CN111426647B - 用于葡萄糖比色法检测的钒酸锌微球的水热合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可用于葡萄糖比色法检测的Zn3V3O8微球的水热合成方法，其是分别以Zn(CH3COO)2·2H2O和Na3VO4·12H2O为锌源、钒源，通过添加CTAB、甘氨酸、硫酸钠作为表面活性剂，利用碳酸铵调节pH值，经高温水热反应得到微球状Zn3V3O8。本发明所得微球状Zn3V3O8具有分散性好、催化性高、稳定性佳等优点，并具有过氧化物酶活性，可用于葡萄糖的可视化比色法检测，对葡萄糖的检出限高达9.33×10‑7 M，且具有较宽的线性范围。
Description
技术领域
本发明属于纳米功能材料制备领域，具体涉及一种用于比色法检测葡萄糖模拟酶的Zn3V3O8微球的水热合成方法。
背景技术
天然酶催化的高效性和专一性使其广泛应用于生物传感与疾病治疗，然而天然酶大多数为超分子结构的蛋白质，导致天然酶自身的成本高、稳定性低、难以保存，极大程度上限制了天然酶的应用与发展。模拟酶是一种由人工合成的催化剂，不仅弥补了天然酶的劣势，而且在保持天然酶专一性的同时，还具有高效的催化活性。因此，通过研究天然酶的结构及活性中心，设计具有相似活性的人工模拟酶，成为了研究人员的努力方向。近年来，纳米材料已受到了研究者们广泛关注，其自身由于尺寸小、比表面积大、表面活化中心多，而成为了天然酶的候选者。
目前，已经发现的模拟酶种类达上百种，如碳基、铁基化合物、贵金属基等纳米材料。这些纳米材料克服了天然酶价格高、不易保存等缺点，已经被成功应用在了医疗诊断、食品检测、免疫分析等方面。其中，钒基化合物因其独特的结构和性质，得到研究者们广泛的重视，然而其应用大多局限于光电领域，在生化分析领域的应用较少。Zn3V3O8作为众多钒酸盐中的一种，迄今主要的合成手段为，先合成前驱体，再经过高温煅烧得到Zn3V3O8纳米颗粒，其存在工艺流程复杂、反应温度过高、毒性大等问题。因此寻找新的、便捷的方法来合成Zn3V3O8，有助于开拓其新的应用领域。
糖尿病是当前威胁人类健康的四大疾病之一，根据IDF(The InternationalDiabetes Federation国际糖尿病联盟）统计，全世界糖尿病患者已达4.2亿左右。糖尿病会伴随着患者终身，目前尚无法彻底根治，且在治疗过程中，需要对患者血糖定期检测，以方便医生对患者的起居、饮食及医药提供指导。然而，目前商业化的血糖检测仪操作复杂，且具有一定误差。比色法具有操作简便、时效短等优点，受到研究者们的高度关注，尤其是近年来模拟酶已经应用于各种生化物质的比色检测。因此，发展方便、高灵敏度的比色法葡萄糖检测方法具有实际意义。
发明内容
本发明针对现有技术制备Zn3V3O8微球存在的合成方法复杂、需要经高温煅烧等缺点，提供一种水热合成Zn3V3O8微球的方法。该方法制得的Zn3V3O8微球具有较高的比表面积，并具有过氧化物酶活性，能够实现葡萄糖的可视化比色法检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种水热法合成Zn3V3O8微球的方法，其包括以下步骤：
1）分别称取0.4g Zn(CH3COO)2·2H2O、0.4g无水Na2SO4、0.4g甘氨酸、1g十六烷基三甲基溴化铵，混合加入到60mL去离子水中，室温下搅拌30min，使其形成溶液A；再称取0.42gNa3VO4·12H2O和0.42g碳酸铵，将两者混合加入到6mL去离子水中，室温下搅拌30min，使其形成溶液B；
2）将步骤1）得到的溶液B缓慢滴加到溶液A中，搅拌30min，得到的混合溶液放置在反应釜中，180℃高温反应24h；
3）反应结束后冷却至室温，离心，去除上层清液，沉淀物用去离子水和乙醇分别洗涤3~5次，经再次离心后，收集粉末，置于干燥箱中，在一定温度下干燥，制得所述Zn3V3O8微球。
步骤1）、2）中所述搅拌的转速为600 r/min。
步骤3）中所述离心的转速为8000 r/min，时间为10min。
步骤3）中所述干燥的温度为60℃，时间为12 h。
上述方法制得的Zn3V3O8微球具有过氧化物酶活性，可应用于葡萄糖的可视化检测。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供了一种Zn3V3O8微球的水热合成方法，其是分别以Zn(CH3COO)2·2H2O和Na3VO4·12H2O为锌源和钒源，通过添加十六烷基三甲基溴化铵、甘氨酸、硫酸钠作为表面活性剂，利用碳酸铵调节pH值，在水热条件下合成了微球状的Zn3V3O8；该合成方法简单、反应条件温和、原料易得、价格低廉，具有较高的实用价值；
（2）本发明采用水热合成方法，通过控制反应温度和时间，可以制备微球状的Zn3V3O8，其具有更多的活性位点，能更好地与反应底物接触，并可利用表面多价态锌、钒离子的协同催化作用，更高效地催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB），而显蓝色；
（3）通过催化氧化实验表明，本发明制备的Zn3V3O8微球能够催化过氧化氢氧化TMB，通过测量米氏常数，评价Zn3V3O8与反应底物的亲和性，并推测其反应机理。
（4）本发明所得Zn3V3O8微球具有过氧化物酶活性，将其应用于葡萄糖的可视化比色检测，具有较低的检出限和较宽的检测范围。
附图说明
图1为实施例所制备Zn3V3O8微球的XRD谱图，其中(a)为Zn3V3O8微球，(b)为尖晶石Zn3V3O8的XRD标准卡片(JCPDS-31-1477)；
图2为实施例所制备Zn3V3O8微球的扫描电镜图；
图3为Zn3V3O8微球可视化检测葡萄糖试验中各处理组的紫外可见吸收光谱图；
图4为Zn3V3O8微球可视化检测葡萄糖各样品的颜色变化情况图；
图5为Zn3V3O8微球催化H2O2氧化TMB的条件优化，其中（a）为温度；（b）为H2O2浓度；（c）为反应时间；
图6为Zn3V3O8微球与底物H2O2和TMB的米氏常数的测量图，其中（a）为固定H2O2浓度而改变TMB浓度。（b）为固定TMB浓度而改变H2O2浓度。
图7为Zn3V3O8微球催化H2O2氧化TMB的紫外可见吸收光谱图（a）和吸光度值与葡萄糖浓度的线性关系（b）；
图8为Zn3V3O8微球与葡萄糖浓度的颜色变化情况图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例
一种可用于葡萄糖比色法检测的Zn3V3O8微球的水热合成方法，其包括以下步骤：
1）分别称取0.4g Zn(CH3COO)2·2H2O、0.4g无水Na2SO4、0.4g甘氨酸、1g十六烷基三甲基溴化铵，混合加入到60mL去离子水中，室温下600 r/min搅拌30min，形成溶液A；再称取0.42g Na3VO4·12H2O和0.42g碳酸铵，将两者混合加入到6mL去离子水中，室温下600 r/min搅拌30min，形成溶液B；
2）将步骤1）得到的溶液B缓慢滴加到溶液A中，600 r/min搅拌30min，使其充分混合，将得到的混合溶液放置在反应釜中，在180℃条件下反应24h；
3）反应结束后冷却至室温，8000 r/min离心10min，去除上层清液，沉淀物用去离子水和乙醇分别洗涤3~5次，经再次8000 r/min离心10min后，收集粉末，置于干燥箱中，在60℃条件下干燥12 h，制得所述Zn3V3O8微球。
一、Zn3V3O8微球的表征
（1）采用XRD和扫描电子显微镜对合成的Zn3V3O8进行表征
图1为所制备Zn3V3O8微球的XRD谱图。由XRD谱图可以看出，其35.5°、37.1°、56.9°和62.5°处衍射峰，分别对应于Zn3V3O8尖晶石结构（JCPDS-31-1477标准卡片）中的（220）、（311）、（511）和（440）晶面，未出现其他的峰，表明所合成的产物为纯的Zn3V3O8微粒。图2为水热合成Zn3V3O8微球的扫描电镜图。
图2为所制备Zn3V3O8微球的扫描电镜图。由图中可以看出，制备出的Zn3V3O8十分均匀，为球状结构，其直径约为2μm，表面较为粗糙。
二、Zn3V3O8微球可视化检测葡萄糖
称取1.5mg制备的Zn3V3O8微球，分散于1ml蒸馏水中，超声10min得到充分分散的Zn3V3O8溶液。取3个干净的比色瓶，分别加入不同的溶液构成对比试验：（1）50μl TMB（4mM）、50μl H2O2（5mM）和50μl 1.5mg/ml的Zn3V3O8分散溶液。（2）50μl TMB（4mM）和50μl H2O2（5mM）（3）50μl TMB（4mM）和50μl 1.5mg/ml的Zn3V3O8分散溶液。最后向三个比色瓶中加入pH=4的NaAc-HAc至1ml，在30℃的环境下反应15min。最后用紫外分光光度计记录波长652nm处的吸光度。
图3、图4分别为各处理组的紫外可见吸收光谱图及样品颜色变化情况图。由图3和图4可见，Zn3V3O8+TMB或是H2O2+TMB反应无明显现象，而Zn3V3O8+H2O2+TMB时，溶液在652nm处有吸收，且溶液呈蓝色，证明Zn3V3O8可催化H2O2产生·OH进而氧化TMB。
为了进一步提高反应的灵敏度，进行了反应条件的优化，结果如图5，其中（a）为温度；（b）为H2O2浓度；（c）为反应时间。由图5可见，反应温度为30℃、H2O2浓度为5mM时反应效果最好，反应在15min后吸光度值增加缓慢，故选用15min为最佳反应时间。
图6的（a）、（b）分别为固定的TMB（H2O2）和H2O2（TMB）的双倒数图，通过图中参数导出了TMB的米氏常数（Km）和酶促反应速度最大值（Vmax）分别为0.2894mM和9.225×10-8Ms-1，而H2O2的Km和Vmax分别为5.132mM和11.16×10-8Ms-1。而图中平行线展现出了乒乓机制的特点，表明Zn3V3O8先和第一底物H2O2反应释放反应物，然后再和第二底物TMB反应。
进一步利用上述机理实现葡萄糖的检测：取5mg/ml的葡萄糖氧化酶10μl与100μl梯度浓度（10~500μM）的葡萄糖溶液混合，并在37℃孕育1h，随后将50μl TMB（4mM）和50μl1.5mg/ml的Zn3V3O8分散溶液加入孕育后的溶液，并加入pH=4的NaAc-HAc缓冲溶液至1ml，将混合溶液置于30℃的环境下反应15min，最后用紫外分光光度计记录波长652nm处的吸光度。
图7为Zn3V3O8微球催化H2O2氧化TMB的紫外可见吸收光谱图（a）和吸光度值与葡萄糖浓度的线性关系（b）。图8为Zn3V3O8微球与葡萄糖浓度的颜色变化情况图。如图7和图8所示，随着葡萄糖浓度的增加，波长为652nm处的吸光度值在持续增加，颜色也在加深。检测结果表明，葡萄糖浓度在10-500 μM范围内可与652nm处的吸光度值呈现良好的线性关系，其相关系数R2=0.993，响应方程为A=1.318C +0.02938（mM），检出限达9.33×10-7 M（S/N=3）。由结果可知，Zn3V3O8微球能够有效的应用于葡萄糖的可视化比色检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种用于葡萄糖比色法检测的Zn3V3O8微球的水热合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）分别称取Zn(CH3COO)2·2H2O、无水Na2SO4、甘氨酸、十六烷基三甲基溴化铵，混合加入到去离子水中，室温下搅拌30min，使其形成溶液A；再称取Na3VO4·12H2O和碳酸铵，将两者混合加入到去离子水中，室温下搅拌30min，使其形成溶液B；
2）将步骤1）得到的溶液B按体积比1:10缓慢滴加到溶液A中，搅拌30min，得到的混合溶液放置在反应釜中进行高温反应；
3）反应结束后冷却至室温，离心去除上层清液，沉淀物用去离子水和乙醇分别洗涤3~5次，经再次离心后，在一定温度下干燥，制得所述Zn3V3O8微球；
步骤1）所述溶液A中Zn(CH3COO)2·2H2O、无水Na2SO4、甘氨酸、十六烷基三甲基溴化铵的浓度分别为0.4g/60mL、0.4g/60mL、0.4g/60mL、1g/60mL；所述溶液B中Na3VO4·12H2O和碳酸铵的浓度均为0.07g/mL。
2.根据权利要求1所述的Zn3V3O8微球的水热合成方法，其特征在于：步骤2）中所述高温反应的温度为180℃，时间为24h。
3.一种如权利要求1~2中任一项所述方法制得的Zn3V3O8微球。
4.一种如权利要求3所述Zn3V3O8微球在葡萄糖比色法可视化检测中的应用。
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