CN109212202A - 氮掺杂纳米碳球的类过氧化物酶活性及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及氮掺杂纳米碳球的类过氧化物酶活性及其用途，具体而言，本申请涉及氮掺杂纳米碳球的类过氧化物酶活性及其在免疫组化、免疫层析中的用途。

Description

氮掺杂纳米碳球的类过氧化物酶活性及其用途
技术领域
本申请属于纳米技术和免疫组化、免疫层析的交叉领域。特别地，本申请涉及纳米材料的免疫组化、免疫层析应用。更具体而言，本申请涉及氮掺杂纳米碳球的类过氧化物酶活性及其在免疫组化和免疫层析中的用途。
背景技术
氮掺杂纳米碳材料(N-doped carbon nanomaterials)的研究已经成为国际碳材料领域的热点之一。氮原子比碳原子多一个价电子，氮掺杂进入碳的六元环结构后可形成吡啶、吡咯、石墨氮、吡啶氧化物等含氮官能团，不仅可以提高纳米碳材料的表面化学活性，还可对其电子结构进行调节，从而改变纳米碳球的催化活性、导电性和吸附性能等[1,2]。传统的氮掺杂纳米材料广泛用于氧还原反应(oxygen reduction reaction，ORR)[3]，超级电容器 [4]以及电化学和生物传感器[5]等领域。但是迄今为止，未有将其应用于生物医学的报道。
在2007年，本发明人在国际上首次发现无机Fe3O4纳米颗粒等本身就具有内在的生物酶活性[6]，并将这种具有内在酶活性的纳米材料称为纳米酶[7]。发现纳米酶的报道引领了纳米酶颗粒研究的热潮，有近百种纳米材料的不同纳米酶颗粒活性被陆续报道[8,9]，并被广泛应用于纳米生物医学技术领域，比如生物传感、生物成像、组织工程、肿瘤的诊断和治疗等等 [10-12]。
截至目前，未有氮掺杂纳米碳材料或氮掺杂纳米碳球是否具有类过氧化物酶活性的报道。
发明内容
本发明的第一方面涉及氮掺杂纳米碳球用作过氧化物酶的用途。
在一些实施方案中，所述用途是体外用途或体内用途。在一些实施方案中，所述用途是治疗和/或诊断用途。在一些实施方案中，所述用途是非治疗和/或非诊断用途。
本发明的第二方面涉及氮掺杂纳米碳球在制备用于免疫组化、免疫层析的试剂中的用途。
在一些实施方案中，所述免疫组化用于定位、定性和/或定量肿瘤，优选地，上述肿瘤选自实体瘤，优选地，所述肿瘤选自脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌或黑色素瘤，更优选地，所述肿瘤选自肝细胞癌或肝母细胞瘤；和/或上述免疫层析用于传统免疫层析法适用的范围，优选地，用于疾病诊断、疾病筛查和海关进出口检疫。
本发明的第三方面涉及氮掺杂纳米碳球在制备抗感染药物中的用途。
本发明的第四方面涉及利用氮掺杂纳米碳球治疗受试者中的感染的方法，其包括向受试者施用所述氮掺杂的纳米碳球。
本发明的第五方面涉及氮掺杂纳米碳球，其用于制备抗感染药物。
在一些实施方案中，所述感染选自细菌感染、放线菌感染、真菌感染、病毒感染、衣原体感染、支原体感染、立克次体感染、螺旋体以及朊病毒感染的一种或多种，优选地，所述感染选自细菌感染、放线菌感染和真菌感染的一种或多种，优选地，所述感染是细菌感染，更优选地，所述感染是链球菌、葡萄球菌或铜绿假单胞菌感染。
本发明的第六方面涉及氮掺杂纳米碳球用于处理含有机物污水的用途。
在一些实施方案中，所述有机物选自酚类、醛类、碳水化合物、脂肪、蛋白、纤维素的一种或多种，优选地，所述有机物是苯。
在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球的粒径范围为20-200nm之间，优选地，粒径范围为50-150nm，更优选地，粒径范围为70-140nm。
在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球进一步掺入金属元素，优选地，所述金属元素选自Fe、Co、Ni、Cu、Ce和Mn的一种或多种，更优选地，所述金属元素选自是Fe、Ni、Ce、Mn和Cu的一种或多种。
在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球用靶向性蛋白进一步进行修饰，优选地，所述靶向性蛋白选自对于病原或者肿瘤有特异性的抗体、配体、多肽、小分子或核酸适配体，优选地，所述靶向性蛋白选自抗体、配体或全人 H铁蛋白。
在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球利用下述方法制得：
1)在形成碳前驱体的过程中引入含氮物质；
2)进行碳化。
在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球利用下述方法制得：
1)在形成碳前驱体的过程中引入三聚氰胺，其中碳前驱体为苯酚，且三聚氰胺与苯酚的质量比为1:5～5:1，优选地，1:3～3:1，更优选地，1:2～2:1，最优选地，1:1；2)在500-1200℃下碳化1-8hr，优选地，温度为600-1000℃，更优选地，700-900℃，更优选地，750-850℃，优选地，碳化时间为1.5-6hr，更优选地，2-5hr，更优选地，2.5-4hr，更优选，2.5-3.5hr，最优选地，3hr。。
换言之，在本发明中，申请人首次发现，氮掺杂纳米碳球(N-carbon) 具有天然的过氧化物酶活性，其中过氧化物酶活性与天然过氧化物酶类似，在H2O2存在的前提下，可以催化显色底物发生显色反应。并且铁等金属原子的掺杂可以有效提高其类过氧化物酶催化活性。利用氮掺杂碳球的过氧化物酶活性可以建立纳米酶免疫组化和免疫层析新方法。而且，利用N-carbon 的过氧化物酶活性，还可以实现抗感染治疗和含有机物废水的处理。因此，本发明不仅首次证实了氮掺杂纳米碳球具有过氧化物酶活性，还发现其可以用于免疫组化、抗感染和污水处理等用途。
附图说明
图1Carbon(A图)、N-carbon(B图)的透射电子显微镜(TEM)表征及对两种材料的光电子能谱分析(C图)。TME电镜结果表明，N掺杂不会影响纳米碳球的形貌及尺寸，光电子能谱分析表明N掺杂成功。
图2 N-carbon的高分辨率投射电子显微镜(A图)及扫描投射电子显微镜(B-D图)表征。
图3 N-carbon的过氧化物酶表征。在底物H2O2和TMB存在的前提下， N-carbon可以催化底物发生显色反应，底物TMB氧化产物会在652处产生特异性吸收峰。而无氮掺杂的Carbon没有这个活性。图中显示的Eppendorf管是显色后的图片。图中1-4分别是：1，醋酸反应缓冲液及H2O2和TMB； 2，反应缓冲液及H2O2和TMB，加入40μg/mL的Carbon纳米颗粒；3，反应缓冲液及H2O2和TMB，加入12.5μg/mL的N-carbon纳米颗粒；4,反应缓冲液及H2O2和TMB，加入25μg/mL的N-carbon纳米颗粒
图4Fe掺杂后，Fe-N-carbon具有更强的酶活性。A图和B图为对 Fe-N-carbon的光电子能谱分析。结果表明，在纳米碳球中，成功掺入了Fe。 C图为对Carbon、N-carbon及Fe-N-carbon的过氧化物酶活性表征。结果表明，Fe掺杂，会进一步增强纳米碳球的酶活性。
图5不同金属掺杂后，对N-carbon颗粒酶活性的影响。其中，将碳球与传统的磁颗粒Fe3O4，以及未掺杂N的碳球N0,N-carbon(N3)以及掺杂N 比例高的碳球N-HCNs进行了定量的对比。
图6基于Fe-N-carbon的纳米酶免疫组化法对TfR1阳性肿瘤切片的染色。mIgG为抗TfR1抗体的同型对照。
图7基于Fe-N-carbon的纳米酶免疫层析法对Ricin毒素的检测。星号标记的浓度为肉眼可以识别的最低限度。A为基于Fe3O4纳米酶的免疫层析法的检测结果。B为基于Fe-N-carbon纳米酶免疫层析法的检测结果。
图8Fe-N-carbon纳米颗粒用于伤口染菌的治疗。与缓冲液组相比， Fe-N-carbon纳米颗粒治疗组很快会愈合。
图9 N-carbon的氧化酶及过氧化物酶活性，可有效降解污水中的苯类化合物，实现污水的净化处理。A，气相色谱-质谱联用(GC-MS)对含苯废水及经过N-carbon处理后的废水表征。B，污水经N-carbon颗粒处理后的效果图。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“纳米碳球”是指尺度是纳米尺度，形貌是球形的碳颗粒，其组成为C、N、O，粒径在20-200nm之间，如20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、 150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm，如20-180nm、30-160nm、 40-150nm、50-150nm、60-150nm、70-150nm、80-140nm、90-140nm、 100-130nm、110-130nm、115-125nm、20-140nm、30-130nm、40-120nm、 50-110nm、60-100nm、70-90nm，其它形状的一些颗粒，比如纳米棒，纳米片，纳米花等含氮碳材料亦有模拟氧化酶活性。本发明的纳米碳球的边界粒径上限为300nm。本发明的纳米碳球的粒度分布相对均一，但粒度分布是否均一并不实质性影响本发明的氮掺杂纳米碳球的酶活性。本发明所用的纳米碳球可以利用本领域已知的任何方法制备。
如本文所用，术语“氮掺杂的纳米碳球”是指在碳骨架中掺杂有氮(N) 原子的纳米碳球，具体讲就是在石墨化结构中掺入了N原子。本领域知晓如何将N原子掺入纳米碳球的方法，例如，一种常规的方法就是在前驱体中加入含氮物质，如加入三聚氰胺，前驱体中含氮物质的量直接影响着最终氮掺杂纳米碳球的氮含量，也有用后处理的方法，例如NH3气处理等。一般需要高温碳化过程，或者高温处理。碳化过程对最终产物的氮含量也有较大影响，随着碳化温度的升高，碳化时间的延长，都会造成氮含量的降低。本发明所用的氮掺杂的纳米碳球的氮掺杂比例为0.5-15at％，如0.5-13at％、 0.5-12％、1-11at％、1-9at％、1.5-8at％、2-7at％、2-6at％、2.5-5at％、 2.5-4.5at％，如0.6at％、0.8at％、1at％、1.2at％、1.4at％、1.6at％、 1.8at％、2.0at％、2.2at％、2.4at％、2.6at％、2.8at％、3.0at％、3.5at％、 4.0at％、4.5at％、5.0at％、5.5at％、6.0at％、6.5at％、7.0at％、7.5at％、 8.0at％、8.5at％、9.0at％、9.5at％、10.0at％、11.0at％、12.0at％、13.0at％、14.0at％。
本发明的氮掺杂纳米碳球的酶活性与粒径大小相关，粒径越小，催化效能越高，其催化效率跟比表面积、氮含量等诸多条件也有关。含氮的、比表面积大的含氮碳球可以用本领域的任何方法制备，具有高低不同但相似的效果。本发明的氮掺杂纳米碳球的酶活性在低于7的酸性pH值环境下发挥，例如pH值为1-6.5、2-6、3-5.5、3.5-5、4.0-4.5，例如pH为2.5、3、3.5、4、 4.5、5.0、5.5或6.0。
如本文所用，术语“继续掺杂其它金属元素的氮掺杂的纳米碳球”是指继续掺杂其它金属元素的氮掺杂的纳米碳球，例如掺入Fe、Co、Ni、Cu、 Ce、Mn中的一种或多种，如2种、3种、4种或更多种，优选地，所述掺入的金属元素为Fe。
如本文所用，术语“过氧化物酶”是指EC编号1.11.1.x的酶，其是很大的一族酶，它们通常催化一个下面形式的反应：
ROOR'+给电子体(2e-)+2H+→ROH+R'OH
这一类酶当中有很多酶的最理想底物为过氧化氢，还有一些则是有机的氢过氧化物如过氧化脂类。过氧化物酶有时会在其活化位置上包含一个血红素辅因子。
“类过氧化物酶活性”是指具有类似过氧化物酶的一类催化活性的总称。
如本文所用，氮掺杂纳米碳球用作过氧化物酶的用途是指，基于氮掺杂纳米碳球的类过氧化物酶活性，本领域已知的天然过氧化物酶可以实现的功能都可以利用氮掺杂纳米碳球的类过氧化物酶活性实现。
如本文所用，术语“免疫组化”是指应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(通常为过氧化物酶)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术。本发明利用纳米碳球的过氧化物酶活性，替代了传统免疫组化中的过氧化物酶，从而建立起一种新型的纳米碳球免疫组化方法。此方法可以适用于一切传统免疫组化的应用范围，比如病理诊断、疾病检测、形态观察等等。
如本文所用，术语“免疫层析”是指将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。本发明中将纳米碳球替换了传统方法中的胶体金和免疫酶，从而建立纳米碳球免疫层析法。所有传统免疫层析法能够适用的范围，本发明均可以适用，比如疾病诊断、疾病筛查、海关进出口检疫等等
如本文所用，术语“继续掺杂其它金属元素的氮掺杂的纳米碳球”是指继续掺杂其它金属元素的氮掺杂的纳米碳球，例如掺入Fe、Co、Ni、Cu、 Ce、Mn中的一种或多种，如2种、3种、4种或更多种，优选地，所述掺入的金属元素为Fe。。
如本文所用，抗感染治疗是指针对受试者伤口常见的感染细菌，比如链球菌、葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)、铜绿假单胞杆菌等的感染具有治疗效果。用于抗感染治疗时，本发明的氮掺杂纳米碳球可以以组合物的形式提供，其包含药学上可接受的载体。例如所述氮掺杂的纳米碳球可以以溶液、洗剂、乳剂、粉剂、软膏、湿敷剂、汀剂、贴剂、糊剂、凝胶剂、硬膏剂、胶膜剂等形式提供。
所述受试者包括禽类、爬行动物、哺乳动物等。优选地，哺乳动物包括啮齿类动物、灵长类动物，优选地，灵长类动物包括人。
如本文所用，药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
如本文所用，含有机物的废水是指由造纸、皮革及食品等行业排出的含有机物的废水，在一些实施方案中，所述有机物的含量在2000mg/L以上废水。这些废水中含有大量的碳水化合物、脂肪、蛋白、纤维素等有机物，如果直接排放，会造成严重污染。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本实施例中的化学试剂，除非特别指明，均购自于Sigma-Aldrich Inc.(USA)。
实施例1.氮掺杂纳米碳球(简称为N-Carbon)的制备及表征
1.798g三聚氰胺，2.1mL福尔马林水溶液(37.0wt％)和15mL蒸馏水在三颈烧瓶中混匀，并在80℃条件下搅拌均匀，获得无色透明溶液。然后，向上述溶液中加入0.6g苯酚，2.1mL福尔马林溶液(37.0wt％)和15 mL NaOH(0.1mol·L-1)溶液，在66℃条件下搅拌0.5小时(h)以获得低分子量的酚醛树脂(分子量小于10000道尔顿)。然后向反应体系中加入15mL嵌段共聚物Pluronic F127(0.7g)，以350rpm的速度，在66℃条件下搅拌2 h之后，向反应液中加入50mL蒸馏水，继续反应。在反应过程中，反应液由无色变成粉色，最终变为深红色。反应24h后，反应终止，有沉淀出现。静止一段时间，沉淀会复溶，然后将17.7mL获得的反应液转入高压釜(反应釜容积30ml)中加热至130℃反应24h。最终，通过离心(转速8000转 /分，5分钟)收集产物，水洗几次后，室温干燥。获得的干燥粉末在N2条件下800℃碳化来去除Pluronic F127模板,最终获得氮掺杂纳米碳球纳米颗粒 (N-carbon nanoparticles，简称为N-Carbon)。作为对照，不掺杂氮的纳米碳球颗粒(Carbon nanoparticles，简称为Carbon)同时合成，区别为在上述体系中不加入三聚氰胺。
Carbon、N-carbon纳米颗粒的形貌利用透射电子显微镜(Tecnai 12,Philip, 荷兰)表征。结果如图1的A图、B图所示，获得的Carbon及N-carbon纳米颗粒的尺寸均为100nm。不掺杂氮的纳米碳球颗粒跟掺杂氮的颗粒无差别。光电子能谱分析(XPS)表面在掺杂氮的纳米碳球N-carbon中有明显的 N、O存在(图1的C图)，而无氮掺杂的没有。这表明纳米碳球中N掺杂成功。
N-carbon纳米颗粒的形貌进一步通过高分辨率投射电子显微镜(HRTEM)成像表征。如图2的A图所示，可见均一的100nm左右的颗粒。 N-carbon不同纳米颗粒的均一性和同质性通过扫描投射电子显微镜(STEM) 来表征。如图2的B-D图所示，通过对不同的N-carbon纳米颗粒的STEM 表征，不同的单个N-carbon纳米颗粒具有同样的元素分布，其中图2的C图为C的k-edge分布，图2的D图为N的k-edge分布。可见，N-carbon纳米颗粒是一种组成分布均一的纳米颗粒。N的掺入量的定量数据通过元素分析仪、XPS、能谱等方法进行测定。本实验中给定条件下的氮掺入量对N-3为 3.37at％，N-5为2.85at％。其中at％是指原子数百分含量。
实施例2.N-carbon具有过氧化物酶活性
N-carbon的过氧化物酶活性检测，以醋酸钠缓冲液为反应体系，在底物 H2O2存在的前提下，对显色底物TMB进行氧化发生颜色反应，通过检测氧化TMB底物在652nm特异性的吸收峰来进行测定。反应体系如下：含有不同浓度N-carbon及Carbon纳米颗粒的反应液1.0mL(0.1M醋酸钠缓冲液, pH 4.25)中加入10μL TMB(终浓度为0.416mM)和60μL H2O2(终浓度为0.5292M)。室温反应10分钟(min)后，用酶标仪(Bio-Rad)测定反应体系在652nm处的吸收峰，来测定其酶活性及强弱。
结果如图3所示，当反应体系为pH 4.25的醋酸钠缓冲液，并在反应底物H2O2及TMB的存在的前提下，加入高浓度Carbon(40μg/mL)纳米颗粒后，无明显的显色反应发生。而当加入低量的N-carbon(12.5μg/mL)后，有明显的颜色反应发生，产物在652nm处有特异性吸收峰。而随着加入 N-carbon(25μg/mL)浓度增加，颜色反应相应增强。据此，本发明人得出，N-carbon具有显著性的过氧化物酶活性，而无氮掺杂的carbon颗粒不具有此活性。
实施例3.在氮掺杂的基础上，继续掺杂其他金属元素，可增强Carbon 颗粒的类过氧化物酶活性。
本实施例中，本发明人在N掺杂的基础上继续掺杂铁，来证实金属元素的掺杂是否可进一步增强Carbon材料的类氧化酶活性。具体步骤如下：在 250ml圆底烧瓶中加入90ml乙醇和15ml去离子水搅拌混合均匀，再往上述溶液中加入2.0ml氨水，搅拌约10min后，加入4.0ml TEOS搅拌8h，停止反应，高速离心得到白色固体，去离子水、乙醇各洗涤3次，置于60℃烘箱干燥12h，得到SiO2固体，研碎备用。将所得100mg SiO2小球分散在Tris-HCl (pH＝8.5)缓冲溶液中，加入100mg的多巴胺，反应24h后，离心、洗涤、收集沉淀，烘干后得到PDA@SiO2，备用。将上述所得的PDA@SiO2分散在 20ml的乙醇溶液中，加入100mg FeCl3·6H2O,反应24h后，离心、洗涤、收集沉淀，烘干后得到Fe3+-PDA@SiO2，备用。将上述所得Fe3+-PDA@SiO2小球800℃下煅烧2h后，碱洗8h后，离心洗涤，烘干，即得Fe-N-carbon纳米颗粒。
Fe-N掺杂的纳米碳球的酶活性通过测定其过氧化物酶活性来进行验证，反应体系同实施例2，反应体系中加入Carbon、N-carbon及Fe-N-carbon，浓度均为7.5μg/mL。结果如图4的A-C图所示，Carbon单独不具有过氧化物酶活性，N-carbon具有明显的过氧化物酶活性。而继续掺杂Fe的Fe-N-carbon，在同等条件、同等浓度下，具有比N-carbon更强的过氧化物酶活性。基于此实施例，本发明人继续向N掺杂的carbon中掺杂其他金属离子 (Ni/Ce/Mn/Cu)，发现金属掺杂后，均会进一步增强其酶活性(图5)。这些结果表明，金属掺杂，会进一步增强N-carbon的氧化酶活性。
实施例4基于氮掺杂纳米碳球的过氧化物酶活性建立纳米酶免疫组化新方法
本实施例中，用到的氮掺杂碳球为Fe-N-carbon颗粒。基于其过氧化物酶活性，发明人建立了一套纳米酶免疫组化新方法。具体步骤如下:
制备肿瘤特异性识别的Fe-N-carbon纳米颗粒：取5mg EDC和5mg NHS(sigma)溶于1mL去离子水中,再加入5mg Fe-N-carbon纳米颗粒到混合液中，室温孵育0.5h。离心收集活化的Fe-N-carbon纳米颗粒，并用超纯水洗两遍；将100μg/mL的肿瘤特异性抗体(本实施例为鼠抗人TfR1单克隆抗体，为发明人根据常规方法自制)配制于醋酸钠缓冲液(pH4.5)，并加入Fe-N-carbon纳米颗粒反应管中，涡旋混合后于4℃过夜孵育。用Tris 缓冲液(pH8.0)室温孵育0.5h以终止反应。PBS(pH 7.0)洗3遍以获得纳米酶抗体探针，重悬于1mL 5％BSA-PBS中。对照抗体用鼠IgG作为阴性对照。
基于Fe-N-carbon纳米颗粒的纳米酶免疫组化：脱蜡：取出病理切片(人肝癌细胞系移植瘤模型，为发明人根据常规方法自制),60℃预热2h,入二甲苯溶液(提前10h预热)2次,每次10min。水化：脱蜡后片子经无水乙醇×2—95％—80％—70％—50％乙醇梯度后，入蒸馏水中水化，每步骤5min。过氧化物酶处理：片子入3％过氧化氢，37℃避光处理10min，消除内源性过氧化氢酶。PBS洗三次，每次5min。抗原热修复：0.01M(pH6.0)柠檬酸缓冲液100℃高压3min，自然冷却，PBS洗三次，每次5min。封闭：5％的羊血清(PBS稀释，商业来源中杉金桥)37℃封闭1小时，不用洗。一抗：加入5％的羊血清稀释的上述抗体标记的Fe-N-carbon颗粒，37℃孵育2h，或4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5min。DAB显色：现配的DAB显色液显色3-10min，室温避光，PBS洗去浮色。苏木素复染：8-12s，蒸馏水冲洗干净入水5min。逐级脱水封片：50-70-80-95-100-100％乙醇，二甲苯×2，各5min。中性树脂封片。显微镜成像系统拍片保存。
结果如图6所示，标记有肿瘤特异性抗体的Fe-N-carbon纳米颗粒可以特异性将肿瘤细胞染成褐色，而作为阴性对照的标记有mIgG的Fe-N-carbon 纳米颗粒则无着色。这表明，Fe-N-carbon纳米颗粒的过氧化物酶，足以将其利用与免疫组化的检测。而基于Fe-N-carbon纳米颗粒的纳米酶免疫组化，是一个检测平台，其抗体可以连接任意的抗体，从而可用于所有类型肿瘤的病例诊断。
实施例5.基于氮掺杂碳球的过氧化物酶活性建立纳米酶免疫层析新方法
本实施例中，用到的氮掺杂碳球为Fe-N-carbon颗粒。基于其过氧化物酶活性，发明人建立了一套纳米酶免疫层析新方法。具体步骤如下:
抗体标记Fe-N-carbon颗粒参见实施例3，本实施例中用到的抗体为抗 Ricin抗体6A6(购自中杉金桥)。
制备试纸条：将硝酸纤维素膜、吸水垫，依次粘贴于底衬卡上；用 IsoflowtmDispenser(Imagene Technology,New Hampshire,美国)沿着硝酸纤维素膜划出检测线(对应检测物的鼠IgG抗体，本实施例为检测Ricin的单克隆抗体7G7，为发明人根据常规方法自制)和控制线(羊抗鼠IgG抗体，购自sigma)。37℃干燥1h。用1％BSA封闭30min，用硼酸盐缓冲液(5mM, PH 8.8)洗3遍，再在37℃下干燥3h。裁切试纸条，大小约为25mm×5mm，并置于密封袋内室温干燥保存。
纳米酶免疫层析：Eppendorf反应管中加入反应缓冲液(50mM Tris-HCl, pH 8.0,150mM NaCl,1％NP40(v/v)，1％BSA(w/v))，并加入8μL纳米酶抗体探针和80μl样品(本实施例中为不同浓度的Ricin毒素)。将试纸条垂直插入EP管中，层析15min；取出试纸条，将其放入纳米酶底物缓冲液 (DAB和H2O2)中反应7min。试纸条迅速用去离子水冲洗以终止反应，检测线处的颜色强度可通过肉眼观察检测。
本实施例中，将基于Fe3O4纳米酶的免疫层析法作为对照。结果如图7 所示，图7的A图为基于Fe3O4纳米酶的免疫层析法，检测限度为100ng/mL；图7的B图为基于Fe-N-carbon颗粒的免疫层析法，检测限度为1ng/mL。因此，氮掺杂后的纳米碳球，可以将免疫层析灵敏度提高至少100倍。同样，基于Fe-N-carbon颗粒的免疫层析法是一个技术平台，适用于一切基于抗体的病原、抗原甚至小分子检测。
实施例6基于氮掺杂碳球的过氧化物酶活性，用于体内伤口杀菌
本实施例中，用到的氮掺杂碳球为Fe-N-carbon颗粒。基于其过氧化物酶活性活性，本发明人将其应用于体内伤口感染细菌后的治疗，具体步骤如下：
小鼠(Balb/c正常小鼠，购自维通利华)背部剃毛，麻醉后，用手术刀划直径为5mm的伤口。然后，将铜绿假单胞杆菌菌液(107cfu/mL)滴到伤口上，保证菌液在伤口部位停留一段时间(10min)。感染12h后开始开展实验。缓冲液组，向伤口滴加10μl缓冲液(pH5.0NaAc)，然后用绷带将伤口包起；Fe-N-carbon组，首先将Fe-N-carbon颗粒用缓冲液稀释到0.2mg/mL，向伤口滴加10ml Fe-N-carbon颗粒，然后用绷带将伤口包起。给药后，24h换一次绷带，在第一、三、五天对伤口进行拍照。
结果如图8所示，在伤口感染铜绿假单胞杆菌化脓后，经Fe-N-carbon 治疗的小鼠伤口很快恢复，与之相比，给予缓冲液的恢复缓慢，伤口一直没有彻底愈合。
实施例7.基于氮掺杂碳球的过氧化物酶活性，用于含有机物工业废水的净化处理
目前，含有机物废水的净化处理是水处理领域的难题。特别是苯类化合物是工业废水中常见的有机污染物，其毒性大且不易被环境中的微生物降解。在本实施例中，本发明人利用了N-carbon碳球的过氧化物酶活性，进行了降解工业废水中苯类有机物的可行性探讨。
具体步骤如下：
含苯类有机物工业废水先用醋酸钠缓冲液调整pH为酸性。然后向1mL 工业废水样品中，加入20μg N-carbon纳米颗粒。然后进行充分的搅拌，使反应体系空气充足。向另一组废水样品中，加入20μg N-carbon纳米颗粒和 10μL 30％H2O2,同样充分搅拌。反应6h后，取反应产物进行气相色谱-质谱联用分析(GC-MS)，同时对反应前后的工业废水样品进行拍照。
结果如图9的A-B图所示，单独加入N-carbon纳米颗粒的废水组，在 N-carbon的过氧化物酶作用下，可以有效的降解废水中的有机苯。而缓冲液本身没有影响。在上述基础上，继续加入H2O2后，在过氧化物酶的作用下，废水中的有机苯基本上被降解完毕(图9的A图)，同时，废水的颜色也由深色，变为基本上无色。因此N-carbon的过氧化物酶，可用于含有机污染物的工业废水处理。
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Claims (11)

1.氮掺杂纳米碳球用作过氧化物酶的用途。
2.氮掺杂纳米碳球在制备用于免疫组化、免疫层析的试剂中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述免疫组化用于定位、定性和/或定量肿瘤，优选地，上述肿瘤选自实体瘤，优选地，所述肿瘤选自脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌或黑色素瘤，更优选地，所述肿瘤选自肝细胞癌或肝母细胞瘤；和/或上述免疫层析用于传统免疫层析法适用的范围，优选地，用于疾病诊断、疾病筛查和海关进出口检疫。
4.氮掺杂纳米碳球在制备抗感染药物中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述感染选自细菌感染、放线菌感染、真菌感染、病毒感染、衣原体感染、支原体感染、立克次体感染、螺旋体以及朊病毒感染的一种或多种，优选地，所述感染选自细菌感染、放线菌感染和真菌感染的一种或多种，优选地，所述感染是细菌感染，更优选地，所述感染是链球菌、葡萄球菌或铜绿假单胞菌感染。
6.氮掺杂纳米碳球用于处理含有机物污水的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述有机物选自酚类、醛类、碳水化合物、脂肪、蛋白、纤维素的一种或多种，优选地，所述有机物是苯。
8.如权利要求1-7任一项所述的用途，其中所述氮掺杂纳米碳球的粒径范围为20-200nm之间，优选地，粒径范围为50-150nm，更优选地，粒径范围为70-140nm。
9.如权利要求1-8任一项所述的用途，其中所述氮掺杂纳米碳球进一步掺入金属元素，优选地，所述金属元素选自Fe、Co、Ni、Cu、Ce和Mn的一种或多种，更优选地，所述金属元素选自是Fe、Ni、Ce、Mn和Cu的一种或多种。
10.如权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述氮掺杂纳米碳球用靶向性蛋白进一步进行修饰，优选地，所述靶向性蛋白选自对于病原或者肿瘤有特异性的抗体、配体、多肽、小分子或核酸适配体，优选地，所述靶向性蛋白选自抗体、配体或全人H铁蛋白。
11.如权利要求1-10任一项所述的用途，其中所述氮掺杂纳米碳球利用下述方法制得：
1)在形成碳前驱体的过程中引入含氮物质；
2)进行碳化。
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