JPS62198745A - Ｌ−チロシン計測方法及び計測用センサ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （概　要〕 二酸化炭素を資化する微生物を酸素電極のカソードの近
傍に固定化し、さらにこの微生物及び前記カソードの全
体を酵素：Ｌ−チロシンデカルボキシラーゼ（Ｌ−チロ
シン脱炭酸酵素）を固定化したガス透過性膜で覆った構
造を存するアンペロメトリックなＬ−チロシン計測及び
定量用センサーが開示される０本発明によるＬ−チロシ
ンセンサーは、換言すると、ハイブリッド型酵素・微生
物電極である。このＬ−チロシンセンサーは、トランス
デユーサ−として微生物を用いたアンペロメトリックな
二酸化炭素電極を使用しているので、高感度で迅速なＬ
−チロシンの計測を可能とし、また、その際、夾雑物質
の影響を受けにくい。

〔産業上の利用分野〕

本発明は、溶液中のＬ−チロシンの濃度を測定するため
の方法及び装置に関する。さらに詳しく述べると、本発
明は、酵素機能と微生物機能を組み合わせて使用し、さ
らに電気化学的な電極を利用したＬ−チロシン計測方法
及びＬ−チロシン計測用センサーに関する０本発明は、
臨床、医療をはじめとする多くの計測分野において有利
に利用することができる。

〔従来の技術〕

特に臨床計測の分野において、例えば血液のような溶液
中のＬ−チロシンの濃度を定量的に計測するためにいろ
いろな方法及び装置が公知である。

かかるし−チロシンセンサーの改良型として、ポテンシ
ョメトリックな二酸化炭素電極の電極感応部にＬ−チロ
シン脱炭酸酵素を固定化した構造を有するものが最近開
発された（例えば、＾、Ｊｏｈａｎｓｏｎ。

Ｊ、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ＋　Ｂ、Ｍａｔｔｉａｓｏｎ及び
に、Ｍｏ５ｂａｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｂｙｓ、＾ｃｔａ、３０４．２１７（１９７３
）を参照されたレリ。

このＬ−チロシンセンサーを使用すると、迅速、筒便、
そして高精度にＬ−チロシンの定量を行なうことが可能
である。なお、二酸化炭素電極は、従来、ポテンショメ
トリックなものしか開発されていない。

〔問題が解決しようとする問題点〕

従来のＬ−チロシンセンザーは、上記したようにポテン
ショメトリックな二酸化炭素電極しか使用していない関
係で、夾雑物質の影響を受けやすいばかりか、感度がネ
ルンストの式により左右されるためにあるレベル以上の
感度の向上を計ることが難かしく、また、し−チロシン
脱炭酸酵素の酵素反応により発生する二酸化炭素の濃度
変化を精度よく測定したり、あるいはよりｍｆｆ１なＬ
−チロシン濃度を測定したりするうえで必ずしも満足の
いくものとは言い難い、これらの問題点が、本発明が今
解決しようとする問題点である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、このたび、本発明者らがすでに発明し、
昭和６０年１０月３日付けで特許出願したアンペロメト
リックな二酸化炭素電極を用いることにより、従来のＬ
−チロシンセンサーの有する問題点を解決し得るという
ことを見い出した。

本発明者らの発明したＬ−チロシンセンサーは、アンペ
ロメトリックな二酸化炭素電極のガス透過性膜上にＬ−
チロシン脱炭酸酵素を固定化することにより、アミノ酸
の一種であるＬ−チロシンを定量できるようにした、ハ
イブリッド型酵素・微生物電極である。

本発明は、その１つの面において、例えば体液（血液等
）のような溶液中のＬ−チロシンの濃度を測定するため
の計測方法であって、前記溶液中のＬ−チロシンをＬ−
千ロシン脱炭酸酵素の作用によりチラミンと二酸化炭素
に分解させ、住成せる二酸化炭素を前記Ｌ−チロシン脱
炭酸酵素を固定化したガス透過性膜を透過させ、この膜
を透過せる二酸化炭素をそれを選択的に資化可能な微生
物で資化し、その際にひきおこされる酸素濃度の減少を
酸素電極により電流値として測定し、この電流値の変化
量から二酸化炭素の濃度の変化を知り、これによりＬ−
チロシンの濃度を測定することを特徴とするＬ−チロシ
ン測定方法にある。

本発明者は、そのもう１つの面において、上記計測方法
を実施するため計測用センサーであって、酸素電極と、
該酸素電極のカソードの近傍に固定化されたものであっ
て二酸化炭素を選択的に資化可能な微生物と、前記カソ
ードの全体及び前記固定化微生物のそれぞれを被覆した
ガス透過性膜メ、前記固定化微生物を被覆したガス透過
性膜上に固定化されたＬ−チロシン脱炭酸酵素とを組み
合わせて含んでなることを特徴とするＬ−チロシン計測
用センサーにある。

本発明の実施において二酸化炭素電極で有利に使用する
ことのできる微生物は、二酸化炭素を選択的に資化可能
な微生物、例えばヒドロゲノモナス属、その他の属に属
する菌体である。本発明者らは、ヒドロゲノモナス属Ｔ
ＩＴ／ＦＪ−０００１Ｗ　（ａｋ工研ｌ寄第８４７３号
）、未同定のＴＩＴ／ＦＪ　−０００２凹（微工研菌寄
第８４７４号）を用いて、特に好ましい結果を得ること
ができた。これらの菌体の菌学的諸性質は次の通りであ
る。

１、　　ＴＩＴ／ＦＪ−０００１菌（工業技術院微生物
工業技術研究所、徽住物受託番号：微工研７寄第８４７
３号）−酸化炭素を主な炭素源、窒素ガスを主な窒素源
、水素ガス及び酸素ガスを化学エネルギー源とし、その
他通常使用される無機化合物と水により増殖させること
が可能な微生物である。

（ａ）　　形態的性質 ビーフェキス０．３％、ペプトン０．５％の寒天培地上
で３０℃で４日間培養するときは１×４〜５ミクロンの
桿菌で直状または油状。

７日間培養では、上記の形も若干残るが大部分は長径が
１．９〜２．１ミクロンの短稈形となる。大部分は単独
に存在するが、まれに２個位つながっていることもある
。液体培養したときも同様だが、直膨の変化に要する時
間はやや短縮される。すなわち、多形性を示す。

運動性なし。ライフソン（Ｌｅｉｆｓｏｎ）法による染
色によっては鞭毛は見当らない。胞子の形成は見られな
い。ダラム陰性、非抗酸性。

申）　培養的性質 （１）　　肉汁寒天平板培養：生育して黄色の平滑で光
沢あるコロニーを形成する。コロニーは円形。色素の拡
散は見られない。

（２）肉汁寒天斜面培養二肉汁寒天平板培養に同じ。

（３）　　肉汁液体培養二表面発育は認められない。粘
質物生成のために培養液の粘生かやや増加する。

（４）　　肉汁ゼラチン穿刺培養：生育しない。

液化も見られない。

（５）　　リドマスミルク：凝固、液化は見られない、
長時間培養するときはアルカリ性となる。

（Ｃ）　　生理的性質 硝酸塩の還元：陰性 脱窒素反応：陰性 ＭＲテスト：陰性 Ｖ−Ｐテスト：陰性 インドール性成：陰性 硫化水素の生成：陽性 デンプンの加水分解：陰性 クエン酸の利用（Ｋｏｓｅｒ培地）：陽性クエン酸の利
用（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地）：陽性硝酸塩の利用
：陽性 色素の菌体外生成：陰性 アンモニウム塩の利用：陽性 ウレアーゼ：陽性 オキシダーゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 生育の温度範囲　３０℃付近（２０℃〜３４℃）が良好 生育のｐＨ範囲　　７．０付近（４，０〜８．６）が良
好 酸素に対する態度　好気性、但し嫌気性においてわずか
ながら生 育する。

０−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法による）・
陰性 炭素源の資化性、酸及びガスの生成（資化性、酸及びガ
スの生成があるもの、ないもの、不明瞭なものを、それ
ぞれ＋、−１士で示す） 無機培地による生育性：無機化合物のみの固体または液
体培地で培養するときは、水素ガスおよび酸素ガスの共
存下に、炭酸ガス又は−酸化炭素および窒素ガスを固定
利用して旺盛に生育する。

以上の性質、特に無機培地で水素ガス、酸素ガス、炭素
ガス共存下で生育するという著しい特徴によって、本面
は明らかにヒドロゲノモナス属に分類されると考えられ
る〔バーシーズ・マニュアル・オブ・デターミナティブ
・バタテリオロジイ（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ：８版、Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗ
ｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ／Ｂａ１ｔｆｏｒｅによ
る〕。

しかしながら、ヒドロゲノモナス属は一般に極性鞭毛を
持つとされる点、又ヒドロゲノモナス属については窒素
ガス固定能力が知られておらず、また、例えばヒドロゲ
ノモナス・ニートロバＡＴＣＣ１７７０７も窒素ガス固
定能力を示さない点、本田は既記載のヒドロゲノモナス
属とは異る点があるので、別に属を設けるのが本来適当
かも知れない。

しかし一方、過去において本田と同様の性質を持つ菌が
分離され、窒素ガス固定能力を知られないままにヒドロ
ゲノモナス属に分類されている菌も当然あると考えられ
る。従って本田も差し当りヒドロゲノモナス属とするの
が適当と考える。

２、　　ＴＩＴ／ＦＪ−０００２菌（工業技術院微生物
工業技術研究所、微生物受託番号：微工研薯寄第８４７
４号）本田の同定は完了していない、しかし、科学的性
質として、二酸化炭素を資化する微生物であることはす
でに確認済みである。また、本田は好熱、性を有すると
考えられる。

上記した微生物は、この技術分野において一般的に用い
られている手法により酸素電極上に固定することができ
る。微生物をその呼吸活性を維持′させたま＼膜中に固
定化する微生物膜の調製法としては、例えば、微生物を
化学的に膜に結合させる方法（共有結合法）、微生物を
合成高分子や天然高分子マトリックス中に包括固定化す
る方法（包括法）、物理的に膜に吸着させる方法（吸着
法）などがある。多孔性ニトロセルロースの膜に微生物
を吸着固定して固定化微生物膜を調製するのがとりわけ
有利である。

同様に、酵素として用いられるＬ−チロシン脱炭酸酵素
も、この技術分野において一般的に用いられている手法
によりガス透過性膜上に固定することができる。好まし
い固定化法としては、例えば、上記した吸着法、包括法
などを包含した物理的固定化法をあげることができる。

なお、固定化の実際は以下に記載する実施例のところで
説明する。

酸素濃度の減少を測定するために用いられる酸素電極と
しては、ポーラ口型、ガルバニ型などの酸素電極をあげ
ることができる。特にガルバニ型の酸素電極は、特別な
増幅器の使用が不要となるので、有利に使用することが
できる。

また、二酸化炭素及び酸素を透過させるために用いられ
るガス透過性膜としては、シリコーンゴム膜や含ふっ素
高分子膜、例えばテフロン（商品名）のようなポリテト
ラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜、テトラフルオロエ
チレンとへキサフルオロプロピレンの共重合体（ＦＥＰ
）の膜などをあげることができる。

〔作　用〕

本発明の作用の理解を容易ならしめるため、添付の第１
図を参照しながら本発明のＬ−チロシン計測用センサー
の原理を説明する。

先ず、Ｌ−チロシンの全く存在しない状態では、緩衝液
（図示せず）中の溶液酸素（０２）は酸素電極のカソー
ド５の近傍まで拡散する。すなわち、Ｏ２は、固定化酵
素Ｍ９、ガス透過性膜１、固定化微生物膜２、そしてガ
ス透過性膜４を順次透過してカソード５の近傍に到達し
、よって、酸素電極に一定の電流が流れる。この状態で
、一定濃度のＬ−チロシンを含む試料溶液（図示せず）
を緩衝液中に添加すると、固定化されたＬ−チロシン脱
炭酸酵素ｌＯの作用により、次式により表わされるよう
な二酸化炭素生成反応（分解反応）が発生する。

Ｈ２ 生成した二酸化炭素（図示のＣ０ｔ）は、ガス透過性膜
１を透過した後、固定化微生物膜２の微生物３の近傍に
到達する。微生物３は、二酸化炭素を資化し、この際呼
吸活性が盛んになり酸素が消費され、したがって、膜近
傍の酸素濃度が低下する。

この酸素濃度の低下量を、酸素が透過可能なガス透過性
膜４を介して酸素電極（カソード）５に到達する酸素量
から測定し、結果としてひきおこされる電流値の低下を
ベースとして二酸化炭素濃度を測定することができる。

このようにして二酸化炭素濃度の変化がわかれば、全問
題となっているＬ−チロシンの濃度も容易に知ることが
できる。

本発明において、酵素を固定することにより、高価な酵
素を無駄なく使用できるばかりでなく、Ｌ−チロシンセ
ンサーの特性も長期的に安定に保つことができる。また
、酵素をガス透過性膜上に直接固定することにより、応
答時間を短縮することができる。

〔実施例〕

本例では、第２図に略示されるような構造をもったＬ−
チロシン計測用センサーを製作した。図中の７は酸素電
極本体であり、カソード（Ｐｔ）５及びアノード（Ｐｔ
）６も有している。この電極の場合、電解液８としてＩ
　Ｎ　ＫＯＨを使用した。酸素電極７は、そのカソード
５の部分が完全に覆われるようにテフロン（商品名）！
！のガス透過性膜４で被覆されている。さらに、この膜
４の外側に配置された微生物３の固定化膜２ちまたテフ
ロン製のガス透過性膜１で被覆されている。また、ガス
透過性膜１上には固定化酵素膜９が直接的に付着せしめ
られている。１１は、ガス透過性膜を固定するための輪
ゴム（０リングでもよい）である。

このセンサーの製作例を以下に示す： 予め殺菌した坂ロフラスコに、ビーフェキス０、３％、
ペプトン０．５％及び蒸留水９９．２％からなる液体培
地１００ｍ６を加えた。この培地にヒドロゲノモナス属
ＴＩＴ／ＦＪ　−０００１菌（微工研菌寄第８４７３号
）を接種し、好気的条件下で３０℃で４日間培養した０
次いで、菌を培地ごと５　ｍ　ｌの量で採取し、これを
孔径０．２μｍの多孔性ニトロセルロース製メンブラン
フィルタ−上に吸引濾過し、０．０５Ｍ　Ｋ）１２ＰＯ
４／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５，５）で洗浄した。

一方、テフロン（商品名）製のガス透過性膜上への酵素
の固定を次のようにして行なった。先ず、ＩｍｇのＬ−
チロシン脱炭酸酵素を溶解した１５％Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ｂ
ｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｔｎ）溶液を孔径
０．５μｍのテフロン（商品名）類ガス透過性膜上に滴
下した。次いで、３μａの２５％グルタルアルデヒド水
溶液を加えて入念に混ぜ合わせた。数分後に粘性が出て
きたけれども、反応を完全にするために３０分間はど放
置した。その後、水で１５分間洗浄し、さらに０．１Ｍ
グリシン水溶液に１５分間浸し、そして再び水で１５分
間洗浄した７次いで、上記のようにして菌を濾過した膜
２を、第２図に示されるように、菌体３のついている側
をガルバニ型の酸素電極７のカソード５の面に向けて配
置し、さらにその外側を菌体固定膜２及び酸素電極のカ
ソード５の部分が完全に覆われるようにテフロン（商品
名）製のガス透過性膜１で被覆した。ガス透過性膜ｌ上
には上記のようにして固定した固定化酵素膜９が直接的
に付着せしめられている。最後に、ガス透過性膜１を輪
ゴム１１で固定することによって、図示のＬ−チロシン
センサーが完成した。

本例では、Ｌ−チロシン計測の一例として、緩衝液中の
溶存Ｌ−チロシン濃度の測定を行なった。

使用した緩衝液は、０．０５Ｍ　ＫＴｏＰＯ４／ＮａＯ
Ｈ緩衝液（３０℃、ｐＨ５，５）であった。この緩衝液
中に上記のようにして製作したＬ−チロシンセンサーを
浸した後、安定するまで放置した。センサーの安定後、
所定量のＬ−チロシン水溶液をマイクロシリンジによ、
り緩衝液中に添加していった。一連の測定の完了後、Ｌ
−チロシン濃度とセンサーで測定した電流の減少量の関
係をプロットしたところ、第３図に示すような検量線が
得られた。Ｌ−チロシン濃度をさらに高めつつ測定を行
なったところ、Ｌ−チロシン濃度が６０ＭＭである付近
まで、Ｌ−チロシン濃度とセンサーの酸素電極の電流減
少量との間に比例関係が認められた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、Ｌ−チロシンセンサーをアンペロメト
リックに製作することができるので、夾雑物質の影響を
減らし、従来のポテンショメトリックな二酸化炭素電極
を使用したセンサーよりも高感度な計測を可能にするこ
とができ、また、センサーの応用分野も拡げることがで
きる。また、本発明によれば、ガルバニ型酸素電極の使
用により、より簡単な計測が可能になる。さらにまた、
本発明によれば、固定化酵素がガス透過性膜上に直接固
定されているので応答時間を短縮することかでき、よっ
て、より迅速なＬ−チロシンの計測が可能である０本発
明のＬ−チロシンセンサーはまた、その特性が長期的に
安定である。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明のＬ−チロシンセンサーの原理図、 第２図は、本発明のＬ−チロシンセンサーの好ましい一
例を示した構造図、そして 第３図は、本発明のＬ−チロシンセンサーの１検量線で
ある。 図中、１及び４はガス透過性膜、２は固定化微生物膜、
３は微生物、５は酸素電極のカソード、９は固定化酵素
膜、そしてＩＯは酵素である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、溶液中のＬ−チロシンの濃度を測定するための計測
   方法であって、前記溶液中のＬ−チロシンをＬ−チロシ
   ン脱炭酸酵素の作用によりチラミンと二酸化炭素に分解
   させ、生成せる二酸化炭素を前記Ｌ−チロシン脱炭酸酵
   素を固定化したガス透過性膜を透過させ、この膜を透過
   せる二酸化炭素をそれを選択的に資化可能な微生物で資
   化し、その際にひきおこされる酸素濃度の減少を酸素電
   極により電流値として測定し、この電流値の変化量から
   二酸化炭素の濃度の変化を知り、これによりＬ−チロシ
   ンの濃度を測定することを特徴とするＬ−チロシン計測
   方法。 ２、前記ガス透過性膜がシリコーンゴム膜である、特許
   請求の範囲第１項に記載のＬ−チロシン計測方法。 ３、前記ガス透過性膜が含ふっ素高分子膜である、特許
   請求の範囲第１項に記載のＬ−チロシン計測方法。 ４、前記微生物がヒドロゲノモナス属に属する菌体であ
   る、特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記
   載のＬ−チロシン計測方法。 ５、前記酸素電極がガルバニ型酸素電極である、特許請
   求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載のＬ−チ
   ロシン計測方法。 ６、溶液中のＬ−チロシンの濃度をアンペロメトリーに
   基いて測定するための計測用センサーであって、酸素電
   極と、該酸素電極のカソードの近傍に固定化されたもの
   であって二酸化炭素を選択的に資化可能な微生物と、前
   記カソードの全体及び前記固定化微生物のそれぞれを被
   覆したガス透過性膜と、前記固定化微生物を被覆したガ
   ス透過性膜上に固定化されたＬ−チロシン脱炭酸酵素と
   を組み合わせて含んでなることを特徴とするＬ−チロシ
   ン計測用センサー。 ７、前記酸素電極がガルバニ型酸素電極である、特許請
   求の範囲第６項に記載のＬ−チロシン計測用センサー。 ８、前記ガス透過性膜がシリコーンゴム膜である、特許
   請求の範囲第６項又は第７項に記載のＬ−チロシン計測
   用センサー。 ９、前記ガス透過性膜が含ふっ素高分子膜である、特許
   請求の範囲第６項又は第７項に記載のＬ−チロシン計測
   用センサー。 １０、前記微生物がヒドロゲノモナス属に属する菌体で
   ある、特許請求の範囲第６項〜第９項のいずれか１項に
   記載のＬ−チロシン計測用センサー。