JP2821634B2 - バイオセンサーによる試料添加式定量方法 - Google Patents
バイオセンサーによる試料添加式定量方法Info
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- JP2821634B2 JP2821634B2 JP1326803A JP32680389A JP2821634B2 JP 2821634 B2 JP2821634 B2 JP 2821634B2 JP 1326803 A JP1326803 A JP 1326803A JP 32680389 A JP32680389 A JP 32680389A JP 2821634 B2 JP2821634 B2 JP 2821634B2
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- enzyme
- membrane
- oxygen
- biosensor
- immobilized enzyme
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、バイオセンサーによる試料添加式定量方法
に関する。
に関する。
従来技術及びその課題 バイオセンサーには、酵素センサー、免疫センサー、
微生物センサー等があり、生物特有の分子認識機能を巧
みに利用して化学物質を計測するものである。これらバ
イオセンサーは、医療計測、食品分析、環境計測等の分
野での有用性が高く、近年より実質的なものの開発が進
められている。上記分野等で実施されている計測方法に
は、例えば酵素反応を利用したアンペロメトリックなバ
イオセンサーを用いて、溶液中に含有する化学物質の濃
度を計測する方法がある。ここで用いられるバイオセン
サーの一つとして、酸素電極を酵素で被覆する方法があ
る。現在市販されている酸素電極は、酸素ガス透過性膜
を通過した酸素が酸素電極内部の電解液中に溶解し、直
ちに金属（金、白金等）表面上で電解還元されて生ずる
還元電流を測定する目的のものである。ここで重要なこ
とは、最終的に酸素が電極で消費される速度と透過性膜
に接する試料溶液から補給される速度とが同じになり、
試料溶液中の酸素濃度に比例した一定電流値が得られる
ことである。この場合には、酸素を消費する反応を触媒
する酵素を有する薄膜を透過性膜上に固定すれば特定の
基質のみに応答する酵素電極を作製することができ、選
択的に試料溶液中の化学物質濃度を計測することができ
る。
微生物センサー等があり、生物特有の分子認識機能を巧
みに利用して化学物質を計測するものである。これらバ
イオセンサーは、医療計測、食品分析、環境計測等の分
野での有用性が高く、近年より実質的なものの開発が進
められている。上記分野等で実施されている計測方法に
は、例えば酵素反応を利用したアンペロメトリックなバ
イオセンサーを用いて、溶液中に含有する化学物質の濃
度を計測する方法がある。ここで用いられるバイオセン
サーの一つとして、酸素電極を酵素で被覆する方法があ
る。現在市販されている酸素電極は、酸素ガス透過性膜
を通過した酸素が酸素電極内部の電解液中に溶解し、直
ちに金属（金、白金等）表面上で電解還元されて生ずる
還元電流を測定する目的のものである。ここで重要なこ
とは、最終的に酸素が電極で消費される速度と透過性膜
に接する試料溶液から補給される速度とが同じになり、
試料溶液中の酸素濃度に比例した一定電流値が得られる
ことである。この場合には、酸素を消費する反応を触媒
する酵素を有する薄膜を透過性膜上に固定すれば特定の
基質のみに応答する酵素電極を作製することができ、選
択的に試料溶液中の化学物質濃度を計測することができ
る。
一般的に、上記のようなバイオセンサーを用いて試料
溶液中の基質濃度を計測するには、対象となる基質を含
有しない定酸素濃度の標準溶液にセンサーを浸した状態
で、標準溶液中に試料を添加し、センサー表面で生じる
酵素反応に伴う溶液中の酸素濃度の減少値を電流値とし
て計測してその変化量を求め、基質濃度に換算してい
た。しかしながら、この計測方法では、測定誤差を小さ
くするために試料をある程度の量添加しなければなら
ず、しかも標準溶液の取り換え及びセンサーの洗浄を毎
回行わなくてはならない煩しさがあった。
溶液中の基質濃度を計測するには、対象となる基質を含
有しない定酸素濃度の標準溶液にセンサーを浸した状態
で、標準溶液中に試料を添加し、センサー表面で生じる
酵素反応に伴う溶液中の酸素濃度の減少値を電流値とし
て計測してその変化量を求め、基質濃度に換算してい
た。しかしながら、この計測方法では、測定誤差を小さ
くするために試料をある程度の量添加しなければなら
ず、しかも標準溶液の取り換え及びセンサーの洗浄を毎
回行わなくてはならない煩しさがあった。
課題を解決するための手段 本発明者は、上記従来の計測方法に代わる簡便な計測
方法を新たに提供すべく鋭意研究を重ねてきた結果、酸
素電極に固定化酵素膜を設けた酵素センサーを上向きの
タイプに改良し、該固定化酵素膜上に試料溶液の微小量
を添加するだけで目的となる基質の定量を行うことがで
きることを見出し、本発明を完成させるに至った。
方法を新たに提供すべく鋭意研究を重ねてきた結果、酸
素電極に固定化酵素膜を設けた酵素センサーを上向きの
タイプに改良し、該固定化酵素膜上に試料溶液の微小量
を添加するだけで目的となる基質の定量を行うことがで
きることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、次の新規な定量方法を提供する
ものである。
ものである。
酵素を触媒とし、酸素を電子供与体とする反応を利
用して溶液中の基質の定量を行うに際して、酸素透過性
のゲート表面に固定化酵素膜が設けられ、該固定化酵素
膜と緩衝液を介して接続された内部電極を備えたバイオ
センサーを用いて、予め前記緩衝液により前記固定化酵
素膜を酵素反応に適したpH値に維持し、該センサーの固
定化酵素膜上に試料溶液の微少量を添加することを特徴
とする試料添加式定量方法。
用して溶液中の基質の定量を行うに際して、酸素透過性
のゲート表面に固定化酵素膜が設けられ、該固定化酵素
膜と緩衝液を介して接続された内部電極を備えたバイオ
センサーを用いて、予め前記緩衝液により前記固定化酵
素膜を酵素反応に適したpH値に維持し、該センサーの固
定化酵素膜上に試料溶液の微少量を添加することを特徴
とする試料添加式定量方法。
本発明の定量方法は、酸化酵素を触媒とする酵素反応
による酸素消費量を指標として行われるものである。こ
の酸素消費量をモニターするために本発明では、バイオ
センサーを用いる。本発明におけるバイオセンサーと
は、酸素透過性のゲート表面に酵素含有膜が固定され、
該酵素含有膜と緩衝液を介して接続された内部電極を備
えたものを意味する。このバイオセンサーを作製する最
も簡単な方法は、市販の酸素電極の酸素ガス透過性膜上
に固定化酵素膜を設ける方法である。
による酸素消費量を指標として行われるものである。こ
の酸素消費量をモニターするために本発明では、バイオ
センサーを用いる。本発明におけるバイオセンサーと
は、酸素透過性のゲート表面に酵素含有膜が固定され、
該酵素含有膜と緩衝液を介して接続された内部電極を備
えたものを意味する。このバイオセンサーを作製する最
も簡単な方法は、市販の酸素電極の酸素ガス透過性膜上
に固定化酵素膜を設ける方法である。
本発明によれば、酸化触媒を有する化学物質（基質）
の全てを計測することができる。第１表に主な基質とそ
の酸化酵素を示す。
の全てを計測することができる。第１表に主な基質とそ
の酸化酵素を示す。
本発明における固定化酵素膜とは、化学的結合（例え
ば共有結合）或いは物理的結合（例えば吸着）を問わ
ず、酵素を結合含有する膜を意味する。酵素固定化に用
いる膜としては、酵素を固定でき、ガス透過性であれば
特に限定されることなく使用できる。具体的には、例え
ばガラスファイバー、炭素繊維、セルロース繊維、多孔
性ガラスビーズ等からなるものを挙げることができる。
酵素の含有量も特に限定されないが、酵素の含有量が多
ければ反応速度は速くなる（センサーの応答は速くな
る）。酵素固定の際には、酵素を膜に均一な濃度で固定
することが望ましい。これら固定化酵素膜は、計測に際
して予め酵素反応に適したpH値を維持する通常の緩衝液
で湿潤されて用いるのがよい。
ば共有結合）或いは物理的結合（例えば吸着）を問わ
ず、酵素を結合含有する膜を意味する。酵素固定化に用
いる膜としては、酵素を固定でき、ガス透過性であれば
特に限定されることなく使用できる。具体的には、例え
ばガラスファイバー、炭素繊維、セルロース繊維、多孔
性ガラスビーズ等からなるものを挙げることができる。
酵素の含有量も特に限定されないが、酵素の含有量が多
ければ反応速度は速くなる（センサーの応答は速くな
る）。酵素固定の際には、酵素を膜に均一な濃度で固定
することが望ましい。これら固定化酵素膜は、計測に際
して予め酵素反応に適したpH値を維持する通常の緩衝液
で湿潤されて用いるのがよい。
また、上記固定化酵素膜と内部電極とを接続する緩衝
液としては、例えばグリシン−NaOH（pH8.6）、クエン
酸リン酸（pH5.6）、トリス（pH8.0）等が挙げられる。
液としては、例えばグリシン−NaOH（pH8.6）、クエン
酸リン酸（pH5.6）、トリス（pH8.0）等が挙げられる。
以上のようにして構成されるバイオセンサーは、本発
明において、固定化酵素膜を上向きとして用いられ、そ
の膜上に試料溶液を滴下することで計測される。また、
酵素を用いるので、極めて高選択的に基質の定量が可能
である。
明において、固定化酵素膜を上向きとして用いられ、そ
の膜上に試料溶液を滴下することで計測される。また、
酵素を用いるので、極めて高選択的に基質の定量が可能
である。
第１図に本発明の定量方法及びその装置を概略的に説
明するためのモデルを示すが、本発明は、これに限定さ
れるものではない。以下、第１図を参照しつつ詳述す
る。
明するためのモデルを示すが、本発明は、これに限定さ
れるものではない。以下、第１図を参照しつつ詳述す
る。
固定化酵素膜固定具（２）、固定化酵素膜（３）、酸
素透過性膜（４）及び電極本体（５）からなるバイオセ
ンサー（１）は、大気中から膜（３）及び（４）を通過
した酸素が連続的に電解還元されて一定電流を示す。従
って、膜（３）中では酸素の濃度勾配ができ膜（４）表
面の酸素濃度によって電流値は一義的に定まることにな
る。この状態で、マイクロシリンジ、マイクロピペット
等により基質を含む試料溶液を膜（３）上に滴下する
と、直ちに酵素反応が進行して酸素が消費され、膜
（４）上の酸素濃度が減少し、還元電流は減少する。し
かしながら、反応液中の基質がある量まで減少したと
き、酵素反応による酸素消費量と大気中から供給される
酸素量とが等しくなる点、すなわち平衡点が存在し、そ
の後平衡点を過ぎると酸素濃度は基質滴下前の状態へと
戻る。ここで重要なことは、本発明の方法では、微量の
基質でも計測できるために試料溶液の１〜1000μ程度
を添加すれば十分計測が可能であることである。このた
めに、短時間で酵素反応は平衡状態に達し、初期の酸素
濃度に戻り、還元電流ももとの値に戻る。そして、再び
他の試料の計測が可能となる（第２図参照）。
素透過性膜（４）及び電極本体（５）からなるバイオセ
ンサー（１）は、大気中から膜（３）及び（４）を通過
した酸素が連続的に電解還元されて一定電流を示す。従
って、膜（３）中では酸素の濃度勾配ができ膜（４）表
面の酸素濃度によって電流値は一義的に定まることにな
る。この状態で、マイクロシリンジ、マイクロピペット
等により基質を含む試料溶液を膜（３）上に滴下する
と、直ちに酵素反応が進行して酸素が消費され、膜
（４）上の酸素濃度が減少し、還元電流は減少する。し
かしながら、反応液中の基質がある量まで減少したと
き、酵素反応による酸素消費量と大気中から供給される
酸素量とが等しくなる点、すなわち平衡点が存在し、そ
の後平衡点を過ぎると酸素濃度は基質滴下前の状態へと
戻る。ここで重要なことは、本発明の方法では、微量の
基質でも計測できるために試料溶液の１〜1000μ程度
を添加すれば十分計測が可能であることである。このた
めに、短時間で酵素反応は平衡状態に達し、初期の酸素
濃度に戻り、還元電流ももとの値に戻る。そして、再び
他の試料の計測が可能となる（第２図参照）。
上記還元電流の減少は、例えばポテンシオスタット、
電流計を通してレコーダーで記録される。
電流計を通してレコーダーで記録される。
上記酸素濃度の平衡点と初期酸素濃度との差（電流減
少ピーク高さ）は、基質量と直線相関を示し、試料溶液
の滴下量から基質濃度を換算することができる。
少ピーク高さ）は、基質量と直線相関を示し、試料溶液
の滴下量から基質濃度を換算することができる。
発明の効果 本発明によれば、下記の如き顕著な効果を達成するこ
とができる。
とができる。
（イ）試料量が微量で定量が可能である。
（ロ）測定毎にセンサーを洗浄する必要がなく、連続測
定が可能である。
定が可能である。
（ハ）操作が簡便で、測定時間は数分と短い。
（ホ）選択性に優れ且つ高精度での定量が可能である。
（ニ）固定化酵素膜は、化学的に酵素を固定したものと
する必要はなく、単に含浸させた程度のものでも十分に
使用でき、測定毎に該膜だけを使い捨てにすることによ
り、高精度の測定が簡便に行える。
する必要はなく、単に含浸させた程度のものでも十分に
使用でき、測定毎に該膜だけを使い捨てにすることによ
り、高精度の測定が簡便に行える。
このように、本発明の定量方法は、従来法に比して、
簡便で、測定時間を大巾に短縮することができるもので
ある。
簡便で、測定時間を大巾に短縮することができるもので
ある。
実 施 例 以下に実施例を示し、本発明の特徴とするところを一
層明確なものとする。
層明確なものとする。
実施例１ グリシン−NaOH緩衝液（pH8.6）2ml中にウリカーゼ2m
gを溶解し、これを直径18mmの円形に切ったろ紙（ワッ
トマンGF/C）に含浸させて、固定化酵素膜とした。そし
てこの膜を酸素電極（電気化学計器（株）製）に固定し
た。次に、ポテンシオスタットにより、−0.7Vの電位を
印加し、バックグラウンド電流が安定した後、酵素膜上
に試料を10μ滴下し電流測定を行った。試料にまず尿
酸標準液を用いて、検量線を得（第３図）、次に人尿を
用いて、含有する尿酸濃度を測定した。測定値と比色法
で求めた値とを比較した結果を第２表に示す。この結果
から、両者の値が良く一致していることがわかる。ま
た、数分程度で１回の測定を終えることができ、本発明
の方法によれば迅速且つ簡便に測定できることがわか
る。
gを溶解し、これを直径18mmの円形に切ったろ紙（ワッ
トマンGF/C）に含浸させて、固定化酵素膜とした。そし
てこの膜を酸素電極（電気化学計器（株）製）に固定し
た。次に、ポテンシオスタットにより、−0.7Vの電位を
印加し、バックグラウンド電流が安定した後、酵素膜上
に試料を10μ滴下し電流測定を行った。試料にまず尿
酸標準液を用いて、検量線を得（第３図）、次に人尿を
用いて、含有する尿酸濃度を測定した。測定値と比色法
で求めた値とを比較した結果を第２表に示す。この結果
から、両者の値が良く一致していることがわかる。ま
た、数分程度で１回の測定を終えることができ、本発明
の方法によれば迅速且つ簡便に測定できることがわか
る。
実施例２ ろ紙に代えて炭素繊維フェルト薄膜（大阪ガス（株）
製“M20"を用いた以外は実施例１と同様に測定を行っ
た。その結果、実施例１同様、良好な結果が得られた。
また、炭素繊維フェルト薄膜を用いたときは、ろ紙のと
きより迅速な応答が得られた。
製“M20"を用いた以外は実施例１と同様に測定を行っ
た。その結果、実施例１同様、良好な結果が得られた。
また、炭素繊維フェルト薄膜を用いたときは、ろ紙のと
きより迅速な応答が得られた。
実施例３ 実施例１におけるろ紙に代えて多孔性ガラスビーズ
（エレクトロヌクレオニクス インコーポレーテッド製
“アミノアリルCPG80−120"）を用いて測定を行った。
但し、酵素を含浸させた多孔性ガラスビーズは、これよ
り目の小さいナイロン製又はテフロン製のメッシュシー
トに挾んで酵素電極に固定した。その結果、実施例１と
同様、良好な結果が得られた。しかし、多孔性ラスビー
ズを用いたときには、ろ紙、炭素繊維フェルト薄膜を用
いたときに比べて酵素化活性寿命は、短かく、数日しか
良好な活性を示さなかった。
（エレクトロヌクレオニクス インコーポレーテッド製
“アミノアリルCPG80−120"）を用いて測定を行った。
但し、酵素を含浸させた多孔性ガラスビーズは、これよ
り目の小さいナイロン製又はテフロン製のメッシュシー
トに挾んで酵素電極に固定した。その結果、実施例１と
同様、良好な結果が得られた。しかし、多孔性ラスビー
ズを用いたときには、ろ紙、炭素繊維フェルト薄膜を用
いたときに比べて酵素化活性寿命は、短かく、数日しか
良好な活性を示さなかった。
実施例４ クエン酸リン酸緩衝液（pH5.6）2ml中にグルコースオ
キシターゼ2mgを溶解し、これを直径18mmの円形に切っ
たガラス繊維ろ紙（アドバンテック東洋（株）製“GC−
50"）に含浸させて固定化酵素膜とした。この膜を用い
て、人、牛及び馬の血清（10倍希釈）中のグルコース濃
度を実施例１と同様にして測定した。
キシターゼ2mgを溶解し、これを直径18mmの円形に切っ
たガラス繊維ろ紙（アドバンテック東洋（株）製“GC−
50"）に含浸させて固定化酵素膜とした。この膜を用い
て、人、牛及び馬の血清（10倍希釈）中のグルコース濃
度を実施例１と同様にして測定した。
測定値と比色法により値とを比較した結果を第３表に
示す。このように本発明の方法は、基質の定量を迅速且
つ簡便に行うことができる。
示す。このように本発明の方法は、基質の定量を迅速且
つ簡便に行うことができる。
第１図は、本発明の定量方法を説明するためのモデルの
一例を示す図である。第２図は、基質添加前後における
電流値の経時変化を示すグラフである。第３図は、尿標
準液の検量線グラフである。 （１）バイオセンサー （２）固定化酵素膜固定具 （３）固定化酵素膜 （４）酸素透過性膜 （５）電極本体
一例を示す図である。第２図は、基質添加前後における
電流値の経時変化を示すグラフである。第３図は、尿標
準液の検量線グラフである。 （１）バイオセンサー （２）固定化酵素膜固定具 （３）固定化酵素膜 （４）酸素透過性膜 （５）電極本体
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 27/327
Claims (1)
- 【請求項１】酸素を触媒とし、酸素を電子供与体とする
反応を利用して溶液中の基質の定量を行うに際して、酸
素透過性のゲート表面に固定化酵素膜が設けられ、該固
定化酵素膜と緩衝液を介して接続された内部電極を備え
たバイオセンサーを用いて、予め前記緩衝液により前記
固定化酵素膜を酵素反応に適したpH値に維持し、該セン
サーの固定化酵素膜上に試料溶液の微少量を添加するこ
とを特徴とする試料添加式定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1326803A JP2821634B2 (ja) | 1989-12-15 | 1989-12-15 | バイオセンサーによる試料添加式定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1326803A JP2821634B2 (ja) | 1989-12-15 | 1989-12-15 | バイオセンサーによる試料添加式定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03186756A JPH03186756A (ja) | 1991-08-14 |
| JP2821634B2 true JP2821634B2 (ja) | 1998-11-05 |
Family
ID=18191883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1326803A Expired - Lifetime JP2821634B2 (ja) | 1989-12-15 | 1989-12-15 | バイオセンサーによる試料添加式定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2821634B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63128251A (ja) * | 1986-11-19 | 1988-05-31 | Seitai Kinou Riyou Kagakuhin Shinseizou Gijutsu Kenkyu Kumiai | 電界効果トランジスタ型生化学センサ |
-
1989
- 1989-12-15 JP JP1326803A patent/JP2821634B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03186756A (ja) | 1991-08-14 |
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