JPS5856700A - 固定化酵素―微生物複合膜および尿素センサとこの尿素センサを使用する尿素定量法並びに尿素センサの保存法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、＃素および微生物を利用して、尿素を電気化
学的に定量する方法に関するものである。

体液中の尿素ｍｉｉ素＃ＩｋｌＩＬは医療検査分野にお
いて。

腎機能の指標とされてきたが、近年、腎疾患の治療とし
て人工透析が広く行なわれるようになった丸め、透析治
療中に腎機能をモニタリングするための、正確、簡便か
つ迅速な尿素の定量法が強く登訪されている。

初期の尿素定量法は、尿素と他の有機物を反応させ１発
色させて定量する方法であったが、Ｒｋ近ではこれに代
わるより正確な方法として、ウレアーゼを用いる＃票決
が行なわれている。この方法は尿素にウレアーゼを作用
させ、アンモニアを生成させて、このアンモニアを何ら
かの方法で定量するというものである。アンモニアの定
量法としては、インドフェノール反応やネスツー反応を
利用する方法もあるが、最も広く行なわれているのは、
グルメンン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬ、ＤＨ）及びニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を組み
合わせた酵素複合法である。

この方法は、アンモニアを下式 ＮＡＤＨ十ＮＨ４＋α−ケトゲルタール酸−−−→ＮＡ
Ｄ＋グルタミン酸十Ｈ２０゜ の反応を利用して、ＮＡＤＨの消費量を比色によシ測定
する方法であるが、この方法は。

１）体液のような着色試料をそのｉま使うことはできな
い。

２）除蛋白を行なう必要があシ、操作が煩雑で時間がか
かる。

３ン高価な＃素を使い捨てにするために経済的でない。

などの欠点がある。

これらの欠点を＃ＰＷｉＩｔする九め、酵素を固定化し
、’１Ｍ電極あるいはガラス電極を利用して゛アンモニ
アを測定する方法も試みられているが、′ガラス電極の
場合、体液中のＮａ　　イオン、にイオンの影蕃をうけ
るという欠点がある。また−電極の場合は、ガス状のア
ンモニアを測定スルので、アンモニアをガス化させるた
・め被検液をＰＨ／／以上にしなければならず、酵素反
応の至適−と異なるので１反応部分と測定部分を分離し
なければならないという欠点がある。さらに−電極を用
いるものは揮発性アミンの影響をうけやすいという欠点
もＦハ実用化されるに至っていない。

本発明は上記の問題および欠点を解決するためのより簡
便、正確、迅速かつ安価な尿素定量法を提供することを
一般的な目的とする。

本発明者尋は、上記目的を達成するため、尿素定量法に
ついて鋭意研究を重ねた結果、尿素を分解しアンモニヤ
を生成させる＃票（ウレアーゼと、アンモニアのみを選
択的に版化する微生物系硝化菌）とを固定化した固定化
酸素−微生物複合膜を溶存酸素電極の隔膜に密着させ、
半透膜で被覆して構成した尿素センナを被検液に接触さ
せれば、それによって生ずる前記電極電流の減少量′ｆ
ｔ測定することによ多被検液中の尿素を正確、迅速かつ
簡便に定量しうることを突き止め喪。

したがって、本発明の主たる目的は、慣用の溶存酸素電
極における酸素電極隔膜と半透膜との間に、酵素ウレア
ーゼを固定した＃素膜に硝化菌菌体を固定化し之多孔質
膜を密着させてなる固定化＃素−微生物膜を前記多孔質
膜が前記隔膜に密着するよう介装し、これを前記牛透属
で被覆してなる゛尿素センチを尿素含有の被検液と接触
させ、前記酸素電極の出力電流の減少値を測定し、この
糊定飯が被検液中の２ｍ含有量に比例することを特徴と
する尿素定量法を提供する仁とにある。

さらに、本発明の目的は、支持体と、支持体内１１に充
填された電解液と、アノードと、カソードと、酸素電極
用隔膜と、この隔膜を覆う半透膜とからなる溶存酸素電
極において、ｆＩｉ索ウレアーゼを固定化した＃素膜に
硝化薗菌体瞥固定化した多孔質膜を密着させてなる固定
化酵素−黴生物禎合膜を前記酸素電極用隔膜と前記半透
膜との間に、微生物担持の前記多孔質膜側が前記電極隔
膜に密着するよう介装し、これを前記半透膜で被覆して
なる。尿素定量法に尿素センナとして使用する溶存酸素
電極を提供することである。

さらに他の本発明の目的は、尿素をアンモニアと炭酸と
に分解する酵素ウレアーゼを固定化した酵素膜と、アン
モニアを資化して酸素な消費する硝化＊＊体を固定化し
た多孔質膜とからなり、前記酵素膜と前記多孔質膜とを
密着させてなる、尿素定量法に使用する同定化＃嵩−黴
生物被合膜を＃！供するにある。

上記の尿素定量法において、尿素含有の試料を抗生物質
を含有する緩衝液で所定談度範８に希釈して−７０また
Ｈｔ、ｏの被検液ｔ−調製すれば、固定化酵素−微生物
複合膜の活性および選択性を高めうるので好適である。

さらに、上記の尿素定量用溶存険素電極において、電極
を使用しない間はこれを抗生物質を含有する一１０緩衝
液中に常時通気しながら浸漬保存すれば、固定化酵素−
微生物複合、膜の活性を安定化かつ長期間持続させうる
ので好適である。

本発明による方法は、以下の原理に基づくものである。

まず、尿素はウレアーゼによシ下式（１）に従ってアン
モニアと炭酸とく加水分解される。

ζこで用い友＃素ウレアーゼは尿素に特異的に作用する
ので、被検液中の他の物質からアンモニアが生成される
ことはない。生成したアンモニア祉硝化曹によシ亜硝酸
、硝酸へと酸化される。アンモニアを亜硝酸ＫＩＩ２化
するのはニドｐソモナス（Ｎｉｔｏｒｏｓｏｍｏｎｅｓ
　）属であり、亜硝酸を硝１［Ｋ酸化するのはニトロバ
クタ−（Ｎ１ｔｏｒｏｂａａｔｏｒ　）属である。

−ＮＭ、＋７０．””シつ−ｖ−＋ｘｘ酬ＪＨＮＯ，＋
ＪＨ２０ＪＨＮＯ＋０　　””バクター！ＬＪＨＮＯ！
２！１ この酸化過程の進行によ〕生じる・溶存１１票電極近傍
Ｏ１！素換度の減少をζめ電極の減少値として測定し、
被検液中の尿＊ｌｌＫを動棚する。

この出力電流の減少値は被検液中の尿素濃度に比例する
ので、尿素を定量することができる。

本発明の尿素センナに用いる溶存酸素電極はボーラロ型
、ガルバニ型のいずれでもよく、−穀に市販されている
ものを用いることができる。

また、この尿素セン？における同定化＃素−黴生物複合
属に用いる硝化菌は活性汚泥中の硝化層から口し、常温
にて培養しえものである。

硝化菌はアンモニアの酸化過程からエネルギーを得、炭
酸及び炭ｒＩｌ塩をＩｉｅ素源とする独立栄養細菌であ
る。従って培養にはアンモニウム塩。

十分な空−（ＣＯ，，０，）、栄養塩、水が必要である
が、有機物は不要である。硝化菌は有機酸を自ら合成し
ているため代謝物質としての有機隼が培地中に存在して
いる。この有Ｉｉ！酸を資化する菌が混在するとアンモ
ニアに対する選択性が低下するので雑菌の止育を妨げる
条件たとえば−を１．０にするなどの方法で培養するか
、ま九社雑菌の生育を阻害する抗生物質を培地に添加す
る必要がある。また硝化菌は液体培地中で。

浮遊状態では生育が困難であるので、菌の担体として菌
の生育に無害な無機物質たとえば脚数カルシウム粉床を
添加することができる。

このように培養した十分活性のある硝化菌を多孔性の薄
膜に吸着固定する。ここで使用する薄膜としては、硝化
ＩＩを通過させず、アンモニアと識索を自由に通過させ
、か２吸着固定化に耐える強度を有する膜であればいか
なる薄膜でもよく、たとえＩｄｉリポアフィルタなどの
多孔性膜、たとえばテフロン膜などのガス透過性膜を使
用することができる。また場合によっては。

酵素を固定化した膜の一外面に菌体を直接吸着させる仁
とも可能である。なお、薄膜への゛硝化菌の固定化法は
活性が十分保持されるｌａ！？、’尚分野で周知され九
任意の方法を用いることができる。

さらに、上記複合膜の他方の構成ｌＬＩ索である固定化
ウレアーゼ属は以下の方法に・て作成できる。

本発明で使用する酵素ウレアーゼ（Ｅ、Ｃ，よよｌｊ）
は臨床検査用として一般に市販されている亀ので十分使
用可能である。ウレアーゼを固定化する膜は親水性かつ
尿素を自由に透過させる半透膜で、電極に執着した場合
の強度及゛び安定性が良好であれば任意のものを使用す
ることができ％九とえば塩化ビニル膜に酵素を物塩的吸
着させ九膜九とえばトＩＪア建ン膜をグルタルアルデヒ
ド処理し、これに＃素を共有結合させて固定化し九膜、
たとえばコラーゲンと酵素を混合して成膜し死後グルメ
ルアルデヒドを用いて＃素とコラーゲンを架橋した膜な
どを例として挙げることができる。なお、＃素固定化用
の半透膜ならびに固定化法に関しては酵素活性が十分保
持され安定である限シ、この分野で周知の゛いかなる技
術をも用いる仁とができる。

このようにして作成した固定化＃素膜を前記菌体固定化
膜の外側に密着させ、固定化酵素−微生物複合膜を調製
する。この固定化酵素−微生物複合膜の菌体側が溶存酸
素電極表面に密着するよう電極に装着し、これを半透膜
で被覆して０−リングで固定する。かくして本発明によ
る尿素センナが得られゐ。

上記のように構成した尿素センサを用いて以下のように
尿素を定量する。

尿素セン？を尿素被検液に浸漬、接触させると、被検液
中の尿素が尿素センサの最外層の半透膜を通して複合膜
中に拡散し、尿素は＃素の作、用によシアンモニアと炭
酸に分解゛される。アン−％＝７は次いで硝化層に拡散
して陵化され、ｌ１票電極近傍の掛存ｌｌ素が消費され
る。この浴存象素０減少量を電極の出力電流の減少値と
して測定する。固定化酵素と固定・化菌体の活性が尿素
の拡散量に比較して十分−ければ、測矯値と被検液の尿
ｌＡ濃度との間に所定淡度範囲中比例関係が成立するの
で、被検液中の尿素濃度を容１４　Ｋ　ＩＩＪ定できる
。このような比例関係′を得るには酵素活性が十分高く
、かつ安定に固定化されている必畳があり、さらに固定
化・硝化菌の活性も十分保持されなければならない。こ
の丸め被検液を緩衝液にて−７またはｐＨＩｔ／Ｃ維持
し、かつ緩衝液に雑菌の生育を妨げる抗生愉質たとえば
クロロマイセチ／を含有させることで簡便に行なわれる
。なお、ｐＨ７の緩衝液は０．　／　Ｍ　１７ン酸緩衝
液、ＰＨｔｃｏ緩衝液は０．０／Ｍホウ酸ナトリウム緩
衝液を用いることができる。

さらに、　ＩＩＩ定を行なわない時には、雑菌の成育を
、妨げ酵素活性に悪影畳のない条件、九とえば−ｌクロ
ロマイセチン／ａｌｌ／ｌ、　ｏ、ｏｔＭホク酸ナトリ
クム緩衝液で常時通気しながら、この中に尿素センナを
浸漬することによシ固定化酵素−微生物複合属の活性を
安定に保つことができる。

以下実施例によｐ本発明を説明する。

実施例／ 硝化菌の培養は、下記第１表に示す組成の培ｊを使用し
、常法によｐ行った。

ただし、培地には菌担体としてＣａ　ＣＯＢ粉末を毎週
ｏ、ｚｇの割合で橋脚し、　ｉ　Ｍ　Ｎｍ、Ｃｏ、によ
シＰＨｔに保持し友、なお、培養条件は、温度１０℃、
通気量／ｌ００ｍ／ｍ１ｔｔで振とうは行なわず、固定
化にはｌケ月以上培養を継続したものを用い九、このよ
うな条件で培養され、十分活性のある硝化菌を次のよう
な方法で固定化した。

アセチルセルロース製メンズ２ンフイ〃り（孔径０．４
１１μｍ東洋Ｐ紙）を吸引ビンに毎ツトし蒸留水で洗浄
する０次いで吸引によｐ硝化薗懸濁液乙１を流過させて
アセチルセルロース膜に菌体を吸着させ、ｐＨＩ、０．
０／Ｍホウ酸ソーダ緩衡液１０ｄｌｌＣて洗浄した後、
・この膜を白金電極面を十分被覆する程度の大きさに切
断する０次に、この実施例で使用した固定化酵素膜につ
いて説明する。

固定化に用いた膜は塩化ビニルｇ（三菱油化製）で、Ｉ
Ｌ水性多孔質膜である。この膜は成膜稜蒸留水中に浸漬
保存されている。これを硝化藺固定化属と同じ大きさに
切断し、１１１表面の水を拭き取った後吸引びん上で吸
引しながら、ウレアーゼ（メルク社製、ＪＵ／ｑ）コ９
を膜上にのせる。ウレアーゼは膜中に含有されている水
に溶解し、膜中へと浸透する。この後５〜１０分間で＊
ａ乾燥し、膨満時の約１１％に収縮する。この収縮は不
可逆で再び膨潤しても元の大きさには戻らない。従って
、！Ｉ１１孔中に浸透した酵素は膜孔の収縮によ多孔外
への脱落が困難となる。このようにしてＩＩ製した固定
化酵素膜をｐｋｉ７，０．１Ｍリン酸緩衝液中に浸漬し
、表面に吸着している酵素を洗い、上記の菌体膜のアセ
チルセルロース側に密着させて酵素−黴生物複合膜とす
る。

このように作成した複合膜を用いて構成される尿素セン
サについて添付図面によ〕説明する。

第１図は、ガルバニｍ溶存駿素電極を用いた尿素センナ
を示してあシ、溶存酸素電極は支持体ｉｏ、そこに充填
された電解液（Ｊ（７９１ＧＮａＯＨ）１２、鉛７ノー
ド／４ｔ、白金カンード／４．及び歇素電極用隔膜／Ｉ
から構成される。この隔膜ｌｒ上に上記のように調製し
た酵素−徹生物複合属コＯ，ココの菌体個を密着させる
と共に酵素膜側を最外層の透析膜（８ＰｉＣＴＲＡＴＯ
ＲメンプレンチニービングＡＪ）Ｊ参で被扱し１０−リ
ングコ４で前記支持体１ｏｔ１ｃ固定して。

尿素竜ンサコｔｔｖｓ成する。

次に、本尭＠Ｏ尿素センサーｌを連続使用する方式につ
いて第２図によシ説明する０本発明の電極は、この連続
使用方式のみに限定さｔＬるものでなく、バッチ方式で
も使用しうろことは勿論である。

第一図において、ｌｌ素によル飽和されたキャリヤ液Ｊ
ＱをベリスメボンプＪ１で測定用フローセル！＋’内に
流速ｌ畔／ｍ　ｉｌｌで通液し、記罎針Ｊ１のベースツ
インが一定になったことを確認した後にサンプル注入口
Ｊｔに尿素を含有する被検液１００μｔを約コＯμｌ／
ｍ・Ｃの流速で注入する。なお、キャリヤ液としてｐｋ
ｌ？、０．１Ｍ（Ｑリン酸緩衝液を用いておｐｌこれに
ａ１票を飽和するには。

たとえば空気注入口ａＯよル通気させて行う仁とができ
る。サンプル注入口Ｊｔよシ注入された被検液は、キャ
リヤ液Ｊ０によｐ約−０倍に希釈されて、７０−セルＪ
ＩＣｔ流過し、その間に尿素の分解反応が開始され、電
流値は減少し。

約２分後に極小電流値が得られる。さらに通液を継続す
ると電流値線増加し、参〜Ｉｊ分螢にベース電流値に復
帰する。しかる後に新たに被検液を注入することがで龜
、連続測定ができる。

また予め既知濃度の尿素標準液により、尿素濃度と電流
減少値との比例関係と検量しておけば未知濃度の被検液
の尿素＃１１度を簡単に決定することができる。なお、
キャリヤ液Ｊ０と測定用７０−セル３４Ｉ−は、恒温槽
４ｃ−で３０℃に保った。

この定量法で尿素！〜ｊ　Ｏｑ／ｄｌの範囲で作成した
検量線を第３図に示す。縦軸は出力電流値をμムで示し
、横軸は尿凛績度を■／ｄｌで示す、第３図かられかる
ように、出力電流値は尿素員度に対しｊ　−Ｊ　ｏ　Ｉ
ＩＪｉＦ／ｌｉｔの範囲で良好な直線関係を示す。

次に、尿素センサの至適−を知るため、キャリヤ液の−
を６．０−１．７の範囲で変え、尿゛素凝Ｉｊコｊダ／
ｌ　Ｏ標準液を注入して−と測定値の関係を調べ、結果
を第参図に示す、ＰＨ７及びＰＨｒでは尿素センサの測
定値が実用に十分供しうる大きさとなったので、キャー
リヤ液はＰＨ７またはＰＨｔのいずれでも使用できる。

さらに、尿素センナの選択性について検討し良。尿素員
度コ！Ｑ／ｄｌの標準液に、血中に含有されている各成
分を血中の約５倍の課度で添加した後、被検液と添加前
の２！ダ／ｄｊの標準液を用い、それぞれの測定値を比
較した。結果を下記第２表に示す。

菖Ｊｉｌ　　尿素センナの選択性 （単位ｎム） この結果から判るように、各種成分の添加による測定値
への影餐はほとんど認められなかつ九。

また、尿素センサは、わずかな活性低下はみ。

られるもののコ週間以上再使用可能であった。

実施例コ この実施例は、＃索をコラーゲン膜に固定化する具体例
を示す。

固定化微生物膜は実施例１と同様にして作成し。

固定化酵素膜はコラーゲンに＃素を゛固定化して用いた
。ここで用いた酵素固定化コラーゲン膜は以下のように
作成した。

十分精製したコラーゲン０．１ｇｂＩＩＩＩＩに酵素を
０、０　Ｊ　％になるように添加し、攪拌した後ガラス
板上に展開した。これを１℃、で１０時間風乾燥した後
、０．１−グルメルアルデヒドで４通し、ａ、１Ｍ、Ｐ
Ｈ７のりン駿緩ｔｒｉｌにて洗浄し九゛、この固定化酵
素膜と固定化微生物膜とを用いヤ、。

実施例１と同様に尿素センナを構成し九。このセンナを
用い、バッチ式で尿素の定量を行なつ九、バッチ式での
捌定法を嬉！図で説明する。

尿素センサコｔを−７の０．　／　Ｍ　９・ン酸緩衡液
＃参中に浸漬した。前記リン酸緩衡液参参は空気注入日
参４よシ空気を通気することにより、酸素を飽和させる
ことができる。！グネチツクスｌ−ラ参１によｐ攪拌を
行ない、尿素センサコｒＫｔａ絖した記鍮計１０により
、ベース電流値が安定になつ九ことを確認した後、サン
プル注入口Ｉコより被検液を注入した。被検原線前記り
ン酸緩衝液≠ｌで２０倍に希釈される。被検液の注入後
電極電流値は減少しはじめ、数分後に定常状態に達する
。この定常電流値と被検液注入前のベース電流値との差
金測定値とし。

被検液の尿素濃度と対応させる。なお、このシステムは
恒温槽ｊ４’により常時Ｊ０℃に保持した。

この尿素定量法で定量し大尿素濃度と比色法（ジアセチ
ルモノオキシム法）で定量した尿素１ｌ１１ｔＬの相関
関係を＃Ｉ４図に示す、縦軸には尿素センナで定量した
尿素濃度、横軸にはジアセチルモノオキシム法で定量し
九尿素１１１度をダ／ｄ／で示す、相関係数は０．２７
であＬ比色法の測定値と４ｊＬ好な一致が認められた。

上記本発＠によれば、以下に列記する効果および利点が
得られる。

１）アンモニアを特異的に資化する微生物、硝化菌とウ
レアーゼを組み合わせた丸め、尿素七ンｔとしての選択
性が高まる。

２）＃素を固定化して用いたため、定量が安価に行なえ
る。

５）酵素−微生物複金属を溶存酸素電極に装着し、溶存
酸素電極の電流値ｔｌｌＪ定する方法をとったことによ
ｐ、簡便に定量が行なえる。

４）抗生物質を含有する緩衝液で被検液の希釈を行う仁
とによｐ、感度が脆くかつ安定な尿素センサが得られる
。

５）尿素センサを使用しない時、抗生物質を含有するｐ
ｉ（ｔ　、　１．　ｊの緩衝液中に常時通気″して保存
することによル、長期間安定でかつ連続使用可能な尿素
センナが得られる。

なお５本発明は、血清、Ｒ中の尿素濃度を定量するばか
プでなく全血を用いて測定することも可能であＬ　ｔた
測定後のセンサの洗浄、測定値の記憶装置などを備える
ことによル自動計欄用にも応用で畷ることが了解されよ
う。

【図面の簡単な説明】

纂１図は本発明の尿素センナの正面断面図。 第Ｊ図は尿素センサを用いた尿素定量連続使用掬定法に
よる尿素濃度と出力電流の関係を示すグラフ、第参図は
連続測定法におけるキャリヤ液の−と出力電流値との関
係を示すグラフ、第３図はＸ＊センサを用いるパッチ法
のシステム管示すプｐツク図、＃Ｉｔ図紘メツチ法にお
ける尿素定量値と比色法（シアチルモノオキシム法）Ｋ
よる尿素定量値の相関関係を示すグラフである。 ｉｏ川用持体　　　　　ｌコ…電解液 １４Ｉ−・・・鉛アノード　　　ｌ≦・・・白金カソー
ドコ弘・・・透析膜　　　　　　コ４・・・Ｏ−リング
コｔ・・・尿素センサ　　　ＪＯ−・・キャリヤ液Ｊ、
２・・・ボンダ＃・・・７０−セルＪ４・・・記録計　
　　　　Ｊｆ・・・サンプル注入口重・・・空気注入口
　　　＃１・・・恒温檜杯・・・緩衝液　　　　　４ｃ
６・・・空気注入口ｊコ・・・サンプル注入口　！ダ・
・・恒温槽特許出願人　　富士電機製造株式、傘社同　
　　　弁理士　門　奈　　　清 ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ 尿素　　　ｍ％１ ＦＩＧ、４ Ｈ ＦＩＧ、５ ０ ＦＩＧ、６

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　尿素をアン４ニアと炭酸とに分解する酵素ウ
   レアーゼを固定化した酵素膜と、アンモニアを資化して
   酸素を消費する硝化薗菌体を固定化し九多孔質属とから
   なシ、前記酵素膜と前記多゛孔質属とを密着させてなる
   。尿素定量法に１１！期する固定化酵素−黴生物複合膜
   。
2. （２）支持体と、支持体内部に充填され九電解液と、ア
   ノードと、カソードと、酸素電極用隔膜と。 この隔膜を覆う半透膜とからなる溶存酸素電極において
   、＃素つレアーゼを固定化した酵素膜Ｋ１１ｌ化曹曹体
   を同定化し九多孔質膜を密着させてなる固定化酵素−徹
   生物砿合属を、前記酸素電極用隔膜と前記半透膜との間
   に、微生物担持Ｏ前記多孔質真情が前記電極隔膜に密着
   するよう介装し、これを前記半透膜で被覆してなる、尿
   素定量法に尿素センナとして使用する溶存酸素電極。
3. （３）　　慣用の溶存酸素電極における酸素電極隔膜と
   半透膜とＯ関に、＃素つレアーゼを固定した酵素膜に硝
   化曹菌体を固定化した多孔質膜を密着させてなる固定化
   酵素−微生物膜を、前記多孔質膜が前記隔膜に密着する
   よう介装し、これを前記半透膜で被扱してなる尿素セン
   ナを尿素含有の被検液と接触させ、前記酸素電極の出力
   電流の減少値を測定し、この測定値が被検液中の尿素含
   有量に比例することを特徴とする尿素定量法。
4. （４）　　特許請求の範囲第３項記載の尿素定量法Ｋｔ
   ｉＰいて、尿素含有の試料を抗生物質を含有する緩衡液
   で所定ａ度範１！ＩＫ希釈して−？：０ｔた杜−１，０
   の被検液を調製し、ヒれを用いて同定化酵素−黴生物複
   合属の活性および選択性を高めることを％ｌ［とする尿
   素定量法。
5. （５）支持体と、支持体内部に充填された電解液と。 アノードと、カソードと、酸素電極用隔膜と、この隔膜
   を楓う半透膜とからなり、酵素ウレアーゼを固定化した
   ＃素膜に硝化菌菌体を固定化した多孔質膜を密着させて
   なる固定化Ｗ＃素−微生物複合属を、前記酸素電極用隔
   膜と前記半透膜との間に、微生物担持の前記多孔質膜側
   が前記電極隔膜に密着するよう介装し、これを前記半透
   膜で被覆してなる尿素定量法に尿素センナとして使用す
   る溶存Ｗｋ素電極を保存するに際し、前記電極を使用し
   ない間、抗生物質を含有するＰＨ１の緩衝液中に常時通
   気しながら浸漬保′存し。 それによｐ固定化酵素−徹先物複合膜の活性を安定化か
   つ長期間持続させることを特徴とする電極の保存法。