CN112337495A - 过氧化物模拟酶、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及过氧化物模拟酶、其制备方法及用途。本发明采用将碱木质素胺化、炭化以及掺铁的方法构建了一种过氧化物模拟酶，该方法操作简单，原料丰富，制备周期短，且成本低。所构建的过氧化物模拟酶可用于过氧化氢及葡萄糖的检测。

Description

过氧化物模拟酶、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于化工领域，具体涉及一种过氧化物模拟酶、其制备方法及用途。

背景技术

木质素是世界上含量最丰富的芳香族高分子化合物，占植物体总质量的20％-30％，并且是由苯基-丙烷类单体通过烷基-烷基、烷基-芳基、芳基-芳基等化学键连接起来的天然两亲性聚合物，具有绿色、环保、易降解等特点。据报道，只有5％的工业木质素用于表面活性剂、减水剂、防垢剂、分散剂等低附加值应用，其他则用于燃烧以提供热能，造成环境污染的同时也浪费了资源。碱木质素主要来自于碱法纸浆，因为其分子中醛基、酮基附近的氢原子比较活泼，可以在胺化改性之后进行进一步的应用。但胺化改性后的木质素目前仅用于制备吸附剂、界面改性剂等，其在生物、医药等领域的进一步应用有待探索。

酶主要由蛋白质组成，作为天然的催化物质，具有高效、专一、温和的催化特点，其提取、运输、保存困难且催化条件有限的局限性推动了人工酶这一类新兴材料的出现和发展。人工酶旨在利用人工合成的化学材料替代天然酶，在起到天然酶的催化效果的同时力求降低成本、绿色环保、可再生，并实现催化更严苛条件下的反应。过氧化物模拟酶作为人工酶中被研究最多的种类，被广泛用于替代天然过氧化物酶，在生物医疗、环境监测领域中实现过氧化物的催化反应。

过氧化氢是应用最多的过氧化物，其在过氧化物酶催化下分解并产生的氢氧自由基(·OH)能使无色的3,3’,5’,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5’,5’-Tetramethylbenzidine,TMB)、二氨基联苯胺(Diami-nobenzidine,DAB)等底物失去质子，被氧化而显色，在特定波长下出现高吸光度。以一定浓度系列的过氧化氢和其分解氧化的显色底物在特定波长下的吸光度建立标准曲线，就得到了检测过氧化氢浓度的方法。

葡萄糖作为人体内的重要代谢物质，在人体健康及食品工业中起着重要作用。通过葡萄糖氧化酶-过氧化物酶的连级反应，即葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸及过氧化氢，过氧化氢进一步被过氧化物酶催化分解，结合运用显色底物，用上述的标准曲线分析方法即可进一步检测葡萄糖浓度。

人们通过构建活性中心、模拟天然辣根过氧化物酶的化学结构来合理设计过氧化物模拟酶。目前已有用金属氧化物(CN109499616A)、贵重金属、石墨烯等为基体构建过氧化物模拟酶，但以天然大分子(纤维素、壳聚糖等)为基体设计的过氧化物模拟酶依然很少，以木质素为基体制备过氧化物模拟酶的研究目前尚无报道。

发明内容

本发明的一个技术目的是提供过氧化物模拟酶的制备方法及由其制备的过氧化物模拟酶，该方法成本低廉，且可以减少造纸废液带来的污染、实现自然资源的高值化利用。

本发明的另一技术目的是提供所述过氧化物模拟酶在制备用于检测过氧化氢及葡萄糖的试剂中的用途及相关检测方法。

一方面，本发明提供一种基于木质素的过氧化物模拟酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)通过以下途径a)或b)进行碱木质素的胺化：

途径a)：将碱木质素溶于碱溶液得到碱木质素溶液，将环氧氯丙烷逐滴加入到所述碱木质素溶液中，使混合体系反应，过滤并用乙醇和水洗至中性后进行真空干燥，得到环氧化中间体，向制备的环氧化中间体中滴加多元胺，加热反应一段时间后过滤，用丙酮洗涤并烘干后得到胺化木质素；

途径b)：将碱木质素溶于碱溶液得到碱木质素溶液，然后向该溶液中加入乙二胺后升温至80-90℃，之后缓慢滴入甲醛，反应后加入蒸馏水，并调节至pH＝5-6，静置后进行抽滤、洗涤至中性，烘干后得到胺化木质素；

(2)炭化步骤：将步骤(1)得到的胺化木质素置于真空管式炉中，通入N₂惰性气体，同时在炉内进行升温，加热至目标温度后，保持恒温，待管式炉炉内温度降至室温，将样品取出；

(3)掺铁步骤：将步骤(2)得到的经胺化炭化的木质素及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和三氯化铁(FeCl₃)加入玻璃管，放入水热反应釜中，充满N₂，加热反应一段时间后降至室温，用乙醇洗涤、烘干得到黑色产物，即为过氧化物模拟酶。

在具体实施方式中，在步骤(1)中，所述碱木质素为工业碱木质素，例如所述工业碱木质素来自造纸废液。

在具体实施方式中，在步骤(1)的途径a)中，环氧氯丙烷的滴速为0.25-0.75mL/min，优选为0.5mL/min。如果滴速大于0.75mL/min，也即滴速过快，会导致木质素团聚。

在具体实施方式中，在步骤(1)的途径a)中，所述混合体系在40-60℃下搅拌反应7-9小时，优选在50℃搅拌反应8小时。

在具体实施方式中，在步骤(1)的途径a)中，所述多元胺选自三乙烯四胺和二乙烯三胺。

在具体实施方式中，在步骤(1)的途径b)中，碱木质素：乙二胺：甲醛的质量比为1:2:1.2。

在具体实施方式中，在步骤(1)中，所述碱溶液为0.5-1.5mol/L的氢氧化钠水溶液，最优选为1mol/L。当碱液浓度大于1.5mol/L时，配制碱液时会有大量放热，增加了实验的危险性，同时也产生了不必要的药品浪费；而小于0.5mol/时，碱溶液对碱木素的溶解能力降低，不利于后续反应的进行。

在具体实施方式中，在步骤(1)中，在所述碱木质素溶液中，碱木质素的浓度为0.1-0.5g/mL，更优选为0.1-0.25g/mL，最优选为0.1g/mL。碱木质素的浓度高于0.5g/mL，会增加碱木质素在碱液中的溶解难度，同时也增大了碱木质素溶液的粘度，不利于后续反应中与反应物的均匀混合，也增加了反应体系的能耗；而浓度小于0.1g/mL时，碱木质素在体系中的含量过少，降低了反应的效率。

在具体实施方式中，在步骤(2)中，所述管式炉升温速度为10-15℃/min。升温速度超过15℃/min，增加仪器不必要的负荷，也增加了危险性；低于10℃/min，所需时间变长，增加了能耗。

在具体实施方式中，在步骤(2)中，通入N₂惰性气体的速率范围为20-100mL/min；通入N₂惰性气体的速率超过100mL/min，管式炉中气体流速过大，会吹走样品；低于20mL/min，不能及时全部移走胺化木质素炭化时产生的气体。

在具体实施方式中，在步骤(2)中，所述目标温度范围为250-400℃，更优选为300℃；超过400℃，会使木质素的骨架结构解体，变成全碳结构；低于250℃，胺化木质素在一定时间内难以保证炭化完全。

在具体实施方式中，在步骤(2)中，恒温时间为30-90分钟，更优选为60分钟。恒温时间超过90分钟，可能会造成过度炭化以及增加能耗；低于30分钟，胺化木质素在一定温度下难以保证炭化完全。

在具体实施方式中，在步骤(3)中，经胺化炭化的木质素和FeCl₃的质量比为5:1至5:4，更优选为5:3。胺化炭化的木质素在DMF中的浓度为0.005g/ml至0.01g/ml，更优选为0.008g/ml。经胺化炭化的木质素和FeCl₃的质量比高于5:4时，FeCl₃过量太多，也增加了后续洗涤时的溶剂用量，造成了不必要的药品浪费；小于5:1时，FeCl₃的量不足以形成饱和的Fe-N配位键，提供了Fe³⁺与氧气结合的可能，不利于后续样品的保存。经胺化炭化的木质素在DMF中的浓度超过0.01g/ml，增加了后续洗涤时所需溶剂的量，回收有机溶剂存在困难；低于0.005g/ml时，过多的溶剂容易加重对容器设备的要求且增加生产成本。

在具体实施方式中，在步骤(3)中，所述水热反应釜的加热温度为90-120℃，优选为100-120℃，更优选地，为110℃，恒温时间为8-10小时。

另一方面，本发明提供一种根据上述方法制备的过氧化物模拟酶。

再一方面，本发明提供一种检测溶液中过氧化氢含量的方法，所述方法包括使用上述过氧化物模拟酶。

在具体实施方式中，在所述方法中，在缓冲溶液中依次加入过氧化物模拟酶、显色剂3,3’,5’,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液、待测的过氧化氢溶液，在一定温度下反应一段时间，用紫外分光光度计测量652nm处的吸光度，从而确定待测的过氧化氢溶液中过氧化氢的含量。

在具体实施方式中，所述缓冲溶液的pH值为4-7，优选为4-5.5，更优选为5。待测的过氧化氢溶液浓度为10-100mM。过氧化物模拟酶最佳的催化条件为弱酸性，在该pH范围内可保持较高的催化活性。过氧化氢溶液浓度在10-100mM的范围内，其与TMB在652nm处的吸光度呈线性关系。

在具体实施方式中，在所述方法中，反应温度为20-60℃，优选为35-50℃；该温度范围内过氧化物模拟酶可保持相对较高的活性，且与室温或体温相近，为过氧化物模拟酶在多领域的进一步运用打下基础。反应时间为5-20分钟，优选为5-10分钟。反应时间过长，TMB在652nm处的吸光度虽然一直增大，但增幅不明显，增加了实验耗时；时间过短，则增加了检测误差。

再一方面，本发明提供一种检测溶液中葡萄糖含量的方法，所述方法包括使用上述过氧化物模拟酶。

在所述方法中，在0.8mL pH＝7的磷酸盐缓冲液中依次加入0.1mL葡萄糖氧化酶溶液(1mg/mL，溶于水)、0.1mL待测的葡萄糖水溶液，在37℃下反应30分钟，再依次加入1.9mL醋酸盐缓冲液和0.1mLTMB溶液(4mM，溶于无水乙醇)、10mg过氧化物模拟酶，在过氧化物模拟酶的适宜温度(如20-60℃，优选35-50℃)下反应一段时间后，用紫外分光光度计测量652nm处的吸光度，得到吸光度与葡萄糖浓度的标准曲线，从而确定待测的葡萄糖溶液中葡萄糖的含量。

在具体实施方式中，所述溶液中的葡萄糖浓度为10-100mM。

再一方面，本发明提供一种过氧化氢检测制剂，其包含上述过氧化物模拟酶。

又一方面，本发明提供一种葡萄糖检测制剂，其包含上述过氧化物模拟酶。

有益效果

本发明采用将碱木质素胺化、炭化、掺铁的方法构建过氧化物模拟酶，该方法操作简单，原料丰富，制备周期短，整体成本低，是一种既新颖又高效可行的方法。

具体地，与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明首次用木质素为基体制备了过氧化物模拟酶，是一种拓宽木质素应用范围及过氧化物模拟酶种类的新方法。

(2)本发明直接以工业木质素为原料，来源丰富，价格低廉，既可以一定程度上降低生产成本，又可以减少造纸废液带来的污染、实现自然资源的高值化利用。

(3)本发明所采用的胺化方法可重复性高。

(4)本发明中的炭化温度仅为300℃，在保留木质素基本结构的同时消除了大部分羟基，避免了木质素自身消除自由基能力对过氧化物模拟酶作用的影响，相对于传统高温炭化(2500-2900℃)，条件温和，低碳环保。

(5)本发明制备的过氧化物模拟酶，可替代过氧化物酶用于检测10-100mM的过氧化氢和葡萄糖。

附图说明

图1：本发明实施例1产品的SEM图(左)及SEM-EDS图(右)，其中SEM-EDS图中分别显示元素C、N、O、Fe的分布。

图2：本发明实施例1产品的X射线光电子能谱图。

图3：本发明实施例1产品加入显色体系前后的对比光学照片。

图4：(a)：本发明实施例1产品加入显色体系后的吸光度随时间变化曲线图，其中左上角插图为不同体系的光学照片；(b)：实施例1产品加入显色体系后的吸光度随波长变化的曲线图；(c)：实施例1产品加入显色体系后的相对吸光度随pH值变化的曲线图；(d)：实施例1产品加入显色体系后的相对吸光度随温度变化的曲线图。

图5：实施例1产品加入显色体系后，(a)吸光度vs.过氧化氢浓度的稳态曲线图；(b)吸光度vs.TMB浓度的稳态曲线图；(c)吸光度vs.过氧化氢浓度的标准曲线；(d)吸光度vs.葡萄糖浓度的标准曲线。

具体实施方式

在下文中，将参照附图详细地描述本发明公开的优选的实施方式。在描述之前，应当了解在说明书和所附权利要求中使用的术语，并不应解释为局限于一般及辞典意义，而是应当基于允许发明人为最好的解释而适当定义术语的原则，基于对应于本发明技术层面的意义及概念进行解释。因此，在此的描述仅为说明目的的优选实例，而并非是意指限制本发明的范围，因而应当了解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以做出其他等同实施和修改。

术语

在本申请中，室温可指25±3℃。

以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。

在以下实施例中使用的仪器包括：日本SU8010冷场发射扫描电镜、ThermoESCALAB 250XI以及UV230011紫外可见分光光度计。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂或其他仪器、设备均为市售可得产品。

实施例1

将20g工业碱木质素粉末溶于1mol/L的氢氧化钠水溶液中得到0.1g/mL的溶液，将其置于三口烧瓶内，在烧瓶上方安置冷凝管进行冷凝。将5mL环氧氯丙烷逐滴加入到碱木质素溶液中，控制环氧氯丙烷的滴速为0.5mL/min左右，滴加频率为一秒每滴上下。将反应混合体系在50℃下搅拌8小时，过滤并用乙醇和水洗至中性后在40℃下进行真空干燥，得到环氧化中间体。将制备的环氧化中间体加入三口烧瓶，在烧瓶上方安置冷凝管进行冷凝。将20mL三乙烯四胺滴入反应体系，加热反应5h后过滤、用丙酮洗涤并烘干后得到胺化木质素。

将得到的胺化木质素放入石英舟，在10℃/min升温到300℃后保持1h，之后降至室温，完成炭化。用石英试管取0.25g炭化的样品，加入0.2g FeCl₃和30mL DMF后放入水热反应釜，并充满N₂，在110℃下保持10h，降至室温后用DMF和乙醇多次洗涤，得到的黑色产物，即为三乙烯四胺制备的木质素基过氧化物模拟酶。

该样品的最适宜催化温度为35℃；pH为5；对过氧化氢的最大反应速率Vmax＝2.68×10^-2M/s；米氏常数Km＝1.4927×10^-2mM；对显色底物TMB的最大反应速率Vmax＝8.270×10^-5M/s；米氏常数Km＝6.901×10^-5mM；对过氧化氢的标准曲线线性方程为Y＝0.10704+0.00399*X，R²＝0.99947，检出限为54μM；对葡萄糖的标准曲线线性方程为Y＝0.16354+0.01123*X，R²＝0.99897，检出限为56μM。

实施例2

本实施例操作同实施例1，不同之处仅在于在胺化步骤中使用30mL二乙烯三胺代替20mL三乙烯四胺。

在本实施例中制备的过氧化物模拟酶的该样品的最适宜催化温度为45℃；pH为5；对过氧化氢的最大反应速率Vmax＝3.62×10^-2M/s；米氏常数Km＝1.9433×10^-2mM；对显色底物TMB的最大反应速率Vmax＝5.195×10^-3M/s；米氏常数Km＝1.259×10^-3mM；对过氧化氢的标准曲线线性方程为Y＝0.00225+0.000311*X，R²＝0.99417，检出限为77μM；对葡萄糖的标准曲线线性方程为Y＝0.16229+0.01039*X，R²＝0.99675，检出限为84μM。

实施例3

将20g工业碱木质素粉末溶于1mol/L的氢氧化钠水溶液中得到0.1g/mL的溶液，搅拌10分钟后加入约44mL乙二胺，升温至85℃后缓慢滴入29mL甲醛，继续反应5h，加入1mol/L的HCl溶液调节pH＝5-6，胺化木质素析出后进行过滤、洗涤至中性，并烘干。

得到的胺化木质素放入石英舟，在10℃/min升温到300℃后保持1h，之后降至室温，完成炭化。用石英试管取0.25g炭化的样品，加入0.2g FeCl₃和30mL DMF后放入水热反应釜，并充满N₂，在110℃下保持10h，降至室温后用DMF和乙醇多次洗涤，得到的黑色产物即为乙二胺制备的木质素基过氧化物模拟酶。

该样品的最适宜催化温度为50℃；pH为5；对过氧化氢的最大反应速率V_max＝4.32×10^-2M/s；米氏常数Km＝5.79×10^-2mM；对显色底物TMB的最大反应速率V_max＝2.120×10^{- 3}M/s；米氏常数Km＝2.343×10^-3mM；对过氧化氢的标准曲线线性方程为Y＝0.07247+0.002*X，R²＝0.9952，检出限为120μM；对葡萄糖的标准曲线线性方程为Y＝0.09284+0.00365*X，R²＝0.99451，检出限为125μM。

通过实施例1、2、3的对比可以看出，应用本发明得到的三种木质素基过氧化物模拟酶均可准确检测10-100mM的过氧化氢和葡萄糖浓度，且调整胺化步骤中所用的胺链长度，可以对其催化过氧化氢分解的最适温度、检出限进行调控：随着胺链增长，其最适宜催化温度降低、且对过氧化氢和葡萄糖的检出限也降低了。此外，米氏常数Km和反应最大速率Vmax表示了酶对底物的亲和力，Km越小表示酶对底物的亲和力越大，进一步证明了三种胺中胺链更长的胺制备的木质素基过氧化物模拟酶有更好的催化活性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实施例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.一种基于木质素的过氧化物模拟酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)通过以下途径a)或b)进行碱木质素的胺化：

途径a)：将碱木质素溶于碱溶液得到碱木质素溶液，将环氧氯丙烷逐滴加入到所述碱木质素溶液中，使混合体系反应，过滤并用乙醇和水洗至中性后进行真空干燥，得到环氧化中间体，向制备的环氧化中间体中滴加多元胺，加热反应一段时间后过滤，用丙酮洗涤并烘干后得到胺化木质素，

途径b)：将碱木质素溶于碱溶液得到碱木质素溶液，然后向该溶液中加入乙二胺后升温至80-90℃，之后缓慢滴入甲醛，反应后加入蒸馏水，并调节至pH＝5-6，静置后进行抽滤、洗涤至中性，烘干后得到胺化木质素；

(2)炭化步骤：将步骤(1)得到的胺化木质素置于真空管式炉中，通入N₂惰性气体，同时在炉内进行升温，加热至目标温度后，保持恒温，待管式炉炉内温度降至室温，将样品取出；以及

(3)掺铁步骤：将步骤(2)得到的经胺化炭化的木质素及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和三氯化铁(FeCl₃)加入玻璃管，放入水热反应釜中，充满N₂，加热反应一段时间后降至室温，用乙醇洗涤、烘干得到黑色产物，即为过氧化物模拟酶。

2.根据权利要求1所述的方法，

其中，在步骤(1)中，所述碱木质素为工业碱木质素，例如，所述工业碱木质素来自造纸废液，所述碱溶液为0.5-1.5mol/L的氢氧化钠水溶液，并且在所述碱木质素溶液中，碱木质素的浓度为0.1-0.5g/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，

其中，在途径a)中，环氧氯丙烷的滴速为0.25-0.75mL/min，所述混合体系在40-60℃下搅拌反应7-9小时，所述多元胺选自三乙烯四胺和二乙烯三胺；

在途径b)中，碱木质素：乙二胺：甲醛的质量比为1:2:1.2。

4.根据权利要求1所述的方法，

其中，在步骤(2)中，所述管式炉升温速度为10-15℃/min，通入N₂惰性气体的速率范围为20-100mL/min，目标温度范围为250-400℃，恒温时间为30-90分钟。

5.根据权利要求1所述的方法，

其中，在步骤(3)中，经胺化炭化的木质素和FeCl₃的质量比为5:1至5:4，经胺化炭化的木质素在DMF中的浓度为0.005g/ml至0.01g/ml，水热反应釜的加热温度为90-120℃，恒温时间为8-10小时。

6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的方法制备的过氧化物模拟酶。

7.一种检测溶液中过氧化氢含量的方法，所述方法包括使用如权利要求6所述的过氧化物模拟酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，在所述方法中，在pH值为4-7的缓冲溶液中依次加入权利要求6所述的过氧化物模拟酶、显色剂3,3’,5’,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液、待测的过氧化氢溶液，在20-60℃下反应5-20分钟，用紫外分光光度计测量652nm处的吸光度。

9.一种检测溶液中葡萄糖含量的方法，所述方法包括使用如权利要求6所述的过氧化物模拟酶。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，在所述方法中，在pH＝7的磷酸盐缓冲液中依次加入葡萄糖氧化酶溶液、待测的葡萄糖水溶液，在37℃下反应30分钟，再依次加入醋酸盐缓冲液和3,3’,5’,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液、权利要求6所述的过氧化物模拟酶，在35-50℃下反应一段时间后，用紫外分光光度计测量652nm处的吸光度。

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