JP3016529B2 - 微生物の固定化法、微生物の固定化膜、並びにｂｏｄ又は亜硫酸の測定方法及び測定装置 - Google Patents
微生物の固定化法、微生物の固定化膜、並びにｂｏｄ又は亜硫酸の測定方法及び測定装置Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は微生物の固定化法、微生
物の固定化膜、並びにＢＯＤ又は亜硫酸の測定方法及び
測定装置に関する。
物の固定化膜、並びにＢＯＤ又は亜硫酸の測定方法及び
測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、微生物固定化膜の製造法に関して
は、種々の方法が開発されており、例えば(1) 微生物を
コラーゲンやポリアクリルアミドなどの高分子固定化用
担体で固定化、製膜する方法（特公昭58-30537号公報)
、また(2) 多孔質板を微生物の生息している液中に浸
漬するかまたは、微生物の生息している液を強制的に多
孔質板に流通させて、多孔質板の微細孔内に微生物を生
息させる方法（特公昭57-15696号公報) などが知られて
いる。
は、種々の方法が開発されており、例えば(1) 微生物を
コラーゲンやポリアクリルアミドなどの高分子固定化用
担体で固定化、製膜する方法（特公昭58-30537号公報)
、また(2) 多孔質板を微生物の生息している液中に浸
漬するかまたは、微生物の生息している液を強制的に多
孔質板に流通させて、多孔質板の微細孔内に微生物を生
息させる方法（特公昭57-15696号公報) などが知られて
いる。
【０００３】しかし、上記(1) においては厚さの均一な
薄膜を製造する操作が難しく薄膜の品質を常に一定に保
つことが困難であるという問題点があった。また、(2)
の方法においては、多孔質板中の微細孔内に生息する微
生物が測定中に脱離するなどして菌数が安定せず応答と
感度が不安定になるという問題点を有していた。
薄膜を製造する操作が難しく薄膜の品質を常に一定に保
つことが困難であるという問題点があった。また、(2)
の方法においては、多孔質板中の微細孔内に生息する微
生物が測定中に脱離するなどして菌数が安定せず応答と
感度が不安定になるという問題点を有していた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者らは
充分な応答性、感度、安定性、耐久性を兼ね備えた微生
物固定化膜の開発を目的として鋭意研究を重ねた結果、
本発明を完成するに至った。
充分な応答性、感度、安定性、耐久性を兼ね備えた微生
物固定化膜の開発を目的として鋭意研究を重ねた結果、
本発明を完成するに至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、平
均細孔径が0.65μm 以上３μm 以下である親水性の多孔
質膜の中に微生物をゲル化材で固定化することを特徴と
する微生物固定化方法、平均細孔径が0.65μm 以上３μ
m 以下である親水性の多孔質膜の中に微生物をゲル化材
で固定化した微生物固定化膜、該微生物固定化膜をＢＯ
Ｄ測定又は亜硫酸測定の生体素子として使用することを
特徴とするＢＯＤ測定又は亜硫酸測定方法、及び生体素
子が前記微生物固定化膜であるＢＯＤ又は亜硫酸測定装
置である。
均細孔径が0.65μm 以上３μm 以下である親水性の多孔
質膜の中に微生物をゲル化材で固定化することを特徴と
する微生物固定化方法、平均細孔径が0.65μm 以上３μ
m 以下である親水性の多孔質膜の中に微生物をゲル化材
で固定化した微生物固定化膜、該微生物固定化膜をＢＯ
Ｄ測定又は亜硫酸測定の生体素子として使用することを
特徴とするＢＯＤ測定又は亜硫酸測定方法、及び生体素
子が前記微生物固定化膜であるＢＯＤ又は亜硫酸測定装
置である。
【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
使用することのできる固定化用支持体、即ち多孔質膜と
しては酸素、亜硫酸、各種有機化合物、各種無機化合物
などを溶液状またはガス状で自由に通過せしめる親水性
の多孔質膜であればいずれでも良く、例えばメンブラン
濾過膜や非対称限外濾過膜等を使用することができる。
材質はニトロセルロース、アセチルセルロースなどのセ
ルロースエステル化合物や親水化ポリ沸化ビニリデン、
ポリエーテルスルホン等が使用できる。尚、本発明で使
用する親水性の多孔質膜は、生体素子として用いる際、
応答性を向上させるために使用する電極表面に該多孔質
膜を完全に密着させることが必要であり、従って柔軟性
があり、該電極表面の形状に合わせることのできる素材
よりなる多孔質膜を使用することが必要である。
使用することのできる固定化用支持体、即ち多孔質膜と
しては酸素、亜硫酸、各種有機化合物、各種無機化合物
などを溶液状またはガス状で自由に通過せしめる親水性
の多孔質膜であればいずれでも良く、例えばメンブラン
濾過膜や非対称限外濾過膜等を使用することができる。
材質はニトロセルロース、アセチルセルロースなどのセ
ルロースエステル化合物や親水化ポリ沸化ビニリデン、
ポリエーテルスルホン等が使用できる。尚、本発明で使
用する親水性の多孔質膜は、生体素子として用いる際、
応答性を向上させるために使用する電極表面に該多孔質
膜を完全に密着させることが必要であり、従って柔軟性
があり、該電極表面の形状に合わせることのできる素材
よりなる多孔質膜を使用することが必要である。
【０００７】また本発明の多孔質膜は、目的とする微生
物をその多孔質構造の中に保持することが必要であり、
その多孔質構造における細孔は平均細孔径が0.65μm 以
上３μm 以下であることが望ましい。尚、非対象限外濾
過膜を使用する時には、表面側即ち、孔径が大きい側の
平均細孔径が0.65μm 以上３μm 以下であれば差し支え
ない。また、使用する多孔質膜の膜厚は用途に応じて適
宜選択すれば良く、一般的には50μm 以上 200μm 以下
が操作性と強度、柔軟性の面から使用の好適範囲であ
る。
物をその多孔質構造の中に保持することが必要であり、
その多孔質構造における細孔は平均細孔径が0.65μm 以
上３μm 以下であることが望ましい。尚、非対象限外濾
過膜を使用する時には、表面側即ち、孔径が大きい側の
平均細孔径が0.65μm 以上３μm 以下であれば差し支え
ない。また、使用する多孔質膜の膜厚は用途に応じて適
宜選択すれば良く、一般的には50μm 以上 200μm 以下
が操作性と強度、柔軟性の面から使用の好適範囲であ
る。
【０００８】微生物を多孔質膜に保持するための固定化
用担体、即ちゲル化材としては、親水性のゲルを形成す
るものであればいずれも使用することができるが、例え
ば、アルギン酸、寒天、ジェランガム、キサンタンガ
ム、ゼラチン、カラギーナン、メチルセルロース、ペク
チン、プルランなどが好適である。次に微生物の固定化
方法について説明する。
用担体、即ちゲル化材としては、親水性のゲルを形成す
るものであればいずれも使用することができるが、例え
ば、アルギン酸、寒天、ジェランガム、キサンタンガ
ム、ゼラチン、カラギーナン、メチルセルロース、ペク
チン、プルランなどが好適である。次に微生物の固定化
方法について説明する。
【０００９】目的の微生物は生育に適切な培地で培養し
た後、集菌、洗浄を行い、洗浄菌体として使用する。得
られた微生物をアルギン酸などのゲル化材の溶液に適宜
混合して微生物混合ゲル化材溶液とし、該溶液をアセチ
ルセルロースメンブレンフィルターなどの多孔質膜上に
滴下し、多孔質膜の下部から吸引または、上部から加圧
して多孔質膜の孔の中に浸潤させ、ゲル化材ごと微生物
を固定する。多孔質膜表面に残存する微生物混合ゲル化
材溶液が浸潤して多孔質膜中に全て移行するまで吸引も
しくは加圧して、微生物混合ゲル化材が多孔質膜中に保
持されるようにする。この時の吸引や加圧の強さの程度
は、多孔質膜が破損しない程度であれば良い。
た後、集菌、洗浄を行い、洗浄菌体として使用する。得
られた微生物をアルギン酸などのゲル化材の溶液に適宜
混合して微生物混合ゲル化材溶液とし、該溶液をアセチ
ルセルロースメンブレンフィルターなどの多孔質膜上に
滴下し、多孔質膜の下部から吸引または、上部から加圧
して多孔質膜の孔の中に浸潤させ、ゲル化材ごと微生物
を固定する。多孔質膜表面に残存する微生物混合ゲル化
材溶液が浸潤して多孔質膜中に全て移行するまで吸引も
しくは加圧して、微生物混合ゲル化材が多孔質膜中に保
持されるようにする。この時の吸引や加圧の強さの程度
は、多孔質膜が破損しない程度であれば良い。
【００１０】即ち、菌体表面をゲル化材で被覆された微
生物を多孔質膜の穴の中に埋め込み、多孔質膜素材と微
生物の間にゲル化材を存在せしめ、その後、使用するゲ
ル化材に応じた所定の方法によりゲル化材を固化させる
ことにより微生物を多孔質膜中に固定し、多孔質膜の孔
から微生物が脱離することのない優れた微生物固定化膜
を製造する。ゲル化材の固化にはカルシウム等の無機塩
類や、重合材等の固化材でゲル化させたり、冷却して固
化させたりする方法等を使用することができる。
生物を多孔質膜の穴の中に埋め込み、多孔質膜素材と微
生物の間にゲル化材を存在せしめ、その後、使用するゲ
ル化材に応じた所定の方法によりゲル化材を固化させる
ことにより微生物を多孔質膜中に固定し、多孔質膜の孔
から微生物が脱離することのない優れた微生物固定化膜
を製造する。ゲル化材の固化にはカルシウム等の無機塩
類や、重合材等の固化材でゲル化させたり、冷却して固
化させたりする方法等を使用することができる。
【００１１】本発明によれば、使用するゲル化材は極少
量で良く、ゲル化させる処理時間も短時間で、処理温度
も室温程度で充分であるため、微生物を温和な条件で処
理でき、従って、使用する微生物に損傷を与えないの
で、微生物活性が高く維持できる。また酸素、亜硫酸、
各種有機化合物、各種無機化合物などの通過性は高く高
感度であり、且つ、本発明の微生物固定化膜の一部が破
損しても内部からの微生物の漏出は非常にわずかであ
り、該膜の寿命も今までになく長いという特徴を有する
微生物固定化膜がはじめて得られた。
量で良く、ゲル化させる処理時間も短時間で、処理温度
も室温程度で充分であるため、微生物を温和な条件で処
理でき、従って、使用する微生物に損傷を与えないの
で、微生物活性が高く維持できる。また酸素、亜硫酸、
各種有機化合物、各種無機化合物などの通過性は高く高
感度であり、且つ、本発明の微生物固定化膜の一部が破
損しても内部からの微生物の漏出は非常にわずかであ
り、該膜の寿命も今までになく長いという特徴を有する
微生物固定化膜がはじめて得られた。
【００１２】次に、本発明の微生物固定化法を使用し
て、ＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）、並びに、亜硫酸
を測定する方法について述べる。本発明者らはこれま
で、ＢＯＤの測定についてはクレブシエラ属 (Klebsiel
la属）に属する微生物を用いる測定方法（特願平3-3076
9号) 、亜硫酸の測定についてはチオバチルス属 (Thiob
acillus属) に属する微生物を用いる測定方法（特願平3
-256814号) を完成し特許出願している。
て、ＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）、並びに、亜硫酸
を測定する方法について述べる。本発明者らはこれま
で、ＢＯＤの測定についてはクレブシエラ属 (Klebsiel
la属）に属する微生物を用いる測定方法（特願平3-3076
9号) 、亜硫酸の測定についてはチオバチルス属 (Thiob
acillus属) に属する微生物を用いる測定方法（特願平3
-256814号) を完成し特許出願している。
【００１３】上記発明においてＢＯＤの測定はクレブシ
エラ属に属する微生物を固定化した微生物膜と酸素電極
を組み合わせて測定する方法であり、亜硫酸の測定はチ
オバチルス属に属する微生物を固定化した微生物膜と酸
素電極を組み合わせて測定する方法であるが、いずれの
方法においてもそれぞれ使用する微生物を本発明による
微生物固定化方法にて製造した微生物固定化膜とし、酸
素電極と組み合わせて行うことで応答性に優れ、高感度
な生体素子として使用できる。
エラ属に属する微生物を固定化した微生物膜と酸素電極
を組み合わせて測定する方法であり、亜硫酸の測定はチ
オバチルス属に属する微生物を固定化した微生物膜と酸
素電極を組み合わせて測定する方法であるが、いずれの
方法においてもそれぞれ使用する微生物を本発明による
微生物固定化方法にて製造した微生物固定化膜とし、酸
素電極と組み合わせて行うことで応答性に優れ、高感度
な生体素子として使用できる。
【００１４】
【発明の効果】本発明の方法により得られる微生物固定
化膜は、これをＢＯＤ又は亜硫酸の測定に使用したとき
感度、応答性、安定性、耐久性において優れた効果が示
され、当該微生物固定化膜を使用して優れたＢＯＤ又は
亜硫酸の測定法及び測定装置が提供された。
化膜は、これをＢＯＤ又は亜硫酸の測定に使用したとき
感度、応答性、安定性、耐久性において優れた効果が示
され、当該微生物固定化膜を使用して優れたＢＯＤ又は
亜硫酸の測定法及び測定装置が提供された。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限
定されるものではない。 実施例１ クレブシエラ オキシトカ12092 (Klebsiell
a oxytoca12092) の固定化 クレブシエラ オキシトカ12092 (FERM BP-3616)をポリ
ペプトン１％、酵母エキス0.１％塩化ナトリウム0.５％
を含む液体培地 100mlの入った 500ml容三角フラスコに
接種し、30℃にて24時間好気的条件下で振盪培養を行っ
た。培養終了後培養液を6000rpm で20分間遠心分離して
菌体を集めた。得られた菌体に少量の滅菌蒸留水を加え
て懸濁し、再度遠心分離して洗浄を行った。この洗浄を
３回繰り返し洗浄菌体として150mg（乾重）を得た。
るが、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限
定されるものではない。 実施例１ クレブシエラ オキシトカ12092 (Klebsiell
a oxytoca12092) の固定化 クレブシエラ オキシトカ12092 (FERM BP-3616)をポリ
ペプトン１％、酵母エキス0.１％塩化ナトリウム0.５％
を含む液体培地 100mlの入った 500ml容三角フラスコに
接種し、30℃にて24時間好気的条件下で振盪培養を行っ
た。培養終了後培養液を6000rpm で20分間遠心分離して
菌体を集めた。得られた菌体に少量の滅菌蒸留水を加え
て懸濁し、再度遠心分離して洗浄を行った。この洗浄を
３回繰り返し洗浄菌体として150mg（乾重）を得た。
【００１６】この洗浄菌体0.４mg（乾重）相当を、滅菌
した３％アルギン酸ナトリウム水溶液50μl に混合し、
平均細孔径0.８μm のアセチルセルロース膜（ミリポア
社製メンブランフィルタータイプＨＡ）上に滴下し、こ
の微生物混合溶液が該膜中に全て保持されるまで膜の下
部より吸引し、浸潤させて該膜中に固定した。該膜を通
過した余剰のアルギン酸水溶液はそのまま膜の下部より
滴下させて除けば良い。次に、この微生物を保持した該
膜を５％塩化カルシウム水溶液50ml中に室温で10分間浸
漬してアルギン酸を固化させ微生物固定化膜を得た。 実施例２ ＢＯＤの測定 実施例１で得られた本発明微生物固定化膜を用いてＢＯ
Ｄ標準液 (JIS-KO102)の測定を行った。図１に示すよう
に酸素電極３とキャップ１の間に微生物固定化膜２を装
着して微生物電極を作成し、図２に示す装置で測定し
た。装置の概略は、次の通りである。試料ビン４から採
取されたＢＯＤ標準液は、電磁弁５を通りポンプ６を経
て、フローセル７に導かれる。フローセル７中は、モー
ター10により攪拌子９で攪拌される。酸素電極３の電極
面にキャップ１で外嵌された微生物固定化膜２から構成
される微生物電極８で検知された値はアンプ部13で増幅
され、記録計14で記録される。測定を終了した試料は廃
液槽11に入る。測定終了後、電磁弁５を切り替えて洗浄
液槽12より洗浄液を通じて洗浄を行う。測定温度は30
℃、試料流通時間（測定時間）は３分、試料量は10mlで
ある。尚、測定に供する試料及び洗浄液に必要に応じて
空気を通気するかまたは、フローセル７に至る経路の途
中で通気しても良い。本装置を使用して各種濃度のＢＯ
Ｄ標準液を測定した結果、図３に示すようにＢＯＤの濃
度とそれに応答する酸素電極の電圧変化量の間にはきわ
めて良い直線関係が得られた。また、鹿児島県の食品工
場から採取した廃液について同様の条件でＢＯＤを測定
した値を公定法である５日間法による測定値と比較した
ところ、本発明微生物固定化膜を使用した測定値は42pp
m 、５日間法では45ppm であり良く一致した結果が得ら
れた。この結果より、本発明は実際の試料についても充
分利用可能であることがわかった。 実施例３ 多孔質膜の平均細孔径の比較 平均細孔径の異なる市販の多孔質膜に、実施例１で得た
微生物菌体を同様の方法で固定化し、実施例２で使用し
た装置の微生物電極に装着して同様の条件でＢＯＤ標準
液を測定した。各種濃度のＢＯＤ標準液を測定した結果
を図４、濃度66ppm のＢＯＤ標準液を繰り返し測定した
結果を図５に示す。この結果、平均細孔径0.45μm の多
孔質膜で製造した微生物固定化膜では応答が低く、平均
細孔径５μm の多孔質膜で製造した微生物固定化膜では
繰り返し測定すると感度が低下して測定できなくなっ
た。平均細孔径0.65μm 以上の多孔質膜を使用して製造
した微生物固定化膜ではＢＯＤ濃度とそれに応答する酸
素電極の電圧変化量の間にはきわめて良い直線関係が得
られ、繰り返し測定では平均細孔径３μm 以下の多孔質
膜を使用して製造した微生物固定化膜を使用したときに
安定した応答が得られた。これらの結果より、平均細孔
径0.65μm 以上３μm 以下の多孔質膜を使用して製造し
た微生物固定化膜を用いたときに高感度で安定性に優れ
た測定ができることが明らかである。 実施例４ 多孔質膜の比較 多孔質膜の膜厚が 150μm で平均細孔径の異なるアセチ
ルセルロース製の多孔質膜に、実施例１で得た微生物菌
体をゲル化材を使用しないで該膜の上部に滴下し浸潤さ
せ、該膜下部より吸引して該膜の孔の中にトラップして
微生物固定化膜を製造した。
した３％アルギン酸ナトリウム水溶液50μl に混合し、
平均細孔径0.８μm のアセチルセルロース膜（ミリポア
社製メンブランフィルタータイプＨＡ）上に滴下し、こ
の微生物混合溶液が該膜中に全て保持されるまで膜の下
部より吸引し、浸潤させて該膜中に固定した。該膜を通
過した余剰のアルギン酸水溶液はそのまま膜の下部より
滴下させて除けば良い。次に、この微生物を保持した該
膜を５％塩化カルシウム水溶液50ml中に室温で10分間浸
漬してアルギン酸を固化させ微生物固定化膜を得た。 実施例２ ＢＯＤの測定 実施例１で得られた本発明微生物固定化膜を用いてＢＯ
Ｄ標準液 (JIS-KO102)の測定を行った。図１に示すよう
に酸素電極３とキャップ１の間に微生物固定化膜２を装
着して微生物電極を作成し、図２に示す装置で測定し
た。装置の概略は、次の通りである。試料ビン４から採
取されたＢＯＤ標準液は、電磁弁５を通りポンプ６を経
て、フローセル７に導かれる。フローセル７中は、モー
ター10により攪拌子９で攪拌される。酸素電極３の電極
面にキャップ１で外嵌された微生物固定化膜２から構成
される微生物電極８で検知された値はアンプ部13で増幅
され、記録計14で記録される。測定を終了した試料は廃
液槽11に入る。測定終了後、電磁弁５を切り替えて洗浄
液槽12より洗浄液を通じて洗浄を行う。測定温度は30
℃、試料流通時間（測定時間）は３分、試料量は10mlで
ある。尚、測定に供する試料及び洗浄液に必要に応じて
空気を通気するかまたは、フローセル７に至る経路の途
中で通気しても良い。本装置を使用して各種濃度のＢＯ
Ｄ標準液を測定した結果、図３に示すようにＢＯＤの濃
度とそれに応答する酸素電極の電圧変化量の間にはきわ
めて良い直線関係が得られた。また、鹿児島県の食品工
場から採取した廃液について同様の条件でＢＯＤを測定
した値を公定法である５日間法による測定値と比較した
ところ、本発明微生物固定化膜を使用した測定値は42pp
m 、５日間法では45ppm であり良く一致した結果が得ら
れた。この結果より、本発明は実際の試料についても充
分利用可能であることがわかった。 実施例３ 多孔質膜の平均細孔径の比較 平均細孔径の異なる市販の多孔質膜に、実施例１で得た
微生物菌体を同様の方法で固定化し、実施例２で使用し
た装置の微生物電極に装着して同様の条件でＢＯＤ標準
液を測定した。各種濃度のＢＯＤ標準液を測定した結果
を図４、濃度66ppm のＢＯＤ標準液を繰り返し測定した
結果を図５に示す。この結果、平均細孔径0.45μm の多
孔質膜で製造した微生物固定化膜では応答が低く、平均
細孔径５μm の多孔質膜で製造した微生物固定化膜では
繰り返し測定すると感度が低下して測定できなくなっ
た。平均細孔径0.65μm 以上の多孔質膜を使用して製造
した微生物固定化膜ではＢＯＤ濃度とそれに応答する酸
素電極の電圧変化量の間にはきわめて良い直線関係が得
られ、繰り返し測定では平均細孔径３μm 以下の多孔質
膜を使用して製造した微生物固定化膜を使用したときに
安定した応答が得られた。これらの結果より、平均細孔
径0.65μm 以上３μm 以下の多孔質膜を使用して製造し
た微生物固定化膜を用いたときに高感度で安定性に優れ
た測定ができることが明らかである。 実施例４ 多孔質膜の比較 多孔質膜の膜厚が 150μm で平均細孔径の異なるアセチ
ルセルロース製の多孔質膜に、実施例１で得た微生物菌
体をゲル化材を使用しないで該膜の上部に滴下し浸潤さ
せ、該膜下部より吸引して該膜の孔の中にトラップして
微生物固定化膜を製造した。
【００１７】次に実施例１と同様の方法で本発明微生物
固定化膜を製造し、実施例３と同様の条件で測定を行っ
た。表１に示すようにゲル化材を使用しないで多孔質膜
中に微生物をトラップした微生物固定化膜は本発明微生
物固定化膜に比べほとんど応答が見られず、微生物が充
分トラップされていないと考えられたので、微生物をト
ラップする多孔質膜の膜厚を厚さ 600μm にし、更に、
固定化する微生物量を10倍量の４mg（乾重）として同様
に固定した。
固定化膜を製造し、実施例３と同様の条件で測定を行っ
た。表１に示すようにゲル化材を使用しないで多孔質膜
中に微生物をトラップした微生物固定化膜は本発明微生
物固定化膜に比べほとんど応答が見られず、微生物が充
分トラップされていないと考えられたので、微生物をト
ラップする多孔質膜の膜厚を厚さ 600μm にし、更に、
固定化する微生物量を10倍量の４mg（乾重）として同様
に固定した。
【００１８】
【表１】
【００１９】その結果を表２に示したが、平均細孔径0.
８μm 以下の多孔質膜を使用した場合は測定ができなか
った。これは、測定に際し、試料を流通させる前に洗浄
水を反応槽に流通し、微生物電極の示す初期の酸素濃度
レベル、いわゆるベースラインを求める段階で、すでに
酸素電極の示す表２の電圧値が20から40mVであり、ほと
んど無酸素の状態を示し、その状態から微生物が各種有
機物を資化する際におこる酸素濃度変化を測定すること
が不可能なためである。
８μm 以下の多孔質膜を使用した場合は測定ができなか
った。これは、測定に際し、試料を流通させる前に洗浄
水を反応槽に流通し、微生物電極の示す初期の酸素濃度
レベル、いわゆるベースラインを求める段階で、すでに
酸素電極の示す表２の電圧値が20から40mVであり、ほと
んど無酸素の状態を示し、その状態から微生物が各種有
機物を資化する際におこる酸素濃度変化を測定すること
が不可能なためである。
【００２０】
【表２】
【００２１】この状況は、洗浄水および／または試料中
の酸素が該微生物固定化膜中を自由に通過できないこと
を示している。また平均細孔径３μm 以上の微生物固定
化膜では、ベースラインを示す表２の電圧値は 200から
300mVであり、比較的高い値を示した。しかし、試料流
通時間３分の条件では応答が見られず、試料流通時間30
分でわずかに応答が得られたに過ぎなかった。これらに
比べ本発明微生物固定化膜はベースラインを示す電圧値
は1000mVと高く、かつ試料流通時間も３分で応答が得ら
れ、迅速な測定ができることがわかる。従って、本発明
による微生物固定化膜は応答に優れるばかりでなく迅速
な測定もできることが明らかである 実施例５ 固定化法の比較 実施例１で得られた微生物を同様の方法で固定化して得
られた本発明微生物固定化膜と、実施例１で得られた微
生物の同一菌体量を、10重量％アクリルアミド溶液に混
合し、常法によりゲル化し膜厚 200μm のポリアクリル
アミド固定化微生物膜を製造した。これらの微生物固定
化膜を実施例２の装置に装着しＢＯＤ標準液の測定を行
った。その結果、図６に示すように本発明微生物固定化
膜（Ａ）は試料流通時間３分で濃度 66ppmのＢＯＤ溶液
に対して、600mV の応答が得られたが、ポリアクリルア
ミド固定化微生物膜（Ｂ）では応答が得られず、試料流
通時間を30分とした時に濃度66ppm のＢＯＤ溶液に対し
て、150mV の応答が得られた。この様に、本発明微生物
固定化膜による測定では応答性と迅速性が明らかに優れ
ていることがわかる。また、ポリアクリルアミド固定化
微生物膜は酸素電極に装着する際に強く装着すると破損
することがあり、注意を要した。 実施例６ 亜硫酸の測定 チオバチルス チオオキシダンス20294 (Thiobacillus
thiooxdans20294) (FERM BP-3467) を下記の組成を含む
滅菌した培地50mlの入った 200ml容三角フラスコに接種
し、30℃にて４日間振とう培養を行った。この培養液２
mlを同じ培地100ml を入れた 300ml容エーレンマイヤー
フラスコに無菌的に接種し、30℃にて10日間振とう培養
を行った。培養終了後、培養液を東洋濾紙製 No.５c 濾
紙を用いて濾過し、イオウ粉末を除去した。得られた濾
液中の菌体量は0.４g 乾燥菌体／Ｌ培養液であった。 得られた菌体を11000rpmで15分間遠心分離し、集菌し
た。集めた菌体を少量の冷蒸留水で懸濁し再度、遠心分
離を行い菌体を洗浄する操作を２回繰り返して洗浄菌体
を得た。洗浄菌体0.４mg (乾重) を３％アルギン酸ナト
リウム溶液50μlに混合し、実施例１と同様にして多孔
質膜 (平均細孔径0.８μm ) に固定した。
の酸素が該微生物固定化膜中を自由に通過できないこと
を示している。また平均細孔径３μm 以上の微生物固定
化膜では、ベースラインを示す表２の電圧値は 200から
300mVであり、比較的高い値を示した。しかし、試料流
通時間３分の条件では応答が見られず、試料流通時間30
分でわずかに応答が得られたに過ぎなかった。これらに
比べ本発明微生物固定化膜はベースラインを示す電圧値
は1000mVと高く、かつ試料流通時間も３分で応答が得ら
れ、迅速な測定ができることがわかる。従って、本発明
による微生物固定化膜は応答に優れるばかりでなく迅速
な測定もできることが明らかである 実施例５ 固定化法の比較 実施例１で得られた微生物を同様の方法で固定化して得
られた本発明微生物固定化膜と、実施例１で得られた微
生物の同一菌体量を、10重量％アクリルアミド溶液に混
合し、常法によりゲル化し膜厚 200μm のポリアクリル
アミド固定化微生物膜を製造した。これらの微生物固定
化膜を実施例２の装置に装着しＢＯＤ標準液の測定を行
った。その結果、図６に示すように本発明微生物固定化
膜（Ａ）は試料流通時間３分で濃度 66ppmのＢＯＤ溶液
に対して、600mV の応答が得られたが、ポリアクリルア
ミド固定化微生物膜（Ｂ）では応答が得られず、試料流
通時間を30分とした時に濃度66ppm のＢＯＤ溶液に対し
て、150mV の応答が得られた。この様に、本発明微生物
固定化膜による測定では応答性と迅速性が明らかに優れ
ていることがわかる。また、ポリアクリルアミド固定化
微生物膜は酸素電極に装着する際に強く装着すると破損
することがあり、注意を要した。 実施例６ 亜硫酸の測定 チオバチルス チオオキシダンス20294 (Thiobacillus
thiooxdans20294) (FERM BP-3467) を下記の組成を含む
滅菌した培地50mlの入った 200ml容三角フラスコに接種
し、30℃にて４日間振とう培養を行った。この培養液２
mlを同じ培地100ml を入れた 300ml容エーレンマイヤー
フラスコに無菌的に接種し、30℃にて10日間振とう培養
を行った。培養終了後、培養液を東洋濾紙製 No.５c 濾
紙を用いて濾過し、イオウ粉末を除去した。得られた濾
液中の菌体量は0.４g 乾燥菌体／Ｌ培養液であった。 得られた菌体を11000rpmで15分間遠心分離し、集菌し
た。集めた菌体を少量の冷蒸留水で懸濁し再度、遠心分
離を行い菌体を洗浄する操作を２回繰り返して洗浄菌体
を得た。洗浄菌体0.４mg (乾重) を３％アルギン酸ナト
リウム溶液50μlに混合し、実施例１と同様にして多孔
質膜 (平均細孔径0.８μm ) に固定した。
【００２２】この微生物固定化膜を図７に示した亜硫酸
測定電極に装着して図２のフローセル装置で測定した。
図７は酸素電極15とガス透過性膜16、緩衝液 (0.１Ｍク
エン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム pH 5 ) 17及び微
生物固定化膜18よりなる。試料としては各種濃度の亜硫
酸水素ナトリウム溶液 (５mM硫酸酸性溶液 pH 2) を用
いた。図８に示すように亜硫酸濃度とそれに応答する酸
素電極の電圧変化量の間にはきわめて良い直線関係が得
られた。また、本発明者等が既に完成し、特許出願して
いる方法 (特願平3-256814) に従って製造した微生物固
定化膜を使用して亜硫酸を測定した結果と、本発明の微
生物固定化膜を使用して亜硫酸を測定した結果とを比較
した所、本発明による微生物固定化膜は同じ濃度の亜硫
酸に対する電圧変化量が大きく、より高感度な測定がで
きた。 実施例７ 限外濾過膜を使用した固定化 非対称限外濾過膜 (フジフィルター社製フィルトロン限
外濾過膜オメガメンブレン) を使用し、実施例１で得ら
れた微生物菌体を同様の方法で固定化し、固定化微生物
膜を得た。これを実施例２で使用した装置に装着し、Ｂ
ＯＤ標準液を測定した。図９に示すようにＢＯＤ標準液
の濃度とそれに応答する酸素電極の電圧変化量の間には
極めて良好な直線関係が得られ、かつ感度も高いことが
わかった。
測定電極に装着して図２のフローセル装置で測定した。
図７は酸素電極15とガス透過性膜16、緩衝液 (0.１Ｍク
エン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム pH 5 ) 17及び微
生物固定化膜18よりなる。試料としては各種濃度の亜硫
酸水素ナトリウム溶液 (５mM硫酸酸性溶液 pH 2) を用
いた。図８に示すように亜硫酸濃度とそれに応答する酸
素電極の電圧変化量の間にはきわめて良い直線関係が得
られた。また、本発明者等が既に完成し、特許出願して
いる方法 (特願平3-256814) に従って製造した微生物固
定化膜を使用して亜硫酸を測定した結果と、本発明の微
生物固定化膜を使用して亜硫酸を測定した結果とを比較
した所、本発明による微生物固定化膜は同じ濃度の亜硫
酸に対する電圧変化量が大きく、より高感度な測定がで
きた。 実施例７ 限外濾過膜を使用した固定化 非対称限外濾過膜 (フジフィルター社製フィルトロン限
外濾過膜オメガメンブレン) を使用し、実施例１で得ら
れた微生物菌体を同様の方法で固定化し、固定化微生物
膜を得た。これを実施例２で使用した装置に装着し、Ｂ
ＯＤ標準液を測定した。図９に示すようにＢＯＤ標準液
の濃度とそれに応答する酸素電極の電圧変化量の間には
極めて良好な直線関係が得られ、かつ感度も高いことが
わかった。
【図１】本発明の微生物電極を示す図である。
【図２】ＢＯＤの測定装置を示す図である。
【図３】図２に示す装置を用いて各種濃度のＢＯＤ標準
液を測定した結果を示す図である。
液を測定した結果を示す図である。
【図４】平均細孔径の異なる多孔質膜を用い、図２に示
す装置を用いて各種濃度のＢＯＤ標準液を測定した結果
を示す図である。
す装置を用いて各種濃度のＢＯＤ標準液を測定した結果
を示す図である。
【図５】平均細孔径の異なる多孔質膜を用い、図２に示
す装置を用いて各種濃度のＢＯＤ標準液を測定した結果
を示す図である。
す装置を用いて各種濃度のＢＯＤ標準液を測定した結果
を示す図である。
【図６】本発明の微生物固定化膜とポリアクリルアミド
をそれぞれ用いて応答感度を比較した図を示す。
をそれぞれ用いて応答感度を比較した図を示す。
【図７】微生物固定化膜を装着した亜硫酸測定電極を示
す図である。
す図である。
【図８】各種濃度の亜硫酸水素ナトリウム溶液を測定し
た結果を示す図である。
た結果を示す図である。
【図９】非対称限外濾過膜を使用した微生物固定化膜で
各種濃度のＢＯＤ標準液を測定した結果を示す図であ
る。
各種濃度のＢＯＤ標準液を測定した結果を示す図であ
る。
１ キャップ ２,18 微生物固定化膜 ３,15 酸素電極 ４ 試料ビン ５ 電磁弁 ６ ポンプ ７ フローセル ８ 微生物電極 ９ 攪拌子 10 モーター 11 廃液槽 12 洗浄液槽 13 アンプ部 14 記録計 16 ガス透過性膜 17 緩衝液
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/18 １０５ Ｇ０１Ｎ 27/46 ３０６ (56)参考文献 特開 昭58−96246（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−85854（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−47699（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−153593（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−47895（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−111759（ＪＰ，Ａ) Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．32，ｐ. 351（1989) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 11/12 C12N 11/04 G01N 27/327 G01N 27/416 G01N 27/49 G01N 33/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】 平均細孔径が0.65μm 以上3 μm 以下で
ある親水性の多孔質膜上に、微生物を混合した親水性ゲ
ル化材溶液を滴下し、多孔質膜の下部から吸引または上
部から加圧することにより多孔質膜の孔の中に湿潤さ
せ、ゲル化材と共に微生物菌体を固定化させることを特
徴とする、微生物固定化方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の方法により得られた微
生物固定化膜。 - 【請求項３】 請求項２に記載の微生物固定化膜をＢＯ
Ｄ測定又は亜硫酸測定の生体素子として使用することを
特徴とするＢＯＤ測定又は亜硫酸測定方法。 - 【請求項４】 生体素子が請求項２に記載の微生物固定
化膜であるＢＯＤ測定又は亜硫酸測定装置。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4053804A JP3016529B2 (ja) | 1992-03-12 | 1992-03-12 | 微生物の固定化法、微生物の固定化膜、並びにｂｏｄ又は亜硫酸の測定方法及び測定装置 |
| US07/978,843 US5356792A (en) | 1991-11-22 | 1992-11-19 | Biochemical oxygen demand analyzer and methods of analysis using Klebsiella microorganisms |
| EP92119824A EP0543407B1 (en) | 1991-11-22 | 1992-11-20 | Biochemical oxygen demand analyzer, methods of analysis, microorganisms used for analysis |
| CA002083410A CA2083410A1 (en) | 1991-11-22 | 1992-11-20 | Biochemical oxygen demand analyzer, methods of analysis, microorganisms used for analysis |
| DE69201937T DE69201937T2 (de) | 1991-11-22 | 1992-11-20 | Biochemischer Sauerstoffbedarfanalysator, Verfahren zur Analyse, Mikroorganismen zur Verwendung in Analyse. |
| US08/179,593 US5426042A (en) | 1991-11-22 | 1994-01-07 | Klebsella oxytoca ferm BP-I/3616 and immobilization thereof with a gelating agent in pores of a membrane |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4053804A JP3016529B2 (ja) | 1992-03-12 | 1992-03-12 | 微生物の固定化法、微生物の固定化膜、並びにｂｏｄ又は亜硫酸の測定方法及び測定装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05252952A JPH05252952A (ja) | 1993-10-05 |
| JP3016529B2 true JP3016529B2 (ja) | 2000-03-06 |
Family
ID=12952996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4053804A Expired - Fee Related JP3016529B2 (ja) | 1991-11-22 | 1992-03-12 | 微生物の固定化法、微生物の固定化膜、並びにｂｏｄ又は亜硫酸の測定方法及び測定装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3016529B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3261456B2 (ja) | 1999-10-29 | 2002-03-04 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 細胞培養担体及び該担体を用いた細胞の培養方法 |
| JP2005172475A (ja) * | 2003-12-08 | 2005-06-30 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | バイオアッセイプレート及びそれを用いたバイオアッセイ方法 |
-
1992
- 1992-03-12 JP JP4053804A patent/JP3016529B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．３２，ｐ．３５１（１９８９） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05252952A (ja) | 1993-10-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |