CN111020004B - 一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法，属于催化检测领域。所述方法为：将脲酶水溶液加入到三丁酸甘油酯与油酸的混合溶液中，震荡静置制得基于脲酶的人工细胞模型；配置磷脂溶液，加入到20～40μL三乙酸甘油酯中，震荡静置30min，制得基于磷脂的人工细胞模型；将两种已经沉降的人工细胞模型震荡，得到混合均匀的两种微乳液，静置除去上清液，即得到具有尿素传感功能的Janus结构人工细胞模型。本发明利用Janus结构人工细胞模型的尿素传感器检测尿素浓度，选择性高、操作简单、方便携带和运输、不需要特殊仪器，检测时间小于1min，数据重现性好，一次制备(1mL人工细胞模型)可供1000次测量，线性检测范围为0.1mg/mL～10mg/mL。
Description
技术领域
本发明属于催化检测领域，具体涉及一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法。
背景技术
在机体物质分解代谢过程中，氨基酸脱氨基作用产生氨，氨在肝脏内经鸟氨酸循环合成尿素，尿素通过血液运输至肾脏，由尿液排出体外。尿素是体内氨基酸分解代谢的最终产物之一，因此测定血液中尿素含量可以了解机体肾功能状况。尿素的测定方法可分为两大类：一是直接法，尿素直接和某试剂作用，测定其产物，最常见的为二乙酰一肟法，此方法利用二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比，利用分光光度计测定其在540nm处的吸收峰值来检测尿素的浓度，此方法所用试剂具有毒性和腐蚀性，且重复性不佳。另一类是尿素酶法，用尿素酶将尿素变成氨，然后用不同的方法测定氨。最常见的方法为用尿素酶分解尿素产生氨，其产物氨在谷氨酸脱氢酶的作用下使NADH氧化为NAD+时，通过340nm吸光度的降低值可计算出尿素含量。此反应是目前自动生化分析仪上常用的测定原理。此外，尿素酶水解尿素产生氨的速率，也可用电导的方法进行测定，其电导的增加与氨离子浓度有关，反应只需要很短的时间，适用于自动分析仪，这些方法样品用量较多，需要专业的尿素分析仪器，成本较高。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有尿素浓度测量方法较为复杂或需要特殊仪器的问题，提供一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法，所述方法步骤如下：
步骤一、基于脲酶的人工细胞模型的制备
(1)水相溶液的配制：将脲酶溶解到去离子水中，配置出5～20mg/mL的脲酶水溶液；
(2)油相溶液的配制：将三丁酸甘油酯与油酸按体积比4：1混合；
(3)将(1)的水相溶液加入到(2)的油相溶液中，利用涡旋震荡仪震荡20～30s，得到水包油的微乳液，静置30min制得基于脲酶的人工细胞模型；
步骤二、基于磷脂的人工细胞模型的制备
(1)磷脂溶液的配置：取40μL磷脂的氯仿溶液(25mg/mL)用氩气将氯仿吹干，加入900μL去离子水和100μL 1mg/mL PVA溶液后用涡旋震荡仪震荡30s，得到磷脂溶液；
(2)取(1)制备的磷脂溶液作为水相溶液，加入到20～40μL三乙酸甘油酯中，利用涡旋震荡仪震荡20～30s，得到水包油的微乳液，静置30min制得基于磷脂的人工细胞模型；
步骤三、Janus结构人工细胞模型的制备
将步骤一和步骤二得到的两种已经沉降的人工细胞模型轻微震荡，得到混合均匀的两种微乳液，各取200μL液体进行充分混合，两种人工细胞模型特异性融合得到具有Janus结构的人工细胞模型，静置30min待Janus结构人工细胞模型完全沉降后将上清液除去以除掉溶解在溶液中的脲酶，加入1mL去离子水，轻微震荡混合均匀，即得到具有尿素传感功能的Janus结构人工细胞模型。
本发明相对于现有技术的有益效果为：本发明利用Janus结构人工细胞模型作为尿素传感器，其中不含任何挥发性或腐蚀性物质，且制备过程简单便于携带，可多次测量。本发明利用Janus结构人工细胞模型的尿素传感器检测尿素浓度，选择性高、操作简单、方便携带和运输、不需要特殊仪器，检测时间小于1min，数据重现性好，一次制备(1mL人工细胞模型)可供1000次测量，并且所需待测样品量低至10μL等优点，线性检测范围为0.1mg/mL～10mg/mL。
附图说明
图1为实施例1得到的脲酶人工细胞模型的共聚焦荧光显微镜图；
图2为实施例1得到的磷脂人工细胞模型的共聚焦荧光显微镜图；
图3为实施例1得到的具有Janus结构的人工细胞模型共聚焦荧光显微镜图；
图4为实施例1得到的具有Janus结构的人工细胞模型的在不同尿素浓度下运动的轨迹图；
图5为实施例1得到的具有Janus结构的人工细胞模型的运动速度与尿素浓度的标准曲线图；
图6为实施例1得到的具有Janus结构的人工细胞模型在尿素浓度为0.1～10mg/mL区间内运动速度与尿素浓度的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
本发明利用磷脂人工细胞模型与脲酶人工细胞模型的特异性融合，制备出了具有Janus结构的人工细胞模型，由于此细胞模型在不同尿素的浓度中具有不同的运动速度，所以此传感器的工作原理是通过检测Janus结构人工细胞模型的运动速度来检测尿素的浓度。尿素浓度检测范围在0.1mg/mL到10mg/mL，最低检测限为3.3×10-5g/mL。此尿素传感器制备过程简单，检测速度快，所用试剂不具有毒性和腐蚀性且体积很小，可多次测量，便于携带和运输，同时所需被检测物质体积很小，可低至10μL，大大降低了样品的用量。
本发明的运动机理：由于该人工细胞的单侧被脲酶所覆盖，能够进行脲酶催化尿素分解出氨气和二氧化碳的反应，形成扩散泳，来推动人工细胞的运动。产物越多，运动越快，因此运动速度与尿素的浓度形成定量关系。
本发明的创新点：(1)利用两种不同膜覆盖的人工细胞模型融合，制备出阴阳结构的人工细胞模型(其中为油相，均匀分布)；(2)利用这种阴阳结构表面的脲酶实现局部催化尿素，从而产生推动力，实现人工细胞模型的运动；(3)该阴阳结构模型的运动速度与溶液中的尿素浓度呈线性关系，从而实现精确快速检测溶液中的尿素浓度；(4)该传感器的检测范围为0.1mg/mL～10mg/mL。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法，所述方法步骤如下：
步骤一、基于脲酶的人工细胞模型的制备
(1)水相溶液的配制：将脲酶溶解到去离子水中，配置出5～20mg/mL的脲酶水溶液；
(2)油相溶液的配制：将三丁酸甘油酯与油酸按体积比4：1混合；
(3)将(1)的水相溶液加入到(2)的油相溶液中，利用涡旋震荡仪震荡20～30s，得到水包油的微乳液，静置30min制得基于脲酶的人工细胞模型；其中模型的尺寸可以通过控制油水比例和涡旋时间来调控；
步骤二、基于磷脂的人工细胞模型的制备
(1)磷脂(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)溶液的配置：取40μL磷脂的氯仿溶液(25mg/mL)用氩气将氯仿吹干，加入900μL去离子水和100μL 1mg/mLPVA溶液后用涡旋震荡仪震荡30s，得到磷脂溶液；
(2)取(1)制备的磷脂溶液作为水相溶液，加入到20～40μL三乙酸甘油酯中，利用涡旋震荡仪震荡20～30s，得到水包油的微乳液，静置30min制得基于磷脂的人工细胞模型；其中模型的尺寸可以通过控制油水比例和涡旋时间来调控；
步骤三、Janus结构人工细胞模型的制备
将步骤一和步骤二得到的两种已经沉降的人工细胞模型轻微震荡，得到混合均匀的两种微乳液，各取200μL液体进行充分混合，两种人工细胞模型特异性融合得到具有Janus结构的人工细胞模型，静置30min待Janus结构人工细胞模型完全沉降后将上清液除去以除掉溶解在溶液中的脲酶，加入1mL去离子水，轻微震荡混合均匀，即得到具有尿素传感功能的Janus结构人工细胞模型，即阴阳两面性结构，其中一侧由磷脂膜覆盖，另一侧有脲酶覆盖，内部油相为均匀的三乙酸甘油酯和油酸的混合物。
本发明制备的尿素传感器具体进行尿素浓度检测时的操作为：取10μL待测样品于载玻片，加入1μL上述尿素传感器，再用显微镜记录十个人工细胞模型的运动轨迹(加入后60s内检测)。用免费软件Image J自动计算Janus结构人工细胞模型的平均运动速度，与标准曲线对比得到待测液体中的尿素浓度。因为脲酶只能选择性的催化尿素，经检测此尿素传感器在非尿素溶液如：DNA溶液、氯化钠溶液、球蛋白溶液中都不具有运动行为，体现了此尿素传感器的选择性。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法，步骤一(3)中，所述水相溶液与油相溶液的体积比为10～20：1。
具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法，步骤二(2)中，所述水相溶液与三乙酸甘油酯的体积比为10：1～2。
实施例1：
一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法，所述方法步骤如下：
一、脲酶人工细胞模型的制备：
脲酶水溶液的配置，将脲酶溶解到去离子水中，配置出10mg/mL脲酶溶液作为水相。将1mL三丁酸甘油酯与0.25mL油酸混合作为油相。取200μL上述脲酶溶液作为水相，加入到20μL上述油相中，利用涡旋震荡仪震荡30s，得到水包油的微乳液，静置30min制得脲酶人工细胞模型。用激光共聚焦显微镜观察其结构如图1。其中油相中溶解有香豆素(0.1mg/mL)，所以紫外光激发条件下，显出绿色荧光；表面的膜结构由脲酶构成，由于脲酶用异硫氰酸罗丹明B标记，所以显出红色荧光。从图中可以看出脲酶人工细胞模型的大小分布均匀，其中脲酶作为膜的构筑基元分布在油水界面上。
二、磷脂人工细胞模型的制备
磷脂(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)水溶液的配置，取40μL磷脂的氯仿溶液(25mg/mL)用氩气将氯仿吹干，加入900μL去离子水和100μL 1mg/mLPVA溶液后用涡旋震荡仪震荡30s得到磷脂溶液。取200μL上述磷脂溶液作为水相，加入到20μL三乙酸甘油酯中，利用涡旋震荡仪震荡30s，得到水包油的微乳液，静置30min制得磷脂人工细胞模型。用激光共聚焦显微镜观察其结构如图2。其中油相溶解有尼罗红(0.1mg/mL)所以紫外光激发条件下，显出红色荧光；而磷脂中混入荧光磷脂(NBD-PC)所以显绿色荧光。从图中可以看出磷脂人工细胞模型的大小分布均匀，其中磷脂作为膜的构筑基元分布在油水界面上。
三、Janus结构人工细胞模型的制备
将上述两种已经沉降的人工细胞模型轻微震荡，得到混合均匀的两种微乳液，各取200μL液体进行充分混合两种人工细胞模型特异性融合得到具有Janus结构人工细胞模型，静置30min待胶囊完全沉降后将上清液除去以除掉溶解在溶液中的脲酶，加入1mL去离子水，轻微震荡混合均匀，得到具有Janus结构人工细胞模型。用激光共聚焦显微镜观察其结构如图3。其中脲酶用异硫氰酸罗丹明B标记显红色，油相无荧光。磷脂未标记不发荧光。从图中可以看出融合后的人工细胞模型具有Janus结构，且稳定性很好，能够保持其结构稳定存在两周以上。
四、尿素浓度的检测标准曲线的测定
标准曲线的绘制：配置浓度为1mg/mL的尿素溶液，取10μL于载玻片，加入1μL上述Janus结构人工细胞模型，用显微镜记录Janus结构人工细胞模型的运动(60s内)。分别配置浓度为0.1、0.5、2、5、10、20、50、100、150、200mg/mL的尿素溶液，并用相同方法记录其运动。Janus结构人工细胞模型在尿素为2、4、6、8、12mg/mL的运动轨迹见图4，可以看出Janus结构的人工细胞模型相同时间下运动路径长度与尿素浓度有关，尿素浓度越大，运动路径越长。用免费软件Image J自动计算Janus结构人工细胞模型的运动速度，测量三次取平均值，绘制运动速度与尿素浓度的关系曲线，见图5，可以看出Janus结构的人工细胞模型的不同运动速度对应的尿素浓度。其中当尿素浓度在0.1mg/mL～10mg/mL之间时，由图6可知在此尿素浓度范围内Janus结构的人工细胞模型运动速度与尿素浓度线性相关，从而能够实现准确检测尿素浓度。
样品的检测：取10μL待测样品于载玻片，加入1μL上述人工细胞模型，再用显微镜记录人工细胞模型的运动轨迹(加入人工细胞模型60s内)。用免费软件Image J自动计算Janus结构人工细胞模型的运动速度，与标准曲线(图6)对比得到待测液体中的尿素浓度。因为脲酶只能选择性的催化尿素，经检测此尿素传感器在非尿素溶液如：DNA溶液、氯化钠溶液、球蛋白溶液中都不具有运动行为，体现了此尿素传感器的特异性检测功能。
Claims (3)
1.一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
步骤一、基于脲酶的人工细胞模型的制备
（1）水相溶液的配制：将脲酶溶解到去离子水中，配置出5~20 mg/mL的脲酶水溶液；
（2）油相溶液的配制：将三丁酸甘油酯与油酸按体积比4：1混合；
（3）将（1）的水相溶液加入到（2）的油相溶液中，利用涡旋震荡仪震荡20~30 s，得到水包油的微乳液，静置30 min制得基于脲酶的人工细胞模型；
步骤二、基于磷脂的人工细胞模型的制备
（1）磷脂溶液的配置：取40 µL 25 mg/mL磷脂的氯仿溶液用氩气将氯仿吹干，加入900µL去离子水和100 µL 1 mg/mL PVA溶液后用涡旋震荡仪震荡30 s，得到磷脂溶液；
（2）取步骤二（1）制备的磷脂溶液作为水相溶液，加入到20~40 µL三乙酸甘油酯中，利用涡旋震荡仪震荡20~30 s，得到水包油的微乳液，静置30 min制得基于磷脂的人工细胞模型；
步骤三、Janus结构人工细胞模型的制备
将步骤一和步骤二得到的两种已经沉降的人工细胞模型轻微震荡，得到混合均匀的两种微乳液，各取200 µL液体进行充分混合，两种人工细胞模型特异性融合得到具有Janus结构的人工细胞模型，静置30 min待Janus结构人工细胞模型完全沉降后将上清液除去以除掉溶解在溶液中的脲酶，加入1 mL去离子水，轻微震荡混合均匀，即得到具有尿素传感功能的Janus结构人工细胞模型。
2.根据权利要求1所述的一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法，其特征在于：步骤一（3）中，所述水相溶液与油相溶液的体积比为10~20：1。
3.根据权利要求1所述的一种具有Janus结构人工细胞模型的尿素传感器的制备方法，其特征在于：步骤二（2）中，所述水相溶液与三乙酸甘油酯的体积比为10：1~2。
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