的特异性，为实际样品中葡萄糖含量的测定提供一种更好的方法。
附图说明
图1为本发明修饰物对N-Fe3O4催化活性的影响图；
图2为本发明合成时间对N-Fe3O4催化活性的影响图；
图3为本发明合成温度对N-Fe3O4催化活性的影响图；
图4为本发明尿素添加量对N-Fe3O4催化活性的影响图；
图5为本发明N-Fe3O4纳米模拟酶的TEM图(标尺：1.00μM)图；
图6为本发明缓冲体系对N-Fe3O4催化反应的影响图；
图7为本发明pH对N-Fe3O4催化反应的影响图；
图8为本发明温度对N-Fe3O4催化反应的影响图；
图9为本发明pH处理对N-Fe3O4催化活性的影响图；
图10为本发明温度处理对N-Fe3O4催化活性的影响图；
图11为本发明N-Fe3O4纳米酶催化TMB的表观酶促动力学曲线图；
图12为本发明N-Fe3O4纳米酶催化H2O2的表观酶促动力学曲线图；
图13为本发明H2O2标准曲线图；
图14为本发明葡萄糖标准曲线图；
图15为本发明特异性比较图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例涉及的氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶的制备工艺包括以下步骤：
(1)按重量组分称取六水合三氯化铁、尿素、聚乙二醇和乙二醇；六水合三氯化铁、尿素、聚乙二醇加入乙二醇中，搅拌拌均匀，然后加入到水热合成反应釜中，置于240℃干燥箱中反应16h；
(2)然后将步骤(1)反应后的产物转移到盛有无水乙醇溶液的烧杯中，利用超声在无水乙醇溶液中将合成的颗粒进行分散，时间为6min，然后进行磁分离，弃去上清液；
(3)再用去离子水将步骤(2)中弃去上清液的产物清洗3次，并用去离子水重新分散后保存，即得不同修饰物不同浓度的Fe3O4纳米模拟酶。
本实施例所述的氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶的各重量组分为：六水合三氯化铁2.7份、乙二醇88份、聚乙二醇2.0份、尿素2.0份、无水乙醇100份。
本实施例所述的六水合三氯化铁、乙二醇、聚乙二醇、尿素、无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司。
首先对Fe3O4纳米模拟酶表面修饰物进行选择与优化，分别选用壳聚糖、尿素以及氧化石墨烯对Fe3O4纳米模拟酶进行修饰，然后测定其酶活，实验结果如图1所示。发现对Fe3O4表面进行修饰将大大提高Fe3O4的催化活性，其中利用尿素进行修饰后所得到的Fe3O4纳米模拟酶催化活性最高。原因是由于部分的尿素在加热的条件下能够水解释放出NH3，促进Fe3+沉积，使生成的Fe3O4纳米模拟酶表面含有更多的Fe3+从而提高酶的活性。
对Fe3O4纳米模拟酶合成时间进行优化，分别采用4h、8h、12h、16h和24h的干燥箱中合成时间。结果如图2所示，反应时间为4h无法成功合成需要的Fe3O4纳米模拟酶，从8h到16h所制得的纳米酶的酶活随着反应时间的增加而增大，大于16h时，酶活变化不大，所以选择16h为最佳合成时间。此时Fe3O4纳米模拟酶具有更高的酶活。纳米模拟酶的合成时间会影响其粒径的大小，其催化活性受尺寸、形态等诸多因素的影响，研究表明相同单位质量的纳米酶，在一定范围内粒径越小催化活性越高，这是纳米酶催化活性可调节的主要因素，较短合成时间得到的纳米模拟酶粒径小，粒径越小比表面积越大，催化活性越高。
对Fe3O4纳米模拟酶合成温度的优化，分别以180℃、200℃、220℃、240℃、260℃为反应温度进行Fe3O4纳米模拟酶的合成，实验结果如图3表示。180℃的温度无法合成所需要的Fe3O4纳米酶溶液，而大于200℃可以合成。随着温度的升高，Fe3O4纳米模拟酶的酶活变化不大，所以最终选择200℃作为合成温度。
对Fe3O4纳米模拟酶合成过程中尿素添加量进行优化，分别加入0.25g、0.5g、1g、2g以及4g尿素，测定其酶活，实验结果如图4所示，在小于2g时，酶活会随着尿素添加量的增加而上升，当添加量大于2g后，对于酶活的影响不大，所以考虑到合成检测方法的成本，本实验最终选用2mg/mL的尿素添加量进行Fe3O4纳米模拟酶的合成。
对优化后所制备的Fe3O4纳米模拟酶进行了透射电镜表征，图5为微粒的透射电子显微镜(TEM)图，所制备的Fe3O4纳米模拟酶微粒分布均匀，为圆形纳米颗粒，粒径分布在196-202nm。
实施例2：
一种氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶检测葡萄糖的方法，其步骤工艺为：
(1)预处理：配制100mL葡萄糖储备溶液，将葡萄糖溶液通过离心、超滤的方法进行预处理；
(2)稀释：利用pH为4.0醋酸盐缓冲体系稀释预处理后的葡萄糖溶液至5×10-4mol/L；
(3)水浴：取经步骤(2)稀释后的葡萄糖溶液50μL，并加入10mLpH为7.0的磷酸盐缓冲液中，加入5μL40mg/mL葡萄糖氧化酶，37℃水浴30分钟，得反应液；
(4)测定：取30μL反应液于2.4mLpH为4.0醋酸盐缓冲体系中，然后依次加入120μL浓度为10mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)、240μL浓度为2mg/mLN-Fe3O4的纳米模拟酶，混匀，45℃水浴20min，待反应结束后于652nm波长处测定吸光度值。
本实施例所述的缓冲体系为醋酸盐缓冲体系(例如醋酸钠缓冲液)、碳酸盐缓冲体系(例如碳酸钠缓冲体系)和磷酸盐缓冲体系(例如磷酸盐缓冲体系)；所述的磷酸盐缓冲液为磷酸钠缓冲液。
本实施例所述的离心、超滤方法均为常规技术，本发明不再赘述；所述的TMB购于Sigma-Aldrich试剂公司。
缓冲体系对N-Fe3O4纳米模拟酶活性的影响：选用常用醋酸盐缓冲体系(例如醋酸钠缓冲液)、碳酸盐缓冲体系(例如碳酸钠缓冲体系)和磷酸盐缓冲体系(例如磷酸盐缓冲体系)，并用水作对比，如图6所示，我们发现碳酸盐缓冲体对N-Fe3O4纳米模拟酶活性有微弱抑制作用，而醋酸盐缓冲体系和磷酸盐缓冲体系皆有促进的作用，其中醋酸盐缓冲体系促进作用较好，由于不同缓冲体系中所含离子成分及浓度不同，不同的离子对于N-Fe3O4纳米模拟酶活性会具有不同程度分的促进或抑制的作用，原因是由于醋酸盐提供了一定的离子环境和合适的pH值，有助于N-Fe3O4纳米模拟酶利用表面存在的Fe2+和Fe3+，通过反应催化H2O2产生氧自由基，提高其催化活性。
pH对N-Fe3O4纳米模拟酶活性的影响：评价pH对N-Fe3O4纳米模拟酶活性的影响，如图7所示。N-Fe3O4纳米模拟酶在pH3.5-4.5均保持较高的催化活性，随着pH的变化，其催化活性呈现先增高后降低的趋势，pH小于4时，N-Fe3O4纳米模拟酶与底物亲和力随着pH的升高而增强；而当pH大于4时，N-Fe3O4纳米模拟酶与底物亲和力又逐渐降低，在4.0时，吸光度值达到最大，综合考虑，选择4.0作为该体系的最适反应pH。
温度对N-Fe3O4纳米模拟酶活性的影响：评价温度对N-Fe3O4纳米模拟酶活性的影响，实验结果如图8所示，N-Fe3O4纳米模拟酶活性随温度变化呈现先增大后减小的趋势，温度低于45℃时，其酶活随着温度的升高而升高，当温度超过45℃后，开始有明显下降。从实验结果可知，在45℃时，其吸光度值达到最大，综合考虑，选择45℃作为该体系的反应温度。
稳定性的探究：N-Fe3O4纳米模拟酶作为无机金属氧化物过氧化物模拟酶，在极端条件下仍然可以保持较高的活性。而传统的辣根过氧化物酶HRP是一种天然酶，其催化性能容易受到外界环境影响，在高温、强酸或强碱条件下非常容易失活。为了验证N-Fe3O4纳米模拟酶对环境变化的稳定性，首先将N-Fe3O4纳米模拟酶在不同pH的缓冲液以及不同温度中处理2h，然后在最佳反应条件下检测其催化性能从而评价其稳定性。以原始的N-Fe3O4纳米模拟酶的反应活性为100％，结果如图9、10所示，我们发现温度和pH对N-Fe3O4纳米模拟酶的影响较小，其催化性能变化不大。同时，通过图9可知在pH4和pH8的时候N-Fe3O4纳米模拟酶稳定性较好，而通过图10可知在60℃最其催化性能最为稳定；但HRP在酸性pH、极碱pH或温度超过50℃后，活性丧失很快。这说明N-Fe3O4纳米模拟酶稳定性明显高于HRP，这种性质特点使N-Fe3O4纳米模拟酶在生物化学检测、医学诊断等领域有着更广阔的应用前景。
Fe3O4纳米模拟酶的催化动力学机理与HRP相似：利用表面存在的Fe2+和Fe3+，通过类反应催化H2O2产生氧自由基。利用尿素修饰的N-Fe3O4纳米模拟酶的表面含有大量的铁离子和亚铁离子，表面Fe2+/Fe3+之间的转换是保证纳米酶高效催化的关键。为确定N-Fe3O4纳米模拟酶的催化活性，在最适条件下对N-Fe3O4纳米模拟酶的稳态动力学参数进行测定。在特定的底物浓度范围内，酶催化反应遵循典型的Michaelis-Menten动力学模式(图11)。使用Michaelis-Menten方程：V＝Vmax×[S]/(Km+[S])可计算出酶催化反应的表观动力学常数:最大初始反应速率(Vmax)和米氏常数(Km)(见表1)。分析发现，N-Fe3O4纳米模拟酶Km值为11.30±2.86mM，明显低于未经修饰的Fe3O4纳米模拟酶和组氨酸修饰后的Fe3O4纳米模拟酶(见表1)。上述结果表明经过氮修饰后的N-Fe3O4纳米模拟酶与底物亲和力较之前所有的方法有一定的提高，比Fe3O4纳米模拟酶降低将近40倍，比组氨酸修饰的降低3.4倍。Km值越小，说明酶对底物的亲和性越高，即N-Fe3O4纳米模拟酶可以显着增加对其底物H2O2的亲和力，进而提高催化效率。由于在合成过程中加入尿素，N-Fe3O4纳米模拟酶的表面形成氨基，可与H2O2之间形成的更稳定的氢键，增强其在N-Fe3O4纳米模拟酶上的吸附从而更好的提高酶活。利用公式：Kcat＝Vmax/[S]对Kcat值进行计算，N-Fe3O4纳米模拟酶Kcat值高于最大未经修饰的Fe3O4纳米模拟酶和组氨酸修饰后的Fe3O4纳米模拟酶，具有良好的催化效率。
另外考察以TMB为底物的稳态动力学参数结果如图12所示，N-Fe3O4纳米模拟酶的Km＝883.26±18.3mM(见表2)，明显低于HRP对于TMB的亲和力，说明N-Fe3O4纳米模拟酶与TMB亲和力更好，而其Kcat值明显高于HRP，也可以说明其具有较强的催化效率。这种现象可能与纳米材料表面的物理和化学性质有关，纳米材料具有较大的比表面积，同时其表面电荷较为丰富，容易吸附带正电的TMB，从而有较高的亲和力。上述结果说明经过氮掺杂修饰后的N-Fe3O4纳米模拟酶能够提高其与底物TMB的亲和能力及催化效率。
表1以H2O2作为底物的稳态动力学参数
表2以TMB作为底物的稳态动力学参数
方法灵敏度检测：N-Fe3O4纳米模拟酶在最适的H2O2浓度范围内有较好的催化能力，而不同的H2O2浓度对应着不同的葡萄糖含量，因此可以用以上的方法检测H2O2的含量从而间接计算出葡萄糖的含量。在40℃，pH4.0醋酸盐缓冲液下，测定H2O2标准曲线，结果如图13所示，该方法H2O2线性范围为8-40μM，在此范围内表现出良好线性。
配制100mL葡萄糖储备液：用2mL移液管准确吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0于10mL容量瓶定容，得到2～20mM的葡萄糖标准溶液；取不同浓度葡萄糖标准溶液50μL于磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，加入5μL40mg/mL葡萄糖氧化酶，37℃水浴30分钟；取30μL反应液于2.4mL醋酸盐缓冲体系(pH4.5)中，依次加入240μL2mg/mLN-Fe3O4纳米模拟酶，120μL10mg/mLTMB混匀，45℃水浴20min，652nm处测定吸光度值。
利用葡萄糖氧化酶与N-Fe3O4纳米模拟酶进行双酶偶联反应，可实现葡萄糖的检测。由于葡萄糖氧化酶最适反应pH为7.0，最适反应温度为37℃，而N-Fe3O4纳米模拟酶最适反应pH为4.0，最适反应温度为40℃，所以葡萄糖的检测分两步进行:(1)葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下，37℃，pH7.0反应30分钟，产生H2O2；(2)利用N-Fe3O4纳米模拟酶在pH4.0和40℃下检测产生的H2O2。图14显示吸光度(652nm)对葡萄糖浓度的线性响应(R＝0.9939)，此检测葡萄糖的检测线性范围为0—20mM。
方法特异性检测：分别配置5mM葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖标准溶液，取50μL于磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，加入5μL40mg/mL葡萄糖氧化酶，37℃水浴30min取30μL反应液于2.4mL醋酸盐缓冲体系(pH4.5)中，加入240μL2mg/mLN-Fe3O4纳米模拟酶，120μL10mg/mLTMB混匀，45℃水浴20min，652nm处测定吸光度值；利用果糖，乳糖和蔗糖测定所建立方法的特异性，结果如图15所示，由于葡萄糖氧化酶的使用，对葡萄糖有较高的亲和力，只可催化葡萄糖产生过氧化氢和葡萄糖酸，所以当对照样品浓度高达5mM时，没有获得可检测的信号。因此，利用双酶偶联的方法进行葡萄糖含量的测定，显示出较高特异性。
加标回收率检测：据建立的方法，对四种不同来源的蜂蜜及实验小鼠血液中的葡萄糖浓度进行检测，检测结果如下表所示。测定结果表明，小鼠血液中的葡萄糖浓度为15.75mM，四种蜂蜜中的葡萄糖含量分别为21％、25％、19％、20％。加标回收率在96％-106％之间，符合实际样品检测要求[28]。测定结果与国标法HPLC测得结果基本一致，因此，本实验中建立的方法可进行实际样品中葡萄糖含量的检测。
表3加样回收率测定结果
本发明通过探讨N-Fe3O4纳米模拟酶的过氧化物酶特性，对其反应条件进行优化，并利用Lineweaver-Burk公式研究其对底物H2O2和TMB的亲和能力，并与HRP及其它同类模拟酶进行比较分析。利用N-Fe3O4纳米模拟酶的过氧化物模拟酶催化活性，快速催化H2O2氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB)显色的原理，结合葡萄糖氧化酶，实现对H2O2和葡萄糖含量的测定，评价方法的灵敏度和特异性，并在实际样品中进行应用，相关结果将为拓宽纳米模拟酶在生化分析中的应用奠定基础。
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。
Claims (5)
1.一种氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶，其特征在于：各重量组分为：六水合三氯化铁2-4份、乙二醇85-90份、聚乙二醇1.5-3.0份、尿素1.0-4.0份、无水乙醇90-120份。
2.根据权利要求1所述的氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶，其特征在于：制备工艺包括以下步骤：
（1）按重量组分称取六水合三氯化铁、尿素、聚乙二醇和乙二醇；六水合三氯化铁、尿素、聚乙二醇加入乙二醇中，搅拌拌均匀，然后加入到水热合成反应釜中，置于200-260 ℃干燥箱中反应5-24 h；
（2）然后将步骤（1）反应后的产物转移到盛有无水乙醇溶液的烧杯中，利用超声在无水乙醇溶液中将合成的颗粒进行分散，时间为6 min，然后进行磁分离，弃去上清液；
（3）再用去离子水将步骤（2）中弃去上清液的产物清洗3次，并用去离子水重新分散后保存，即得不同修饰物不同浓度的Fe3O4纳米模拟酶。
3.一种氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶检测葡萄糖的方法，其特征在于：其步骤工艺为：
（1）预处理：将葡萄糖溶液通过离心、超滤的方法进行预处理；
（2）稀释：利用pH为 3.0-4.5缓冲体系稀释预处理后的葡萄糖溶液至所需浓度备用；
（3）水浴：取经步骤（2）稀释后的溶液50 μL，并加入10 mL pH 为7.0的磷酸盐缓冲液中，加入5 μL40 mg/mL葡萄糖氧化酶，37 ℃水浴20-60分钟，得反应液；
（4）测定：取30 μL反应液于2.4 mL pH为 3.0-4.5缓冲体系中，然后依次加入120 μL浓度为10 mg/mL的四甲基联苯胺（TMB）、240μL浓度为2 mg/mLN- Fe3O4的纳米模拟酶，混匀，30-50 ℃水浴20 min，待反应结束后于652 nm波长处测定吸光度值。
4.根据权利要求3所述的氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶检测葡萄糖的方法，其特征在于：所述的步骤（2）中稀释后的葡萄糖溶液的浓度为5 ×10-5、1×10-4、5×10-4、1×10-3、5×10-3和1×10-2mol/L。
5.根据权利要求3所述的氮掺杂四氧化三铁过氧化物模拟酶检测葡萄糖的方法，其特征在于：所述的缓冲体系为醋酸盐缓冲体系、碳酸盐缓冲体系和磷酸盐缓冲体系；所述的磷酸盐缓冲液为磷酸钠缓冲液。
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