CN106501248A

CN106501248A - 一种高通量酶传感器及检测人体尿液中尿素的方法

Info

Publication number: CN106501248A
Application number: CN201610968261.1A
Authority: CN
Inventors: 杨丽; 杨继庆
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeastern University China; Northeast Normal University
Priority date: 2016-11-06
Filing date: 2016-11-06
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2036-11-06
Also published as: CN106501248B

Abstract

本发明涉及一种基于新型高通量酶传感器的尿素检测方法。96孔微孔板(microplate)的密封板（robolid）作为酶固定化的载体。脲酶固定化采用海藻酸钠‑壳聚糖为基质的包埋法，与多聚赖氨酸（PLL）‑Ba²⁺涂层预处理的形成“egg‑box”结构的海藻酸钡凝胶，从而制备三维高通量酶传感器。酶固定化的robolid板与microplate的组合实现了每个微孔液体密封的多样品的高通量检测（见图1）。制备的酶传感器与微孔板中的样品溶液形成“robolid板‑脲酶‑尿素样品”的夹心结构，通过简单翻转该夹心结构来实现酶反应的启动和停止，简便、高通量地定量检测尿素。与现有尿素检测技术相比，检测平台的整个制备过程和检测过程操作简便、低成本、高通量。尿素浓度与405nm波长下的吸光度正相关，可定性定量检测尿素。此外，商业化的robolid和固定化脲酶robolid可重复使用，性价比高，有益于临床实践和推广。

Description

一种高通量酶传感器及检测人体尿液中尿素的方法

技术领域

本发明属于酶传感器分析技术领域。具体涉及一种基于高通量固定化酶反应法的尿素检测方法。

背景技术

尿素是人体蛋白质代谢的主要终端产物，其在正常人体的尿液和血液中的正常含量分别为55–388 mM (9.3–23.3 g/L) and 2.5–7.5 mM (0.15–0.4 g/L)。尿素水平的异常是肾衰竭、尿道梗阻、脱水、充血性心力衰竭、休克、重度烧伤和肝脏疾病等的象征。因此，尿素含量的检测成为了检查肾功能的一种最有效而直接的临床诊断和医疗出来的途径。

到目前为止，在实验室中已有各种各样的分析方法被报道用于尿素的检测，比如电化学传感器，分光光度法，流动注射分光光度法，气相色谱法，高效液相色谱法等。对于尿素含量的临床检测，普遍使用的方法是脲酶催化尿素水解并结合比色法和电化学法检测。脲酶催化尿素水解转换为胺盐和碳酸盐。其反应式如下：

(NH₂)₂CO + 2H₂O + H⁺ → 2NH₄ ⁺ + HCO₃

固定化脲酶可以提高酶的稳定性且可重复使用，降低实验成本，并且减少样品的处理和分析时间。固定化酶与电化学检测，热力学检测和可视化检测器结合的各种各样尿素生物传感器已被报道用于尿素的检测。然而，只有少数的生物传感器可以用于定量测定血清、尿液和实际样品中存在的尿素含量。而且医院每天有大量的临床样品需要检测，如何实现尿素的高通量检测成了尿素生物传感器的另一个挑战。

传统的96微孔板法可以实现高通量检测，但其控制酶促反应的操作比较繁琐、试剂用量大，且不能重复使用。因此，开发一种新型的、高通量的、可重复使用的、经济且准确测量尿素的方法，以满足日益增长的肾脏相关疾病临床诊断的需求是迫切需要的。

发明内容

鉴于酶反应在临床检测中的重要地位、商品化的robolid密封板具有的独特的微柱结构和密封性能以及高通量检测技术的优势，我们结合微孔板微柱矩阵和固定化酶两种技术实现对尿素的定量检测。预处理过的robolid微柱表面有带正电荷的PLL-Ba²⁺涂层，可以和酶的包埋材料海藻酸钠（带负电荷）结合形成“egg-box”结构的海藻酸钡凝胶，从而使脲酶固定在微柱表面，形成三维的高通量酶反应器。制备的脲酶传感器可以和已含有待测样品的96微孔板，形成一种夹心结构，通过简单翻转该夹心结构来实现酶反应的启动和停止。通过测量405nm波长下纳氏试剂与酶反应产物的显色产物的吸光度的大小即可对尿素进行定量检测。

本发明制备的新型三维高通量酶反应器优势在于：

1. 采用商业化的robolid密封板作为固定化酶载体，其具有均一的微柱矩阵和良好的密封性（96个5mm直径，5mm高的硅胶微柱），避免了自制微柱的繁琐和不均匀性，同时优良的密封性避免了溶液的挥发和各反应微孔间的交叉污染。

2. 通过简单的密封或开盖，方便地控制高通量酶促反应的开始或停止，避免了传统高通量酶反应器中控制酶促反应的繁琐操作；另一方面，通过酶的固定化实现了酶的重复使用，降低实验成本，经济实用。

3. 本发明制备的新型高通量酶反应器具有三维结构，可以很好的保护酶的结构；另外，该酶反应器具有较好的重复使用性和存储稳定性，且405nm波长下的吸光度和尿素浓度之间成正相关关系可同时实现定性和定量检测。

附图说明

图1是本发明所使用的robolid实物图；

图2是本发明的新型三维高通量酶反应器的制备图；

图3是本发明的高通量脲酶催化水解尿素反应的示意图；

图4是海藻酸钠及壳聚糖浓度和培育时间的优化图；

图5 是本发明的脲酶浓度和酶反应时间的优化图；

图6是本发明的酶反应器的重复使用和存储稳定性的图；

图7是本发明的酶反应器的酶动力学曲线和尿素标准曲线图；

图8 是本发明的实际样品分布图和本发明提出的方法与传统方法的比较图。

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1：

所用的试剂仪器设备来源：

1 Robolids microplate 和96微孔板：西格玛奥德里奇；

2 脲酶、壳聚糖：西格玛奥德里奇（上海）；

3 海藻酸钠：天津市光复精细化工研究所；

4 纳氏试剂、尿素：阿拉丁；

4 高通量移液器：德淙科学仪器有限公司；

5 Epoch2酶标仪：美国伯腾

6 K5600微型紫外-可见分光光度仪：北京凯奥科技发展有限公司。

新型三维高通量酶反应器的制备：

1) Robolids板预处理

将商品化Robolid密封板（96个硅胶微柱，直径5mm/柱，高5mm/柱）密封盖在每孔含有50uL 0.01%(w/v)多聚懒氨酸(PLL)溶液的96-微孔板上，倒置使Robolid每个微柱表面被PLL溶液覆盖，室温下培育30 min， PLL与微柱的硅羟基结合共价吸附到Robolids表面。移走微孔板，用磷酸缓冲溶液清洗Robolid板2次，室温干燥2 h。

使用96通道移液器，在上述处理好的Robolid密封板的每个硅胶微柱上同时滴加30 uL 0.2 M BaCl₂，室温干燥过夜。

2) 尿酶的固定

① 使用96通道移液器在PLL-BaCl₂处理好的Robolids板上同时滴加10 uL 2% 海藻酸钠-7mg/mL尿酶混合液，之后将其密封盖在已含有100 uL/孔 0.1 M BaCl₂溶液的96微孔板上，倒置，在~12℃的恒温箱中凝胶化2 h。然后移走微孔板，用磷酸缓冲溶液洗海藻酸钡凝胶2次。

② 将上述脲酶固定的robolid板密封在已含有100 uL/孔 2%壳聚糖(pH 5.0)的微孔板上，倒置，在~12℃的恒温箱中培育30 min，使壳聚糖（带正电荷）和海藻酸钠（带负电荷）通过静电吸附在海藻酸钡凝胶酶球的表面形成一层聚电解质复合物，减少酶的泄漏。移走微孔板，用磷酸缓冲溶液洗海藻酸钡凝胶3次，并在 4-8 ℃保存，待用。

实施例2：

尿素标准曲线的制作及脲酶动力学的监测

1）用50 mM 磷酸缓冲溶液(pH 7.0)配置一系列不同浓度的尿素标准物质，依次加入微孔板中，用已制备的脲酶固定robolid板密封微孔板，倒置使待测样品与酶接触开始酶反应，在37℃酶反应10 min，然后再倒置使待测样品和酶分离停止酶反应。

2) 24 uL纳氏试剂被分配到上述1)中微孔板的酶个孔中，室温显色反应10 min。

3) 用Epoch2酶标仪检测2）中显色产物，输出405 nm波长下的吸光度值。

4）以405 nm波长下的吸光度值为纵坐标，尿素浓度为横坐标，绘制标准曲线。以尿素转换速率为纵坐标，尿素浓度为横坐标，绘制脲酶动力学曲线。本发明中脲酶Km = 6.30±0.14 mM，如图7所示。而自由脲酶Km = 4.05±0.16 mM，说明本发明的高通量酶反应器没有明显的改变酶结构，也没有影响酶活性位点。

本发明所提出的检测方法其线性范围、检出限和已报道的相近，但响应时间大大减少，如表1所示，在实际应用中，可以大大缩短样品分析时间，对于批量分析样品具有潜在的应用价值。

实施例3：

实际样品检测

取一个尿液样品稀释100倍，加入不同已知浓度的尿素标样，计算加标回收率在95.3%-104%之间，如表2所示。

用本发明所制备的高通量酶传感器器对28个未知浓度的实际尿液样品分别稀释100倍、150倍、200倍进行检测。将吸光度代入标准曲线，所得结果与标准脲酶法测得的结果进行比较，如图8所示，说明该方法具有较高的准确性。

表 1：本发明方法与其它尿素检测方法比较

表 2：人体尿液和超纯水中尿素标准加入测回收率

Claims

1.一种高通量酶传感器的制作方法，其特征是具体步骤如下：

1) Robolids板预处理

将商品化Robolid密封板96个硅胶微柱，直径5mm/柱，高5mm/柱，密封盖在每孔含有50uL 0.01%w/v多聚懒氨酸PLL溶液的96-微孔板上，倒置使Robolid每个微柱表面被PLL溶液覆盖，室温下培育30 min， PLL与微柱的硅羟基结合共价吸附到Robolids表面，移走微孔板，用磷酸缓冲溶液清洗Robolid板2次，室温干燥2 h；

使用96通道移液器，在上述处理好的Robolid密封板的每个硅胶微柱上同时滴加30 uL0.2 M BaCl₂，室温干燥过夜；

2) 尿酶的固定

① 使用96通道移液器在PLL-BaCl₂处理好的Robolids板上同时滴加10 uL 2% 海藻酸钠-7mg/mL尿酶混合液，之后将其密封盖在已含有100 uL/孔 0.1 M BaCl₂溶液的96微孔板上，倒置，在~12℃的恒温箱中凝胶化2 h，然后移走微孔板，用磷酸缓冲溶液洗海藻酸钡凝胶2次；

② 将上述脲酶固定的robolid板密封在已含有100 uL/孔 2%壳聚糖pH 5.0的微孔板上，倒置，在~12℃的恒温箱中培育30 min，使壳聚糖带正电荷和海藻酸钠带负电荷通过静电吸附在海藻酸钡凝胶酶球的表面形成一层聚电解质复合物，减少酶的泄漏，移走微孔板，用磷酸缓冲溶液洗海藻酸钡凝胶3次，并在 4-8 ℃保存。

2.尿素的高通量检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述的酶传感器，包括如下步骤：

1) 将上述脲酶固定化的robolid板密封盖在含有待测样品的微孔板上，然后倒置使待测样品与酶接触启动酶反应，在37℃酶反应10 min，然后再倒置使待测样品和酶分离停止酶反应；

2) 24 uL纳氏试剂被滴加到上述1)中微孔板的酶个孔中，室温显色反应10 min。

3.根据权利要求2所述的方法，采用紫外－可见分光光度法作为检测方法检测，其特征在于，纳氏试剂中的碘离子和汞离子在强碱性条件下，会与酶反应产物氨反应生成淡红棕色络合物，此颜色在波长405nm处会有强烈的吸收，而生成的这类红棕色络合物的吸光度会与其溶液的氨氮含量成正比，可用测试反应液的吸收值而测定氨氮的含量，进而得到尿素的含量。