JPH03186756A

JPH03186756A - バイオセンサーによる試料添加式定量方法

Info

Publication number: JPH03186756A
Application number: JP1326803A
Authority: JP
Inventors: Shuichi Suzuki; 周一鈴木; Shunichi Uchiyama; 俊一内山; Tomohiro Sato; 知広佐藤
Original assignee: Osaka Gas Co Ltd
Current assignee: Osaka Gas Co Ltd
Priority date: 1989-12-15
Filing date: 1989-12-15
Publication date: 1991-08-14
Anticipated expiration: 2013-11-05
Also published as: JP2821634B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、バイオセンサーによる試料添加式定量方法に
関する。

従来技術及びその課題バイオセンサーには、酵素センサー、免疫センサー、微
生物センサー等があり、生物特有の分子認識機能を巧み
に利用して化学物質を計測するものである。これらバイ
オセンサーは、医療計測、食品分析、環境計測等の分野
での有用性が高く、近年より実質的なものの開発が進め
られている。

上記分野等で実施されている計測方法には、例えば酵素
反応を利用したアンペロメトリックなバイオセンサーを
用いて、溶液中に含有する化学物質の濃度を計測する方
法がある。ここで用いられるバイオセンサーの一つとし
て、酸素電極を酵素で被覆する方法がある。現在市販さ
れている酸素電極は、酸素ガス透過性膜を通過した酸素
が酸素電極内部の電解液中に溶解し、直ちに金属（金、
白金等）表面上で電解還元されて生ずる還元電流を測定
する目的のものである。ここで重要なことは、最終的に
酸素が電極で消費される速度と透過性膜に接する試料溶
液から補給される速度とが同じになり、試料溶液中の酸
素濃度に比例した一定電流値が得られることである。こ
の場合には、酸素を消費する反応を触媒する酵素を有す
る薄膜を透過性膜上に固定すれば特定の基質のみに応答
する酵素電極を作製することができ、選択的に試料溶液
中の化学物質濃度を計ａｔｌＪすることができる。

−殻内に、上記のようなバイオセンサーを用いて試料溶
液中の基質濃度を計測するには、対象となる基質を含有
しない定酸素濃度の標準溶成にセンサーを浸した状態で
、標準溶液中に試料を添加し、センサー表面で生じる酵
素反応に伴う溶液中の酸素濃度の減少値を電流値として
計測してその変化量を求め、基質濃度に換算していた。

しかしながら、この計測方法では、測定誤差を小さくす
るために試料をある程度の量添加しなければならず、し
かも標準溶成の取り換え及びセンサーの洗浄を毎回行わ
なくてはならない煩しさがあった。

課題を解決するための手段本発明者は、上記従来の計測方法に代わる簡便な計測方
法を新たに提供すべく鋭意研究を重ねてきた結果、酸素
電極に固定化酵素膜を設けた酵素センサーを上向きのタ
イプに改良し、該固定化酵素膜上に試料溶液の微小量を
添加するだけで目的となる基質の定量を行うことができ
ることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、次の新規な定量方法を提供するも
のである。

■　酵素を触媒とし、酸素を電子供与体とする反応を利
用して溶液中の基質の定量を行うに際して、酸素透過性
のゲート表面に固定化酵素膜が設けられ、該固定化酵素
膜と緩衝液を介して接続された内部電極を備えたバイオ
センサーを用いて、該センサーの固定化酵素膜」二に試
料溶液の微小量を添加することを特徴とする試料添加式
定量方法。

本発明の定量方法は、酸化酵素を触媒とする酵素反応に
よる酸素消費量を指標として行われるものである。この
酸素消費量をモニターするために本発明では、バイオセ
ンサーを用いる。本発明におけるバイオセンサーとは、
酸素透過性のゲート表面に酵素含有膜が固定され、該酵
素含有膜と緩衝液を介して接続された内部電極を備えた
ものを意味する。このバイオセンサーを作製する最も簡
単な方法は、市販の酸素電極の酸素ガス透過性膜上に固
定化酵素膜を設ける方法である。

本発明によれば、酸化触媒を有する化学物質（基質）の
全てを計測することができる。第１表に主な基質とその
酸化酵素を示す。

部表本発明における固定化酵素膜とは、化学的結合（例えば
共有結合）或いは物理的結合（例えば吸着）を問わず、
酵素を結合含有する膜を意味する。

酵素固定化に用いる膜としては、酵素を固定でき、ガス
透過性であれば特に限定されることなく使用できる。具
体的には、例えばガラスファイバー炭素繊維、セルロー
ス繊維、多孔性ガラスピーズ等からなるものを挙げるこ
とができる。酵素の含有量も特に限定されないが、酵素
の含有量が多ければ反応速度は速くなる（センサーの応
答は速くなる）。酵素固定の際には、酵素を膜に均一な
濃度で固定することが望ましい。これら固定化酵素膜は
、計測に際して予め酵素反応に適したｐＨ値を維持する
通常の緩衝液で湿潤させて用いるのがよい。

また、上記固定化酵素膜と内部電極とを接続する緩衝液
としては、例えばグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ８，６）　
、クエン酸リン酸（ｐＨ５，６）、トリス（ｐＨ８，０
）等が挙げられる。

以−ヒのようにして構成されるバイオセンサーは、本発
明において、固定化酵素膜を上向きとして用いられ、そ
の膜上に試料溶液を滴下することで計測される。また、
酵素を用いるので、極めて高選択的に基質の定量が可能
である。

第１図に本発明の定量方法及びその装置を概略的に説明
するためのモデルを示すが、本発明は、これに限定され
るものではない。以下、第１図を参照しつつ詳述する。

固定化酵素膜固定具（２）、固定化酵素膜（３）、酸素
透過性膜（４）及び電極本体（５）からなるバイオセン
サー（１）は、大気中から膜（３）及び（４）を通過し
た酸素が連続的に電解還元されて一定電流を示す。従っ
て、膜（３）中では酸素の濃度勾配ができ膜（４）表面
の酸素濃度によって電流値は一義的に定まることになる
。この状態で、マイクロシリンジ、マイクロピペット等
により基質を含む試料溶液を膜（３）上に滴下すると、
直ちに酵素反応が進行して酸素が消費され、膜（４）上
の酸素濃度が減少し、還元電流は減少する。しかしなが
ら、反応酸中の基質がある量まで減少したとき、酵素反
応による酸素消費量と大気中から供給される酸素量とが
等しくなる点、すなわち平衡点が存在し、その後平衡点
を過ぎると酸素ｌ農度は基質滴下前の状態へと戻る。こ
こで重要なことは、本発明の方法では、微量の基質でも
計測できるために試料溶液の１〜１０００μｍ程度を添
加すれば十分計測が可能であることである。

このために、短時間で酵素反応は平衡状態に達し、初期
の酸素濃度に戻り、還元電流ももとの値に戻る。そして
、再び他の試料の計測が可能となる（第２図参照）。

Ｆ記還元電流の減少は、飼えばポテンシオスタット、電
流計を通してレコーダーで記録される。

上記酸素濃度の平衡点と初期酸素濃度との差（電流減少
ピーク高さ）は、基質量と直線相関を示し、試料溶液の
滴下量から基質濃度を換算することができる。

光間の効果本発明によれば、下記の如き顕著な効果を達成すること
ができる。

（イ）試料量が微量で定量が可能である。

（ロ）測定毎にセンサーを洗浄する必要がなく、連続測
定が可能である。

（ハ）操作が簡便で、測定時間は数分と短い。

（ホ）選択性に優れ且つ高精度での定量が可能である。

（ニ）固定化酵素膜は、化学的に酵素を固定したものと
する必要はなく、単に含浸させた程度のものでも十分に
使用でき、測定毎に誤脱だけを使い捨てにすることによ
り、高精度の測定が簡便に行える。

このように、本発明の定量方法は、従来法に比して、簡
便で、測定時間を大巾に短縮することができるものであ
る。

実施例以下に実施例を示し、本発明の特徴とするところを−層
明確なものとする。

実施例１グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８，６）　２１ｎＣ中
にウリカーゼ２ｍｇを溶解し、これを直径１８ｍｍの円
形に切ったろ紙（ワットマンＧＦ／Ｃ）に含浸させて、
固定化酵素膜とした。そしてこの膜を酸素電極（電気化
学計器（株）製）に固定した。

次に、ポテンシオスタットにより、−０，７Ｖの電位を
印加し、バックグラウンド電流が安定した後、酵素膜−
にに試料を１０μ１滴下し電流測定を行った。試料にま
ず尿酸標準波を用いて、検量線を得（第３図）、次に人
尿を用いて、含有する尿酸濃度を測定した。／ｌ１ｌｌ
定値と比色法で求めた値とを比較した結果を第２表に示
す。この結果から、両者の値が良く一致していることが
わかる。また、数分程度で１回の測定を終えることがで
き、本発明の方法によれば迅速且つ簡便に／ｌ１ｌｊ定
できることがわかる。

刀表実施例２ろ紙に代えて炭素繊維フェルト薄膜（大阪ガス（株）製
“Ｍ２Ｏ“を用いた以外は実施例１と同様にｆｌ［１１
定を行った。その結果、実施例１同様、良好な結果が得
・られた。また、炭素繊維フェルト薄膜を用いたときは
、ろ紙のときより迅速な応答が得られた。

実施例３実施例１におけるろ紙に代えて多孔性ガラスピーズ（エ
レクトロヌクレオニクス　インコーホレーテッド製“ア
ミノアリルＣＰＧ８０−１２０”）を用いて測定を行っ
た。但し、酵素を含浸させた多孔性ガラスピーズは、こ
れより目の小さいナイロン製又はテフロン製のメツシュ
シートに挾んで酸素電極に固定した。その結果、実施例
１と同様、良好な結果が得られた。しかし、多孔性ガラ
スピーズを用いたときには、ろ紙、炭素繊維フェルト薄
膜を用いたときに比べて酵素化活性寿命は、短かく、数
日しか良好な活性を示さなかった。

実施例４クエン酸すン酸緩衝戚（ｐＨ５，６）２楔中にグルコー
スオキシターセ２ｍｇを溶解し、これを直径１８ｍｍの
円形に切ったガラス繊維ろ紙（アドノくンテック東洋（
株）製“ＧＣ−５０″）に含浸させて固定化酵素膜とし
た。この膜を用いて、人、牛及び馬の血清（１０倍希釈
）中のグルコース濃度を実施例１と同様にして測定した
。

測定値と比色法による値とを比較した結果を第３表に示
す。このように本発明の方法は、基質の定量を迅速且つ
簡便に行うことができる。

第　　　３　　　表

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の定量方法を説明するためのモデルの
一例を示す図である。第２図は、基質添加前後における
電流値の経時変化を示すグラフである。第３図は、尿標
準液の検量線グラフである。（１）バイオセンサー（２）（３）（４）（５）固定化酵素膜固定具固定化酵素膜酸素透過性膜電極本体（以上）第図第図第図尿醇（１０１Ｍ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）酵素を触媒とし、酸素を電子供与体とする反応を
利用して溶液中の基質の定量を行うに際して、酸素透過
性のゲート表面に固定化酵素膜が設けられ、該固定化酵
素膜と緩衝液を介して接続された内部電極を備えたバイ
オセンサーを用いて、該センサーの固定化酵素膜上に試
料溶液の微小量を添加することを特徴とする試料添加式
定量方法。