JPH0221543B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、酵素および微生物を利用して、尿素
を電気化学的に定量する方法に関するものであ
る。体液中の尿素態窒素濃度は医療検査分野にお
いて、腎機能の指標とされてきたが、近年、腎疾
患の治療として人工透析が広く行なわれるように
なつたため、透析治療中に腎機能をモニタリング
するための、正確、簡便かつ迅速な尿素の定量法
が強く要請されている。 初期の尿素定量法は、尿素と他の有機物を反応
させ、発色させて定量する方法であつたが、最近
ではこれに代わるより正確な方法として、ウレア
ーゼを用いる酵素法が行なわれている。この方法
は尿素にウレアーゼを作用させ、アンモニアを生
成させて、このアンモニアを何らかの方法で定量
するというものである。アンモニアの定量法とし
ては、インドフエノール反応やネスラー反応を利
用する方法もあるが、最も広く行なわれているの
は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GLDH）
及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NADH）を組み合わせた酵素複合法である。こ
の方法は、アンモニアを下式 NADH＋NH⁺ ₄＋α−ケトグルタール酸GLDH ――――→ NAD＋グルタミン酸＋H₂O₂ の反応を利用して、NADHの消費量を比色によ
り測定する方法であるが、この方法は、 １ 体液のような着色試料をそのまま使うことは
できない、 ２ 除蛋白を行なう必要があり、操作が煩雑で時
間がかかる、 ３ 高価な酵素を使い捨てにするために経済的で
ない、 などの欠点がある。 これらの欠点を排除するため、酵素を固定化
し、PH電極あるいはガラス電極を利用してアンモ
ニアを測定する方法も試みられているが、ガラス
電極の場合、体液中のNa⁺イオン、K⁺イオンの
影響をうけるという欠点がある。またPH電極の場
合は、ガス状のアンモニアを測定するので、アン
モニアをガス化させるため被検液をPH11以上にし
なければならず、酵素反応の至適PHと異なるの
で、反応部分と測定部分を分離しなければならな
いという欠点がある。さらにPH電極を用いるもの
は揮発性アミンの影響をうけやすいという欠点も
あり、実用化されるに至つていない。 本発明は上記の問題および欠点を解決するため
のより簡便、正確、迅速かつ安価な尿素定量法を
提供することを一般的な目的とする。 本発明者等は、上記目的を達成するため、尿素
定量法について鋭意研究を重ねた結果、尿素を分
解しアンモニヤを生成させる酵素（ウレアーゼ
と、アンモニアのみを選択的に酸化する微生物系
硝化菌）とを固定化した固定化酵素−微生物複合
膜を溶存酸素電極の隔膜に密着させ、半透膜で被
覆して構成した尿素センサを被検液に接触させれ
ば、それによつて生ずる前記電極電流の減少量を
測定することにより被検液中の尿素を正確、迅速
かつ簡便に定量しうることを突き止めた。 したがつて、本発明の主たる目的は、慣用の溶
存酸素電極における酸素電極用隔膜と半透膜との
間に、酵素ウレアーゼを固定した酵素膜に硝化菌
菌体を固定化した多孔質膜を密着させてなる固定
化酵素−微生物複合膜を前記多孔質膜が前記隔膜
に密着するよう介装し、これを前記半透膜で被覆
してなる尿素センサを尿素含有の被検液と接触さ
せ、前記溶存酸素電極の出力電流の減少値を測定
し、この測定値が被検液中の尿素含有量に比例す
ることを特徴とする尿素定量法を提供することに
ある。 さらに、本発明の目的は、支持体と、支持体内
部に充填された電解液と、アノードと、カソード
と、酸素電極用隔膜と、この隔膜を覆う半透膜と
からなる溶存酸素電極において、酵素ウレアーゼ
を固定化した酵素膜に硝化菌菌体を固定化した多
孔質膜を密着させてなる固定化酵素−微生物複合
膜を前記酸素電極用隔膜と前記半透膜との間に、
微生物担持の前記多孔質膜側が前記酸素電極用隔
膜に密着するよう介装し、これを前記半透膜で被
覆してなる、尿素定量法に使用する尿素センサを
提供することにある。 さらに他の本発明の目的は、尿素をアンモニア
と炭酸とに分解する酵素ウレアーゼを固定化した
酵素膜と、アンモニアを資化して酸素を消費する
硝化菌菌体を固定化した多孔質膜とからなり、前
記酵素膜と前記多孔質膜とを密着させてなる、尿
素定量法に使用する固定化酵素−微生物複合膜を
提供するにある。 上記の尿素定量法において、尿素含有の試料を
抗生物質を含有する緩衝液で所定濃度範囲に希釈
してPH7.0または8.0の被検液を調製すれば、固定
化酵素−微生物複合膜の活性および選択性を高め
うるので好適である。 さらに、上記の尿素センサにおいて、尿素セン
サを使用しない間はこれを抗生物質を含有するPH
８の緩衝液中に常時通気しながら浸漬保存すれ
ば、固定化酵素−微生物複合膜の活性を安定化か
つ長期間持続させうるので好適である。 本発明による方法は、以下の原理に基づくもの
である。 まず、尿素はウレアーゼにより下式（）に従
つてアンモニアと炭酸とに加水分解される。 ここで用いた酵素ウレアーゼは尿素に特異的に
作用するので、被検液中の他の物質からアンモニ
アが生成されることはない。生成したアンモニア
は硝化菌により亜硝酸、硝酸へと酸化される。ア
ンモニアを亜硝酸に酸化するのはニトロソモナス
（Nitorosomonas）属であり、亜硝酸を硝酸に酸
化するのはニトロバクター（Mitorobactor）属
である。 2NH₃＋30₂ニトロソモナス属 ――――――――→ 2HNO₂＋2H₂O 2HNO₂＋O₂ニトロバクター属 ――――――――→ 2HNO₃ この酸化過程の進行により生じる溶存酸素電極
近傍の酸素濃度の激少をこの電極の減少値として
測定し、被検液中の尿素濃度を計測する。この出
力電流の減少値は被検液中の尿素濃度に比例する
ので、尿素を定量することができる。 本発明の尿素センサに用いる溶存酸素電極はポ
ーラロ型、ガルバニ型のいずれでもよく、一般に
市販されているものを用いることができる。 また、この尿素センサにおける固定化酵素−微
生物複合膜に用いる硝化菌は活性汚泥中の硝化層
から採取し、常温にて培養したものである。硝化
菌はアンモニアの酸化過程からエネルギーを得、
炭酸及び炭酸塩を炭素源とする独立栄養細菌であ
る。従つて培養にはアンモニウム塩、十分な空気
（CO₂，O₂）、栄養塩、水が必要であるが、有機物
は不要である。硝化菌は有機酸を自ら合成してい
るため代謝物質としての有機酸が培地中に存在し
ている。この有機酸を資化する菌が混在するとア
ンモニアに対する選択性が低下するので雑菌の生
育を妨げる条件たとえばPHを8.0にするなどの方
法で培養するか、または雑菌の生育を阻害する抗
生物質を培地に添加する必要がある。また硝化菌
は液体培地中で、浮遊状態では生育が困難である
ので、菌の担体として菌の生育に無害な無機物質
たとえば炭酸カルシウム粉沫を添加することがで
きる。 このように培養した十分活性のある硝化菌を多
孔性の薄膜に吸着固定する。ここで使用する薄膜
としては、硝化菌を通過させず、アンモニアと酸
素を自由に通過させ、かつ吸着固定化に耐える強
度を有する膜であればいかなる薄膜でもよく、た
とえばミリポアフイルタなどの多孔性膜、たとえ
ばテフロン膜などのガス透過性膜を使用すること
ができる。また場合によつては、酵素を固定化し
た膜の一外面に菌体を直接吸着させることも可能
である。なお、薄膜への硝化菌の固定化法は活性
が十分保持される限り、当分野で周知された任意
の方法を用いることができる。 さらに、上記複合膜の他方の構成要素である固
定化ウレアーゼ膜は以下の方法にて作成できる。 本発明で使用する酵素ウレアーゼ（E.
C.3.5.1.5）は臨床検査用として一般に市販されて
いるもので十分使用可能である。ウレアーゼを固
定化する膜は親水性かつ尿素を自由に透過させる
半透膜で、電極に装着した場合の強度及び安定性
が良好であれば任意のものを使用することがで
き、たとえば塩化ビニル膜に酵素を物理的吸着さ
せた膜たとえばトリアミン膜をグルタルアルデヒ
ド処理し、これに酵素を共有結合させて固定化し
た膜、たとえばコラーゲンと酵素を混合して成膜
した後グルタルアルデヒドを用いて酵素とコラー
ゲンを架橋した膜などを例として挙げることがで
きる。なお、酵素固定化用の半透膜ならびに固定
化法に関しては酵素活性が十分保持され安定であ
る限り、この分野で周知のいかなる技術をも用い
ることができる。 このようにして作成した固定化酵素膜を前記菌
体固定化膜の外側に密着させ、固定化酵素−微生
物複合膜を調製する。この固定化酵素−微生物複
合膜の菌体側が溶存酸素電極表面に密着するよう
電極に装着し、これを半透膜で被覆してＯ―リン
グで固定する。かくして本発明による尿素センサ
が得られる。 上記のように構成した尿素センサを用いて以下
のように尿素を定量する。 尿素センサを尿素被検液に浸漬、接触させる
と、被検液中の尿素が尿素センサの最外層の半透
膜を通して複合膜中に拡散し、尿素は酵素の作用
によりアンモニアと炭酸に分解される。アンモニ
アは次いで硝化層に拡散して酸化され、酸素電極
近傍の溶存酸素が消費される。この溶存酸素の減
少量を電極の出力電流の減少値として測定する。
固定化酵素と固定化菌体の活性が尿素の拡散量に
比較して十分高ければ、測定値と被検液の尿素濃
度との間に所定濃度範囲で比例関係が成立するの
で、被検液中の尿素濃度を容易に測定できる。こ
のような比例関係を得るには酵素活性が十分高
く、かつ安定に固定化されている必要があり、さ
らに固定化硝化菌の活性も十分保持されなければ
ならない。このため被検液を緩衝液にてPH７また
はPH８に維持し、かつ緩衝液に雑菌の生育を妨げ
る抗生物質たとえばクロロマイセチンを含有させ
ることで簡便に行なわれる。なお、PH７の緩衝液
は0.1Mリン酸緩衝液、PH８の緩衝液は0.01Mホ
ウ酸ナトリウム緩衝液を用いることができる。 さらに、測定を行なわない時には、雑菌の成育
を妨げ酵素活性に悪影響のない条件、たとえばPH
８クロロマイセチン１mg／、0.01Mホウ酸ナト
リウム緩衝液で常時通気しながら、この中に尿素
センサを浸漬することにより固定化酵素−微生物

【表】 ただし、培地には菌担体としてCaCO₃粉末を
毎週0.5ｇの割合で添加し、1M Na₂CO₃によりPH
８に保持した。なお、培養条件は、温度20℃、通
気量400ml／minで振とうは行なわず、固定化に
は１ケ月以上培養を継続したものを用いた。この
ような条件で培養され、十分活性のある硝化菌を
次のような方法で固定化した。 アセチルセルロース製メンブランフイルタ（孔
径0.45μm東洋紙）を吸引ビンにセツトし蒸留
水で洗浄する。次いで吸引により硝化菌懸濁液６
mlを流過させてアセチルセルロース膜に菌体を吸
着させ、PH８、0.01Mホウ酸ソーダ緩衝液10mlに
て洗浄した後、この膜を白金電極面を十分被覆す
る程度の大きさに切断する。次に、この実施例で
使用した固定化酵素膜について説明する。 固定化に用いた膜は塩化ビニル膜（三菱油化
製）で、親水性多孔質膜である。この膜は成膜後
蒸留水中に浸漬保存されている。これを硝化菌固
定化膜と同じ大きさに切断し、膜表面の水を拭き
取つた後吸引びん上で吸引しながら、ウレアーゼ
（メルク社製、5U／mg）２mgを膜上にのせる。ウ
レアーゼは膜中に含有されている水に溶解し、膜
中へと浸透する。この後５〜10分間で膜は乾燥
し、膨潤時の約85％に収縮する。この収縮は不可
逆で再び膨潤しても元の大きさには戻らない。従
つて、膜孔中に浸透した酵素は膜孔の収縮により
孔外への脱落が困難となる。このようにして調製
した固定化酵素膜をPH７、0.1Mリン酸緩衝液中
に浸漬し、表面に吸着している酵素を洗い、上記
の菌体膜のアセチルセルロース側に密着させて酵
素−微生物複合膜とする。 このように作成した複合膜を用いて構成される
尿素センサについて添付図面により説明する。第
１図は、ガルバニ型溶存酸素電極を用いた尿素セ
ンサを示してあり、溶存酸素電極は支持体１０、
そこに充填された電解液（30％NaON）１２、
鉛アノード１４、白金カソード１６、及び酸素電
極用隔膜１８から構成される。この隔膜１８上に
上記のように調製した酵素−微生物複合膜２０，
２２の菌体側を密着させると共に酵素膜側を最外
層の透析膜（SPECTRATORメンブレンチユー
ビングNo.２）２４で被覆し、Ｏ―リング２６で前
記支持体１０に固定して、尿素センサ２８を構成
する。 次に、本発明の尿素センサ２８を連続使用する
方式について第２図により説明する。本発明の電
極は、この連続使用方式のみに限定されるもので
なく、バツチ方式でも使用しうることは勿論であ
る。 第２図において、酸素により飽和されたキヤリ
ヤ液３０をペリスタポンプ３２で測定用フローセ
ル３４内に流速１ml／minで通液し、記録計３６
のベースラインが一定になつたことを確認した後
にサンプル注入口３８に尿素を含有する被検液
100μを約20μ／secの流速で注入する。なお、
キヤリヤ液としてPH７、0.1Mのリン酸緩衝液を
用いており、これに酸素を飽和するには、たとえ
ば空気注入口４０より通気させて行うことができ
る。サンプル注入口３８より注入された被検液
は、キヤリヤ液３０により約20倍に希釈されて、
フローセル３４を流過し、その間に尿素の分解反
応が開始され、電流値は減少し、約２分後に極小
電流値が得られる。さらに通液を継続すると電流
値は増加し、４〜15分後にベース電流値に復帰す
る。しかる後に新たに被検液を注入することがで
き、連続測定ができる。また予め既知濃度の尿素
標準液により、尿素濃度と電流減少値との比例関
係を検量しておけば未知濃度の被検液の尿素濃度
を簡単に決定することができる。なお、キヤリヤ
液３０と測定用フローセル３４は、恒温槽４２で
30℃に保つた。 この定量法で尿素５〜50mg／dlの範囲で作成し
た検量線を第３図に示す。縦軸は出力電流値を
μAで示し、横軸は尿素濃度をmg／dlで示す。第
３図からわかるように、出力電流値は尿素濃度に
対し５〜50mg／dlの範囲で良好な直線関係を示
す。 次に、尿素センサの至適PHを知るため、キヤリ
ヤ液のPHを6.0〜8.5の範囲で変え、尿素濃度25
mg／dlの標準液を注入してPHと測定値の関係を調
べ、結果を第４図に示す。PH７及びPH８では尿素
センサの測定値が実用に十分供しうる大きさとな
つたので、キヤリヤ液はPH７またはPH８のいずれ
でも使用できる。 さらに、尿素センサの選択性について検討し
た。尿素濃度25mg／dlの標準液に、血中に含有さ
れている各成分を血中の約５倍の濃度で添加した
後、被検液と添加前の25mg／dlの標準液を用い、
それぞれの測定値を比較した。結果を下記第２表
に示す。

【表】 この結果から判るように、各種成分の添加によ
る測定値への影響はほとんど認められなかつた。 また、尿素センサは、わずかな活性低下はみら
れるものの２週間以上再使用可能であつた。 実施例 ２ この実施例は、酵素をコラーゲン膜に固定化す
る具体例を示す。 固定化微生物膜は実施例１と同様にして作成
し、固定化酵素膜はコラーゲンに酵素を固定化し
て用いた。ここで用いた酵素固定化コラーゲン膜
は以下のように作成した。 十分精製したコラーゲン0.1％溶液に酵素を
0.03％になるように添加し、撹拌した後ガラス板
上に展開した。これを５℃で10時間風乾燥した
後、0.1％グルタルアルデヒドで処理し、0.1M、
PH７のリン酸緩衝液にて洗浄した。この固定化酵
素膜と固定化微生物膜とを用いて、実施例１と同
様に尿素センサを構成した。このセンサを用い、
バツチ式で尿素の定量を行なつた。バツチ式での
測定法を第５図で説明する。 尿素センサ２８をPH７の0.1Mリン酸緩衝液４
４中に浸漬した。前記リン酸緩衝液４４は空気注
入口４６より空気を通気することにより、酸素を
飽和させることができる。マグネチツクスターラ
４８により撹拌を行ない、尿素センサ２８に接続
した記録計５０により、ベース電流値が安定にな
つたことを確認した後、サンプル注入口５２より
被検液を注入した。被検液は前記リン酸緩衝液４
４で20倍に希釈される。被検液の注入後電極電流
値は減少しはじめ、数分後に定常状態に達する。
この定常電流値と被検液注入前のベース電流値と
の差を測定値とし、被検液の尿素濃度と対応させ
る。なお、このシステムは恒温槽５４により常時
30℃に保持した。 この尿素定量法で定量した尿素濃度と比色法
（ジアセチルモノオキシム法）で定量した尿素濃
度の相関関係を第６図に示す。縦軸には尿素セン
サで定量した尿素濃度、横軸にはジアセチルモノ
オキシム法で定量した尿素濃度をmg／dlで示す。
相関係数は0.97であり、比色法の測定値とも良好
な一致が認められた。 上記本発明によれば、以下に列記する効果およ
び利点が得られる。 １ アンモニアを特異的に資化する微生物、硝化
菌とウレアーゼを組み合わせたため、尿素セン
サとしての選択性が高まる。 ２ 酵素を固定化して用いたため、定量が安価に
行なえる。 ３ 酵素−微生物複合膜を溶存酸素電極に装着
し、溶存酸素電極の電流値を測定する方法をと
つたことにより、簡便に定量が行なえる。 ４ 抗生物質を含有する緩衝液で被検液の希釈を
行うことにより、感度が高くかつ安定な尿素セ
ンサが得られる。 ５ 尿素センサを使用しない時、抗生物質を含有
するPH８〜8.5の緩衝液中に常時通気して保存
することにより、長期間安定でかつ連続使用可
能な尿素センサが得られる。 なお、本発明は、血清、尿中の尿素濃度を定量
するばかりでなく全血を用いて測定することも可
能であり、また測定後のセンサの洗浄、測定値の
記憶装置などを備えることにより自動計測用にも
応用できることが了解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の尿素センサの正面断面図、第
２図は尿素センサを用いた尿素定量連続使用法の
システムを示すブロツク図、第３図は連続測定法
による尿素濃度と出力電流の関係を示すグラフ、
第４図は連続測定法におけるキヤリヤ液のPHと出
力電流値との関係を示すグラフ、第５図は尿素セ
ンサを用いるバツチ法のシステムを示すブロツク
図、第６図はバツチ法における尿素定量値と比色
法（ジアチルモノオキシム法）による尿素定量値
の相関関係を示すグラフである。 １０……支持体、１２……電解液、１４……鉛
アノード、１６……白金カソード、１８……隔
膜、２０，２２……酵素−微生物複合膜、２４…
…透析膜、２６……Ｏ―リング、２８……尿素セ
ンサ、３０……キヤリヤ液、３２……ポンプ、３
４……フローセル、３６……記録計、３８……サ
ンプル注入口、４０……空気注入口、４２……恒
温槽、４４……緩衝液、４６……空気注入口、４
８……マグネチツクスターラ、５０……記録計、
５２……サンプル注入口、５４……恒温槽。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 尿素をアンモニアと炭酸とに分解する酵素ウ
   レアーゼを固定化した酵素膜と、アンモニアを資
   化して酸素を消費する硝化菌菌体を固定化した多
   孔質膜とからなり、前記酵素膜と前記多孔質膜と
   を密着させてなる、尿素定量法に使用する固定化
   酵素―微生物複合膜。 ２ 支持体と、支持体内部に充填された電解液
   と、アノードと、カソードと、酸素電極用隔膜
   と、この隔膜を覆う半透膜とからなる溶存酸素電
   極において、酵素ウレアーゼを固定化した酵素膜
   に硝化菌菌体を固定化した多孔質膜を密着させて
   なる固定化酵素―微生物複合膜を、前記酸素電極
   用隔膜と前記半透膜との間に、微生物担持の前記
   多孔質膜側が前記酸素電極用隔膜に密着するよう
   介装し、これを前記半透膜で被覆してなる、尿素
   定量法に使用する尿素センサ。 ３ 慣用の溶存酸素電極における酸素電極用隔膜
   と半透膜との間に、酵素ウレアーゼを固定化した
   酵素膜に硝化菌菌体を固定化した多孔質膜を密着
   させてなる固定化酵素―微生物複合膜を、前記多
   孔質膜が前記酸素電極用隔膜に密着するよう介装
   し、これを前記半透膜で被覆してなる尿素センサ
   を尿素含有の被検液と接触させ、前記尿素センサ
   の出力電流の減少値を測定し、この測定値が被検
   液中の尿素含有量に比例することを特徴とする尿
   素定量法。 ４ 特許請求の範囲第３項記載の尿素定量法にお
   いて、尿素含有の試料を抗生物質を含有する緩衝
   液で所定濃度範囲に希釈してPH7.0またはPH8.0の
   被検液を調製し、これを用いて固定化酵素−微生
   物複合膜の活性および選択性を高めることを特徴
   とする尿素定量法。 ５ 支持体と、支持体内部に充填された電解液
   と、アノードと、カソードと、酸素電極用隔膜
   と、この隔膜を覆う半透膜とからなり、酵素ウレ
   アーゼを固定化した酵素膜に硝化菌菌体を固定化
   した多孔質膜を密着させてなる固定化酵素−微生
   物複合膜を、前記酸素電極用隔膜と前記半透膜と
   の間に、微生物担持の前記多孔質膜側が前記酸素
   電極用隔膜に密着するよう介装し、これを前記半
   透膜で被覆してなる尿素定量法に使用する尿素セ
   ンサを保存するに際し、前記尿素センサを使用し
   ない間、抗生物質を含有するPH８の緩衝液中に常
   時通気しながら浸漬保持し、それにより固定化酵
   素−微生物複合膜の活性を安定化かつ長期間持続
   させることを特徴とする尿素センサの保存法。