JPH0418626B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生体物質の皮膚上測定法と題した現在
出願中の特許願継続番号第63159号（1979年８月
２日出願）の部分継続である。この特許願は乳酸
塩を乳酸オキシダーゼと反応させて過酸化水素を
生成させることにより乳酸塩を分析するという概
念を発表している。この過酸化水素は次に皮膚電
極を用いてポーラログラフイーにより測定され
る。本発明は哺乳動物全血中の乳酸または乳酸塩
を迅速に測定する問題に関する。 医科学は血液、骨格筋および心臓における乳酸
濃度を迅速に測定することの重要性を現在実現し
つつある。血液中の乳酸濃度は哺乳動物における
ある重大な特徴のしるしであるように思われる。
高い血中乳酸濃度はしばしば哺乳動物がまさにシ
ヨツクを起こそうとしていることのしるしとな
る。事故の犠牲者にとつては乳酸濃度を迅速に定
量することがきわめて重大でありうる。このよう
な測定は乳酸濃度を繰り返し測定ができるように
迅速でなければならず、また少量の血液を使用す
べきである。幼児においては、乳酸濃度が炭水化
物代謝の欠陥の重大な徴候となる。幼児の場合、
幼児の血液量は成人のそれよりも相当に少ないの
で試料サイズがきわめて重要となる。 ある権威者は血中の乳酸対ピルビン酸の比が重
要であることを理論づけしている。従つて、どの
乳酸測定法もこの比を決定するためにピルビン酸
も測定できるものでなければならない。 現在、乳酸を測定する種々な方法がある。乳酸
を全血中で測定する場合、副反応を起こしうる望
ましくない物質を除去するために、一般に血漿を
血液から分離しなければならない。例えば、乳酸
は乳酸デヒドロゲナーゼを用いる還元により間接
的に測定されており、これは酸素を消費するので
それにより酸素減少を測定して乳酸濃度を示すも
のである。これは乳酸の間接的な測定であり、き
わめて経費と時間がかかる傾向がある。これらの
反応において、血液は半透膜を用いることにより
乳酸デヒドロゲナーゼから隔てられている。他の
方法は全血球を血漿から分離するために過また
は遠心を用いることにより血漿を全血球から隔て
る比色法を用いる。次に血漿を乳酸オキシダーゼ
と反応させて過酸化水素を生成させ、これを比色
法で測定できる。これらの方法は時間がかかり、
高価であり、そして乳酸を直接的に迅速に検出す
る手段を与えない。 更にまた、これらの方法は乳酸対ピルビン酸の
比を測定する手段を与えずまた更に乳酸濃度をそ
の場で測定する手段をこれらが与えないという点
で失敗である。このことは心臓中の乳酸濃度を測
定する上で特に重要な筈である。 およそ15年前、酵素結合電極が物質のポーラロ
グラフイー分析に対して報告された。例えば本発
明者の米国特許第3539455号明細書は、これまで
ポーラログラフ法によつて直接分析する際に困難
をもたらした物質の迅速かつ正確な定量分析を行
なうための膜ポーラログラフ電極方式法を記載し
ている。本発明者の述べた特許における記述によ
ると、グルコースのような小分子物質は膜ポーラ
ログラフ電極方式で測定される。セルロース膜ま
たは他のグルコースといつた小分子に対しては透
過性があるがタンパク質は透過できない膜の使用
により、その膜はグルコースオキシダーゼ酵素を
グルコースとの反応のための陽極をもつ膜側に保
つ。それ故に、例えば血液試料を電極と反対の膜
側に置き酵素水溶液および酸素を膜の電極側にお
くと、グルコースのような低分子量の分子は血液
試料から膜を通過して電極に隣接して酵素反応に
供される。ある時間後定常状態に達し、その時過
酸化水素濃度はグルコース濃度に直接比例し、セ
ルは生成しつつある過酸化水素の量の関数として
電流を生じ、これが存在するグルコースの量の指
標として役立つ。 ある時期には乳酸オキシダーゼが科学の世界を
当感させて来た。ある時期には、乳酸オキシダー
ゼが事実乳酸から過酸化水素を生成させうるかど
うかが論争の問題があつた。この論争の一つの可
能な理由はこの酵素がしばしば過酸化水素を急速
に消費する筈のカタラーゼの実質量と共同してい
ることである。この議論の二番目のみなもとは乳
酸オキシダーゼの不適切な特性づけであつた。実
際には乳酸オキシダーゼであつたある種の酵素が
乳酸オキシダーゼとして特性づけられた。これら
の乳酸オキソレダクターゼは乳酸から過酸化水素
とピルビン酸塩をつくり出す代わりに、酢酸、二
酸化炭素、および水を生成する。しかし、本当の
乳酸オキシダーゼがありそしてこのものは実質的
にカタラーゼを含まず、乳酸または乳酸塩から過
酸化水素をつくる反応に適していることが最近文
献で認められた。このような酵素はイーストマ
ン・コダツク社（Eastman Kodak Company）
に帰属する米国特許第4166763号明細書に記載さ
れている。この特許は乳酸を酸化してピルビン酸
塩と過酸化水素とをつくり出す乳酸分析に使用す
るための酵素を記載している。過酸化水素は比色
法で測定される。 本発明は乳酸オキシダーゼを用いて乳酸塩また
は乳酸を酸化してピルビン酸塩および過酸化水素
を生成することができ、そしてそれにより過酸化
水素をポーラログラフで測定できるという認識を
前提とする。特に、乳酸は膜を通つて移動して乳
酸オキシダーゼと接触しそこで過酸化水素に変換
されることが判つた。次に、生じた過酸化水素は
第二の膜を通つて移動して電極に行く。過酸化水
素の分解はセルを横切つて電流を生じ、これは過
酸化水素の生成速度の尺度として測定でき、分析
下におかれた材料中に存在する乳酸または乳酸塩
の量の指標となる。 本発明によりいくつかの利点が提供される。乳
酸が大量のカタラーゼを含むかもしれない全血中
に含まれている場合でさえ乳酸を直接測定でき
る。この状況において、試料を分析に先立ち望ま
ない夾雑物を除去するために調製しなければなら
ないということはない。従つて、乳酸濃度の測定
は約40秒で行なうことができる。 その広い面の一つにおいて、本発明は少なくと
も一つの酵素により変換されて過酸化水素を生ず
る乳酸の定量的ポーラログラフ測定法に向けられ
ている。過酸化水素に対して敏感な少なくとも一
つの電極を含むポーラログラフセルが提供され
る。過酸化水素に対し透過性の第一の膜の背後に
感知電極が位置している。乳酸オキシダーゼおよ
び潜在的に追加の酵素がこの第一の膜と酵素を試
料から隔てる第二の膜との間に含まれる。試料中
の乳酸は第二の膜を通つて移動して乳酸オキシダ
ーゼと反応し過酸化水素およびピルビン酸塩を生
ずる。次に過酸化水素は第一の膜を通過してセル
の電極に行く。セルを横切つて電位差が確立さ
れ、生じた電流は生じた過酸化水素の量に比例す
る。 このような膜ポーラログラフセルにおいては、
測定すべき乳酸を含む一定量の物質を加えて電極
と反対の膜の側での酵素反応に供しそして過酸化
水素の少なくとも一部を膜の中へまた電極との接
触へ拡散させる。次に、セルを横切る電流を生じ
た過酸化水素の量の関数としてまた物質中の乳酸
の量の指標として測定する。電流は乳酸との酵素
反応による過酸化水素の生成速度として測定され
る。本発明の変法においては、ピルビン酸オキシ
ダーゼを乳酸オキシダーゼと混合して生じたピル
ビン酸塩と反応させる。ピルビン酸塩はピルビン
酸オキシダーゼの存在で酢酸と過酸化水素を生成
する。このようにすると同量の乳酸からより多く
の過酸化水素が生成される。これは乳酸の検出感
度を実質的に増加させる。 この型のポーラログラフセルは乳酸対ピルビン
酸の比を測定できるように修正できる。更にま
た、これらセルをカテーテルに加えることにより
生体内乳酸濃度を測定することもできる。これら
セルはまた乳酸を外膜上に生ずる種々な動物、植
物または細菌の細胞の固定によつても修正でき
る。これはこれら細胞による乳酸生成を観察する
方法を提供する。乳酸のこのような測定法の、こ
れまで価値が認められなかつたこの多様性は本発
明のきわめて重要な利点である。 下記の詳細な記述および図面を引用すれば本発
明が更に理解されその利点が認められるであろ
う。 第１図は本発明方法で用いたポーラログラフ装
置および他の手段の図解であつて電気回路、ポー
ラログラフセル、および試料室の全体的配列を示
す。 第２図は第１図のポーラログラフセルの下方中
心部分の拡大図であつて、ポーラログラフセルの
積層膜を一層詳しく示している。 第３図は本発明方法によりつくられた典型的な
検量線である。 第４図は全血試料に対する電流対時間のプロツ
トである。 本明細書全体を通じ、乳酸および乳酸塩という
用語は互換性をもつて用いている。本発明方法は
乳酸塩、乳酸ならびに乳酸オキシダーゼと反応し
て過酸化水素を生じる乳酸誘導体を測定する手段
を提供するものである。これら誘導体には乳酸フ
エニルおよび乳酸エチルが含まれる。本発明方法
は下記の反応を前提とする： O2＋乳酸乳酸オキシターゼ ―――――――――→ ピルビン酸塩 ＋H2O2 次に過酸化水素は第１図および第２図に示した
型の、更に詳しくは本発明者の米国特許第
3539455号明細書（参考のためここにとり入れた）
に記載の型の膜ポーラログラフセルを用いること
により測定される。 第１図のポーラログラフ装置において、電極プ
ローブ５は白金陽極６のところで一定部分の過酸
化水素を酸化するが、これは次の反応により最も
ありうるように説明される： H2O2＋2H+→O2＋2e- 回路は銀陰極７により完結し、ここで酸素が還
元されて水となるが、これは次の反応により最も
ありうるように説明される： 4H+＋O2→2H2Ｏ−4e- 上記反応を図面の第１図の操作原理に関連させ
ると、第１図は電極プローブ５および試料室８を
有するポーラログラフセル９を示す装置の図解で
ある。 下記の詳細な操作においては、修正されたモデ
ル２３、イエロー・スプリングズ・インストルメ
ント・カンパニー・グルコース・アナライザー
（Model 23，Yellow Springs Instrument
Company Glucose Analyzer）を用い、ここで
次のように述べる。セルはそれ自身の電源を具
え、この場合はかけられた約0.7ボルトの電圧を
用いる電池１０である。電池の陽極は約0.5平方
cmの活性表面積を有する隣接した塩化銀被覆銀線
照合陰極７と共に直径0.5mmの面１１を有する白
金ポーラログラフ陽極６に付く。フルスケール出
力は100ナノアンペアー程度の大きさである。Ｇ
−2500バリアン・ストリツプ・チヤート・レコー
ダー（図示せず）を用いて電流を測定する。第１
図を引用すると、なるべくは円筒状で電気絶縁キ
ヤツプ１４によりカバーされたプラスチツクまた
はガラスの電気絶縁支持体１２を含むセル組立て
が示されている。円筒体１２の内部にプラスチツ
クまたはガラスの電気絶縁要素ロツド１５が位置
し、このものは活性露出面１１を含む白金電極を
支えている。電極６が電導体１８によつて電池電
源１０に付けられ、該電導体はロツド１５とキヤ
ツプ１４を通り抜ける。 支持体１２の下方端部には輪状の環またはリテ
ーイナー１９および積層膜２０が備えられてい
る。この積層膜は電極６に最も近い支持体の端上
に支えられ、活性面１１から毛細管距離だけ間隔
をおいている。膜はＯ−環２１により支持体上の
定位置に保持される。 ロツド１５と支持体１２との間に環状の空間が
設けられ、照合電極７を受けているが、このもの
は、例えば塩化銀被覆銀線でよい。ロツド１５と
支持体１２との間の空間２５は少なくとも部分的
にそしてなるべくは完全に電解質の液体混合物で
満されていて、このものは電極７および６の両方
を含み、キヤツプ１４の下に設けられたすき間３
１を通つて室中に導入される。典型的電解室は炭
酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、またはアル
カリ金属または希土類金属を含む塩化ナトリウム
またはカリウム緩衝剤あるいは他の有機緩衝剤ま
たはその混合物を含む。このような電解質に対す
る溶媒は水、グリコール、グリセリンおよびその
混合物である。本発明においては、Na2HPO4お
よびNaH2PO4の水性混合物を用いるのがよい。 第２図は膜２０を一層詳しく示しており、主と
してこの膜の記述において引用することにする。
示されているように、層３２は陽極６の活性表面
１１に隣接したものである。該層は本質的に均一
なシリコーン、メタクリル酸メチルまたは酢酸セ
ルロース材料である。層３４は分析すべき試料と
接触するようになる外層である。特に適当な具体
例において、これは0.03ミクロン細孔寸法の有効
ポリカーボネートフイルムで、厚さ５ミクロン、
窒素流速10ポンド／平方インチで25ml／分／cm2、
６×188孔／平方センチメートルを有する。この
ようなフイルムはザ・ヌクレポアー・フイルトレ
ーシヨン・プロダクツ・オブ・プリーサントン
（the Nucleopore Filtration Products of
Pleasanton）、カリフオルニアから入手できる。
厚さ約５〜７ミクロンの支持フイルムを用いる場
合、積層膜の全体の厚さは10ミクロン未満がよ
い。典型的な厚さは合計７ミクロンの厚さにつ
き、外層３４に対し５ミクロン、外層３２に対し
１ミクロン、中間酵素層３６に対し１ミクロンで
あろう。層３６は乳酸および（または）ピルビン
酸塩と反応させるように用いた酵素物質であり、
層３２と３４を互に結合する作用する。 積層膜２０はなるべくは本質的に均一な層を剥
取可能担体シート上に先ず置くことによりつくる
のがよい。酢酸セルロースの場合、これは溶媒、
例えばシクロヘキサノン中の酢酸セルロースを水
上に沈着させることによりなされる。フイルムが
生じ、このものはポリエチレンのような剥取可能
担体シートにより拾い上げることができる。同様
な方法がシリコーンおよび他の本質的に均一な材
料、例えばメチルメタクリレートに対して用いる
ことができる。記述したように、本質的に均一な
層の特に適当な厚さは0.5から1.0ミクロンの範囲
内にある。 乳酸オキシダーゼ調製物は単に乳酸オキシダー
ゼの水中混合物でよい。勿論、他の物質、例えば
グルタルアルデヒドといつた橋かけ剤または結合
剤を酵素調製物に含めることができる。同様に、
調製物中の水に対する乳酸オキシダーゼの部分
は、均一な薄層に容易に被覆または圧縮できる流
動可能ペーストあるいは溶液が生成する限り、か
つ測定の適当な反応量によつて十分な酵素が添加
される限り特に重要ではない。約17〜20Uの酵素
が約200mg／mlまでの乳酸を有する10から25μ
の試料を試験するのに十分な酵素活性を与える。
酵素溶液を更に後述する。 水性酵素溶液またはペーストを本質的に均一な
層の上に置いた後、拡散障壁材料の自己支持シー
ト３４、なるべくは多孔性ポリカーボネートを酢
酸セルロース層上の酵素調製物と接触させて積層
物をつくる。次にこの積層物を室温の空気中に30
分以上置くことにより乾かす。これに加えて、輸
送および貯蔵のために積層品の条件を整えるため
に、これを45℃で約30分間焼成できる。担体シー
トを取り除くと、積層膜はポーラログラフセル上
に装置できる用意がととのう。 しかし、もし特に適当であるならば、積層手順
の後に、ポーラログラフセル１０上でリテイナー
１９の中に適合させるため適当な寸法のゴム状Ｏ
−環２１を支持体層３４上につつける（図１を見
よ）。すぐ使用できるように準備のととのつた積
層膜２０をＯ−環の周りに押抜きする。勿論、こ
の場合にもまた支持体層を本質的に均一な層の面
から剥ぎ取る。 最も重要なことに、積層膜は厚さが10ミクロン
未満かもしれないので、ポーラログラフ分析に対
して30秒未満、そしてある場合には10秒といつた
短時間で済む。この短い時間の間に、乳酸と酸素
が層３４を通つて拡散し、層３６で乳酸オキシダ
ーゼと反応する。次に生じた過酸化水素は層３２
を通つて拡散し陽極６の活性面１１と接触する。
電流が定常状態に達し、そして過酸化水素の量の
測定を行なう。この迅速な測定時間は多数の分析
を各日にやらなければならないために実験室や病
院できわめて重要である。上記膜構造は米国特許
第3979274号および第4073713号明細書（これは両
方とも参考のためここに取り入れてある）にもつ
と詳しく記述されている。 試料室８の側面に、試料室８の中に含まれた酵
素電解質混合物中にかきまぜたポンプから空気ま
たは酸素の通過を許すケイ素ゴムといつた酸素透
過性薄膜が位置し、気体は換気口を通つて除かれ
る。試料注入用の注射器を緩衝剤供給源、注入
口、隔壁コードおよび廃液除去部と共に示してあ
り、これにより試料分析の流れを説明している。 本発明にとつて重要なことは乳酸または乳酸塩
から過酸化水素とピルビン酸塩を生ずる反応を触
媒しうる適当な乳酸オキシダーゼの使用である。
乳酸オキシダーゼは実質的にカタラーゼは不含で
なければならない。カタラーゼは過酸化水素と急
速に結合しかつ分解する酵素である。それ故に、
もし実質量のカタラーゼが存在すると、過酸化水
素は電極の活性面に達する前に消費される。従つ
て、電極は過酸化水素を検知しないであろう。そ
れ故に、酵素はカタラーゼを含むべきでない。 更にまた、酵素は乳酸水溶液が酵素中を通るこ
とを可能にするため水溶性でなければならない。
乳酸オキシダーゼのいくつかの供給源がある。エ
ツチ・ジエー・アイケル（H.J.Eichel）およびエ
ル・テイー・レーム（L.T.Roehm），Journal of
Biochemistry，237，940〜945（1962），は乳酸塩
をピルビン酸塩と過酸化水素とに酸化する乳酸オ
キシダーゼを生ずる細菌テトラハイメン・ピレホ
ルミス（Tetrahymen Pyreformis）を発表して
いる。エフ・ビークーシンズ（F.B.Cousins），
Journal of Biochemistry，64，297〜307（1956）
は乳酸からピルビン酸塩と過酸化水素を生成する
マイコ・スメグマチス（Myco smegmatis）細
菌から誘導された乳酸オキシダーゼを報告してい
る。最後に、米国特許第4166763号明細書はスト
レプトコツカス・フアエカリス（Streptococcus
faecalis）（atcc12755）から得られた乳酸オキ
シダーゼを記載しており、このものは乳酸または
乳酸塩を酸化してピルビン酸塩と過酸化水素を生
成する。酵素の商業的給源はフアームコ・バイオ
ケミカルズ社（Fermco Biochemicals Inc.）で、
該社はペジオカス種（Pedioccus Sp.）により
つけられたと思われる乳酸オキシダーゼを販売し
ている。これは特によい酵素である。その触媒活
性は補酵素と考えられるフラビン アデニン ジ
ヌクレチド（FAD）の添加により増加する。膜
積層品２０の説明で上に述べたように、選ばれた
乳酸オキシダーゼはポーラログラフセルの膜構造
中にとり入れられる。 操作においては、第１図の膜ポーラログラフ装
置を、乳酸オキシダーゼにより変換されて過酸化
水素を生成しうる乳酸または乳酸誘導体の定量測
定に用いる。水性電解液および緩衝溶液を試料室
８に導入する。乳酸オキシダーゼは膜積層物２０
中に含まれる。分析下におかれた試料は隔壁コー
ドを経て注射器により室８の中に導入される。酸
素は透過性のシリコーンゴム膜を通つて通気され
た試料室中にかきまぜポンプにより与えられる。
試料中の乳酸が外膜層３４と接触するにつれ乳酸
は膜層を経て酵素層３６中に拡散する。人皿のよ
うなある種の試料中に含まれるかもしれないカタ
ラーゼは層３４の細孔の小寸法のため膜層３４の
通過が妨げられる。酵素層中を通る乳酸または乳
酸塩誘導体は酸化されて過酸化水素を生じ、この
ものは内膜層３２を通つて移動する。この過酸化
水素は陽極１１の活性面と内膜層３２との間の毛
細管空間３８を横切つて通り電流を生じさせる。
セルを横切るこの電流は層３２中を拡散する過酸
化水素の量と直接比例する。セルを横切つて流れ
る電流の検流計１６による測定は生じた過酸化水
素の量の関数であり、試料中の乳酸または乳酸塩
の量の指標となる。この測定は動力学的測定であ
る。最初は電流は低いが、第４図に示したよう
に、電流は急速に増加し約10から０秒後に水準を
超える。この点で過酸化水素の生成は定常状態に
達し、これは生じた過酸化水素の量に比例する。
この電流と第３図に示したように既知量の乳酸塩
を用いてつくつた校正曲線との比較は試料中の乳
酸濃度を与える。 最適操作条件は試料および酵素源により変化す
る。しかし、フアームコ乳酸オキシダーゼを用い
るときは、約37℃の温度を６と８との間のPHと共
に使用すべきであることが見出された。 第３図および第４図に示した結果はフアームコ
乳酸オキシダーゼをFAD添加なしで用いること
により得たものである。緩衝剤はPH7.28を有する
Na2HPO4およびNaH2PO4の水性混合物である。
温度は37℃である。試料量は25μでこれを350μ
キユベツト中に注入した。これらの条件を用い
ると乳酸塩０〜300mg／ｄから直線性は優秀で
ある。前述した通り、酵素の寿命は緩衝剤へ少量
のFADを添加することにより増加させることが
できる。 膜積層物２０の酵素層へ任意にピルビン酸塩オ
キシダーゼを加えることにより、乳酸から生じた
ピルバン酸塩を酸化して過酸化水素と酢酸を生じ
させることができる。これは次式により実証され
る： O2＋ピルビン酸塩ピルビン酸塩オキシターゼ ―――――――――――――――→ 酢酸＋H2O2 ピルビン酸塩オキシダーゼの適当な供給源は
Analytica Chemica Acta118（1980）65〜71に記
載のペデイオコツカス種（Padiococus Sp.）
（EC1，２，３，３）により産生される酵素であ
る。本出願においては、なるべく等モル量のピル
ビン酸塩オキシダーゼと乳酸塩オキシダーゼとを
酵素層に用いることが好ましい。積層膜は上記の
通りにしてつくられ、ピルビン酸塩オキシダーゼ
を添加することだけ異なる。従つて、この方法に
よれば、下記の反応が起こる。 乳酸オキシターゼ 乳酸―――――――――→ピルビン酸塩＋H2O2 ↓ピルビン酸塩オキシダーゼ 酢酸＋H2O2 このスキームによれば、理論的には同量の乳酸
から２倍多く過酸化水素が生ずることになる。こ
れは生じた過酸化水素の量を定量的に増加させ
る。それ故に、この方法によれば低量の乳酸また
は乳酸塩を検出できる。この方法はもし試料がピ
ルビン酸塩を含んでいるなら余り正確でないこと
に注意すべきである。 医科学では最近人血中の乳酸とピルビン酸の比
の重要性が考えられるようになつた。これは今に
も起ろうとしているシヨツクの重要な指標である
とある人々により考えられている。前記の乳酸測
定法を用いると、血液中の乳酸対ピルビン酸の比
を決定することもできる。この変法は試料として
ヒト全血を用いる同じ前記の乳酸検出法を用いる
ことによつて達成される。ヒト全血中の乳酸を測
定した後、乳酸デヒドゲナーゼとNADHを電極
のキユベツト中に注入して血液試料中のピルビン
酸と反応させる。ピルビン酸はLDHおよび
NADHと反応して乳酸を生ずる。従つて乳酸濃
度が増加し、電流も増加するであろう。この電流
増加は血液中のピルビン酸から誘導された乳酸に
より起こる。従つて、血液中の乳酸濃度を示す最
初の読みを血液中のピルビン酸により起こる増加
を示す二番目の読みと比較することにより、乳酸
対ピルビン酸の比を決定できる。ピルビン酸から
乳酸を生ずるこの機構はAnalytica Chemica
Acta118（1980），65〜７の中で議論されている。
このようにして、本発明方法によれば、血液中の
乳酸を定量できるだけでなく、また血液中のピル
ビン酸の濃度も測定できる。 本発明方法の更にもう一つの使用は乳酸塩を生
成するある種の細胞の観察と研究に対してであ
る。グリセルアルデヒドを用いることにより電極
端に細胞または他の細胞を固定することは公知で
ある。グリセルアルデヒドと細菌を一緒に混合
し、電極のチツプ上に物理的に被覆する。本発明
方法を用いることにより、電極端にラクタス・バ
チルス・アシドフイルス（Lactus Bacillus
acidophilus）といつた細菌を置くことができる。
この細菌は乳酸産生のため使用され乳製品工業で
重要である。種々な条件下で生じた乳酸を測定す
ることにより、その細菌を一層厳密に、かつ細菌
に及ぼす種々な環境の影響を研究できる。乳酸を
つくり出すことが知られている他の細胞は肝臓細
胞と白血球細胞である。これらもまた本法により
研究することができる。 この使用に加えて、本発明方法はまた生体内の
乳酸濃度を測定するのに使用できる。機能不全の
心臓は時には乳酸を生ずることが知られている。
従つて、プローブ５と同様の電極をカテーテルの
チツプに付けることにより、心臓における乳酸濃
度を直接測定できる。 このようにして、上記方法によれば、哺乳動物
全血中に、あるいは多数の他の型の試料中に含ま
れる乳酸の量をポーラログラフで直接測定でき
る。本発明方法は乳酸オキシダーゼとピルビン酸
オキシダーゼを併合することにより測定感度を増
加させることができる。本発明方法はまた例えば
哺乳動物血液中の乳酸対ピルビン酸の比を検知す
る迅速安価な方法を提供するものである。この方
法はまた乳酸をつくり出す細胞を研究する手段な
らびに生体内乳酸濃度を測定する手段も提供す
る。このように、本発明はきわめて応用範囲が広
く、従来の方法よりはるかに融通性に富み、かつ
安価、迅速である。
出願中の特許願継続番号第63159号（1979年８月
２日出願）の部分継続である。この特許願は乳酸
塩を乳酸オキシダーゼと反応させて過酸化水素を
生成させることにより乳酸塩を分析するという概
念を発表している。この過酸化水素は次に皮膚電
極を用いてポーラログラフイーにより測定され
る。本発明は哺乳動物全血中の乳酸または乳酸塩
を迅速に測定する問題に関する。 医科学は血液、骨格筋および心臓における乳酸
濃度を迅速に測定することの重要性を現在実現し
つつある。血液中の乳酸濃度は哺乳動物における
ある重大な特徴のしるしであるように思われる。
高い血中乳酸濃度はしばしば哺乳動物がまさにシ
ヨツクを起こそうとしていることのしるしとな
る。事故の犠牲者にとつては乳酸濃度を迅速に定
量することがきわめて重大でありうる。このよう
な測定は乳酸濃度を繰り返し測定ができるように
迅速でなければならず、また少量の血液を使用す
べきである。幼児においては、乳酸濃度が炭水化
物代謝の欠陥の重大な徴候となる。幼児の場合、
幼児の血液量は成人のそれよりも相当に少ないの
で試料サイズがきわめて重要となる。 ある権威者は血中の乳酸対ピルビン酸の比が重
要であることを理論づけしている。従つて、どの
乳酸測定法もこの比を決定するためにピルビン酸
も測定できるものでなければならない。 現在、乳酸を測定する種々な方法がある。乳酸
を全血中で測定する場合、副反応を起こしうる望
ましくない物質を除去するために、一般に血漿を
血液から分離しなければならない。例えば、乳酸
は乳酸デヒドロゲナーゼを用いる還元により間接
的に測定されており、これは酸素を消費するので
それにより酸素減少を測定して乳酸濃度を示すも
のである。これは乳酸の間接的な測定であり、き
わめて経費と時間がかかる傾向がある。これらの
反応において、血液は半透膜を用いることにより
乳酸デヒドロゲナーゼから隔てられている。他の
方法は全血球を血漿から分離するために過また
は遠心を用いることにより血漿を全血球から隔て
る比色法を用いる。次に血漿を乳酸オキシダーゼ
と反応させて過酸化水素を生成させ、これを比色
法で測定できる。これらの方法は時間がかかり、
高価であり、そして乳酸を直接的に迅速に検出す
る手段を与えない。 更にまた、これらの方法は乳酸対ピルビン酸の
比を測定する手段を与えずまた更に乳酸濃度をそ
の場で測定する手段をこれらが与えないという点
で失敗である。このことは心臓中の乳酸濃度を測
定する上で特に重要な筈である。 およそ15年前、酵素結合電極が物質のポーラロ
グラフイー分析に対して報告された。例えば本発
明者の米国特許第3539455号明細書は、これまで
ポーラログラフ法によつて直接分析する際に困難
をもたらした物質の迅速かつ正確な定量分析を行
なうための膜ポーラログラフ電極方式法を記載し
ている。本発明者の述べた特許における記述によ
ると、グルコースのような小分子物質は膜ポーラ
ログラフ電極方式で測定される。セルロース膜ま
たは他のグルコースといつた小分子に対しては透
過性があるがタンパク質は透過できない膜の使用
により、その膜はグルコースオキシダーゼ酵素を
グルコースとの反応のための陽極をもつ膜側に保
つ。それ故に、例えば血液試料を電極と反対の膜
側に置き酵素水溶液および酸素を膜の電極側にお
くと、グルコースのような低分子量の分子は血液
試料から膜を通過して電極に隣接して酵素反応に
供される。ある時間後定常状態に達し、その時過
酸化水素濃度はグルコース濃度に直接比例し、セ
ルは生成しつつある過酸化水素の量の関数として
電流を生じ、これが存在するグルコースの量の指
標として役立つ。 ある時期には乳酸オキシダーゼが科学の世界を
当感させて来た。ある時期には、乳酸オキシダー
ゼが事実乳酸から過酸化水素を生成させうるかど
うかが論争の問題があつた。この論争の一つの可
能な理由はこの酵素がしばしば過酸化水素を急速
に消費する筈のカタラーゼの実質量と共同してい
ることである。この議論の二番目のみなもとは乳
酸オキシダーゼの不適切な特性づけであつた。実
際には乳酸オキシダーゼであつたある種の酵素が
乳酸オキシダーゼとして特性づけられた。これら
の乳酸オキソレダクターゼは乳酸から過酸化水素
とピルビン酸塩をつくり出す代わりに、酢酸、二
酸化炭素、および水を生成する。しかし、本当の
乳酸オキシダーゼがありそしてこのものは実質的
にカタラーゼを含まず、乳酸または乳酸塩から過
酸化水素をつくる反応に適していることが最近文
献で認められた。このような酵素はイーストマ
ン・コダツク社（Eastman Kodak Company）
に帰属する米国特許第4166763号明細書に記載さ
れている。この特許は乳酸を酸化してピルビン酸
塩と過酸化水素とをつくり出す乳酸分析に使用す
るための酵素を記載している。過酸化水素は比色
法で測定される。 本発明は乳酸オキシダーゼを用いて乳酸塩また
は乳酸を酸化してピルビン酸塩および過酸化水素
を生成することができ、そしてそれにより過酸化
水素をポーラログラフで測定できるという認識を
前提とする。特に、乳酸は膜を通つて移動して乳
酸オキシダーゼと接触しそこで過酸化水素に変換
されることが判つた。次に、生じた過酸化水素は
第二の膜を通つて移動して電極に行く。過酸化水
素の分解はセルを横切つて電流を生じ、これは過
酸化水素の生成速度の尺度として測定でき、分析
下におかれた材料中に存在する乳酸または乳酸塩
の量の指標となる。 本発明によりいくつかの利点が提供される。乳
酸が大量のカタラーゼを含むかもしれない全血中
に含まれている場合でさえ乳酸を直接測定でき
る。この状況において、試料を分析に先立ち望ま
ない夾雑物を除去するために調製しなければなら
ないということはない。従つて、乳酸濃度の測定
は約40秒で行なうことができる。 その広い面の一つにおいて、本発明は少なくと
も一つの酵素により変換されて過酸化水素を生ず
る乳酸の定量的ポーラログラフ測定法に向けられ
ている。過酸化水素に対して敏感な少なくとも一
つの電極を含むポーラログラフセルが提供され
る。過酸化水素に対し透過性の第一の膜の背後に
感知電極が位置している。乳酸オキシダーゼおよ
び潜在的に追加の酵素がこの第一の膜と酵素を試
料から隔てる第二の膜との間に含まれる。試料中
の乳酸は第二の膜を通つて移動して乳酸オキシダ
ーゼと反応し過酸化水素およびピルビン酸塩を生
ずる。次に過酸化水素は第一の膜を通過してセル
の電極に行く。セルを横切つて電位差が確立さ
れ、生じた電流は生じた過酸化水素の量に比例す
る。 このような膜ポーラログラフセルにおいては、
測定すべき乳酸を含む一定量の物質を加えて電極
と反対の膜の側での酵素反応に供しそして過酸化
水素の少なくとも一部を膜の中へまた電極との接
触へ拡散させる。次に、セルを横切る電流を生じ
た過酸化水素の量の関数としてまた物質中の乳酸
の量の指標として測定する。電流は乳酸との酵素
反応による過酸化水素の生成速度として測定され
る。本発明の変法においては、ピルビン酸オキシ
ダーゼを乳酸オキシダーゼと混合して生じたピル
ビン酸塩と反応させる。ピルビン酸塩はピルビン
酸オキシダーゼの存在で酢酸と過酸化水素を生成
する。このようにすると同量の乳酸からより多く
の過酸化水素が生成される。これは乳酸の検出感
度を実質的に増加させる。 この型のポーラログラフセルは乳酸対ピルビン
酸の比を測定できるように修正できる。更にま
た、これらセルをカテーテルに加えることにより
生体内乳酸濃度を測定することもできる。これら
セルはまた乳酸を外膜上に生ずる種々な動物、植
物または細菌の細胞の固定によつても修正でき
る。これはこれら細胞による乳酸生成を観察する
方法を提供する。乳酸のこのような測定法の、こ
れまで価値が認められなかつたこの多様性は本発
明のきわめて重要な利点である。 下記の詳細な記述および図面を引用すれば本発
明が更に理解されその利点が認められるであろ
う。 第１図は本発明方法で用いたポーラログラフ装
置および他の手段の図解であつて電気回路、ポー
ラログラフセル、および試料室の全体的配列を示
す。 第２図は第１図のポーラログラフセルの下方中
心部分の拡大図であつて、ポーラログラフセルの
積層膜を一層詳しく示している。 第３図は本発明方法によりつくられた典型的な
検量線である。 第４図は全血試料に対する電流対時間のプロツ
トである。 本明細書全体を通じ、乳酸および乳酸塩という
用語は互換性をもつて用いている。本発明方法は
乳酸塩、乳酸ならびに乳酸オキシダーゼと反応し
て過酸化水素を生じる乳酸誘導体を測定する手段
を提供するものである。これら誘導体には乳酸フ
エニルおよび乳酸エチルが含まれる。本発明方法
は下記の反応を前提とする： O2＋乳酸乳酸オキシターゼ ―――――――――→ ピルビン酸塩 ＋H2O2 次に過酸化水素は第１図および第２図に示した
型の、更に詳しくは本発明者の米国特許第
3539455号明細書（参考のためここにとり入れた）
に記載の型の膜ポーラログラフセルを用いること
により測定される。 第１図のポーラログラフ装置において、電極プ
ローブ５は白金陽極６のところで一定部分の過酸
化水素を酸化するが、これは次の反応により最も
ありうるように説明される： H2O2＋2H+→O2＋2e- 回路は銀陰極７により完結し、ここで酸素が還
元されて水となるが、これは次の反応により最も
ありうるように説明される： 4H+＋O2→2H2Ｏ−4e- 上記反応を図面の第１図の操作原理に関連させ
ると、第１図は電極プローブ５および試料室８を
有するポーラログラフセル９を示す装置の図解で
ある。 下記の詳細な操作においては、修正されたモデ
ル２３、イエロー・スプリングズ・インストルメ
ント・カンパニー・グルコース・アナライザー
（Model 23，Yellow Springs Instrument
Company Glucose Analyzer）を用い、ここで
次のように述べる。セルはそれ自身の電源を具
え、この場合はかけられた約0.7ボルトの電圧を
用いる電池１０である。電池の陽極は約0.5平方
cmの活性表面積を有する隣接した塩化銀被覆銀線
照合陰極７と共に直径0.5mmの面１１を有する白
金ポーラログラフ陽極６に付く。フルスケール出
力は100ナノアンペアー程度の大きさである。Ｇ
−2500バリアン・ストリツプ・チヤート・レコー
ダー（図示せず）を用いて電流を測定する。第１
図を引用すると、なるべくは円筒状で電気絶縁キ
ヤツプ１４によりカバーされたプラスチツクまた
はガラスの電気絶縁支持体１２を含むセル組立て
が示されている。円筒体１２の内部にプラスチツ
クまたはガラスの電気絶縁要素ロツド１５が位置
し、このものは活性露出面１１を含む白金電極を
支えている。電極６が電導体１８によつて電池電
源１０に付けられ、該電導体はロツド１５とキヤ
ツプ１４を通り抜ける。 支持体１２の下方端部には輪状の環またはリテ
ーイナー１９および積層膜２０が備えられてい
る。この積層膜は電極６に最も近い支持体の端上
に支えられ、活性面１１から毛細管距離だけ間隔
をおいている。膜はＯ−環２１により支持体上の
定位置に保持される。 ロツド１５と支持体１２との間に環状の空間が
設けられ、照合電極７を受けているが、このもの
は、例えば塩化銀被覆銀線でよい。ロツド１５と
支持体１２との間の空間２５は少なくとも部分的
にそしてなるべくは完全に電解質の液体混合物で
満されていて、このものは電極７および６の両方
を含み、キヤツプ１４の下に設けられたすき間３
１を通つて室中に導入される。典型的電解室は炭
酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、またはアル
カリ金属または希土類金属を含む塩化ナトリウム
またはカリウム緩衝剤あるいは他の有機緩衝剤ま
たはその混合物を含む。このような電解質に対す
る溶媒は水、グリコール、グリセリンおよびその
混合物である。本発明においては、Na2HPO4お
よびNaH2PO4の水性混合物を用いるのがよい。 第２図は膜２０を一層詳しく示しており、主と
してこの膜の記述において引用することにする。
示されているように、層３２は陽極６の活性表面
１１に隣接したものである。該層は本質的に均一
なシリコーン、メタクリル酸メチルまたは酢酸セ
ルロース材料である。層３４は分析すべき試料と
接触するようになる外層である。特に適当な具体
例において、これは0.03ミクロン細孔寸法の有効
ポリカーボネートフイルムで、厚さ５ミクロン、
窒素流速10ポンド／平方インチで25ml／分／cm2、
６×188孔／平方センチメートルを有する。この
ようなフイルムはザ・ヌクレポアー・フイルトレ
ーシヨン・プロダクツ・オブ・プリーサントン
（the Nucleopore Filtration Products of
Pleasanton）、カリフオルニアから入手できる。
厚さ約５〜７ミクロンの支持フイルムを用いる場
合、積層膜の全体の厚さは10ミクロン未満がよ
い。典型的な厚さは合計７ミクロンの厚さにつ
き、外層３４に対し５ミクロン、外層３２に対し
１ミクロン、中間酵素層３６に対し１ミクロンで
あろう。層３６は乳酸および（または）ピルビン
酸塩と反応させるように用いた酵素物質であり、
層３２と３４を互に結合する作用する。 積層膜２０はなるべくは本質的に均一な層を剥
取可能担体シート上に先ず置くことによりつくる
のがよい。酢酸セルロースの場合、これは溶媒、
例えばシクロヘキサノン中の酢酸セルロースを水
上に沈着させることによりなされる。フイルムが
生じ、このものはポリエチレンのような剥取可能
担体シートにより拾い上げることができる。同様
な方法がシリコーンおよび他の本質的に均一な材
料、例えばメチルメタクリレートに対して用いる
ことができる。記述したように、本質的に均一な
層の特に適当な厚さは0.5から1.0ミクロンの範囲
内にある。 乳酸オキシダーゼ調製物は単に乳酸オキシダー
ゼの水中混合物でよい。勿論、他の物質、例えば
グルタルアルデヒドといつた橋かけ剤または結合
剤を酵素調製物に含めることができる。同様に、
調製物中の水に対する乳酸オキシダーゼの部分
は、均一な薄層に容易に被覆または圧縮できる流
動可能ペーストあるいは溶液が生成する限り、か
つ測定の適当な反応量によつて十分な酵素が添加
される限り特に重要ではない。約17〜20Uの酵素
が約200mg／mlまでの乳酸を有する10から25μ
の試料を試験するのに十分な酵素活性を与える。
酵素溶液を更に後述する。 水性酵素溶液またはペーストを本質的に均一な
層の上に置いた後、拡散障壁材料の自己支持シー
ト３４、なるべくは多孔性ポリカーボネートを酢
酸セルロース層上の酵素調製物と接触させて積層
物をつくる。次にこの積層物を室温の空気中に30
分以上置くことにより乾かす。これに加えて、輸
送および貯蔵のために積層品の条件を整えるため
に、これを45℃で約30分間焼成できる。担体シー
トを取り除くと、積層膜はポーラログラフセル上
に装置できる用意がととのう。 しかし、もし特に適当であるならば、積層手順
の後に、ポーラログラフセル１０上でリテイナー
１９の中に適合させるため適当な寸法のゴム状Ｏ
−環２１を支持体層３４上につつける（図１を見
よ）。すぐ使用できるように準備のととのつた積
層膜２０をＯ−環の周りに押抜きする。勿論、こ
の場合にもまた支持体層を本質的に均一な層の面
から剥ぎ取る。 最も重要なことに、積層膜は厚さが10ミクロン
未満かもしれないので、ポーラログラフ分析に対
して30秒未満、そしてある場合には10秒といつた
短時間で済む。この短い時間の間に、乳酸と酸素
が層３４を通つて拡散し、層３６で乳酸オキシダ
ーゼと反応する。次に生じた過酸化水素は層３２
を通つて拡散し陽極６の活性面１１と接触する。
電流が定常状態に達し、そして過酸化水素の量の
測定を行なう。この迅速な測定時間は多数の分析
を各日にやらなければならないために実験室や病
院できわめて重要である。上記膜構造は米国特許
第3979274号および第4073713号明細書（これは両
方とも参考のためここに取り入れてある）にもつ
と詳しく記述されている。 試料室８の側面に、試料室８の中に含まれた酵
素電解質混合物中にかきまぜたポンプから空気ま
たは酸素の通過を許すケイ素ゴムといつた酸素透
過性薄膜が位置し、気体は換気口を通つて除かれ
る。試料注入用の注射器を緩衝剤供給源、注入
口、隔壁コードおよび廃液除去部と共に示してあ
り、これにより試料分析の流れを説明している。 本発明にとつて重要なことは乳酸または乳酸塩
から過酸化水素とピルビン酸塩を生ずる反応を触
媒しうる適当な乳酸オキシダーゼの使用である。
乳酸オキシダーゼは実質的にカタラーゼは不含で
なければならない。カタラーゼは過酸化水素と急
速に結合しかつ分解する酵素である。それ故に、
もし実質量のカタラーゼが存在すると、過酸化水
素は電極の活性面に達する前に消費される。従つ
て、電極は過酸化水素を検知しないであろう。そ
れ故に、酵素はカタラーゼを含むべきでない。 更にまた、酵素は乳酸水溶液が酵素中を通るこ
とを可能にするため水溶性でなければならない。
乳酸オキシダーゼのいくつかの供給源がある。エ
ツチ・ジエー・アイケル（H.J.Eichel）およびエ
ル・テイー・レーム（L.T.Roehm），Journal of
Biochemistry，237，940〜945（1962），は乳酸塩
をピルビン酸塩と過酸化水素とに酸化する乳酸オ
キシダーゼを生ずる細菌テトラハイメン・ピレホ
ルミス（Tetrahymen Pyreformis）を発表して
いる。エフ・ビークーシンズ（F.B.Cousins），
Journal of Biochemistry，64，297〜307（1956）
は乳酸からピルビン酸塩と過酸化水素を生成する
マイコ・スメグマチス（Myco smegmatis）細
菌から誘導された乳酸オキシダーゼを報告してい
る。最後に、米国特許第4166763号明細書はスト
レプトコツカス・フアエカリス（Streptococcus
faecalis）（atcc12755）から得られた乳酸オキ
シダーゼを記載しており、このものは乳酸または
乳酸塩を酸化してピルビン酸塩と過酸化水素を生
成する。酵素の商業的給源はフアームコ・バイオ
ケミカルズ社（Fermco Biochemicals Inc.）で、
該社はペジオカス種（Pedioccus Sp.）により
つけられたと思われる乳酸オキシダーゼを販売し
ている。これは特によい酵素である。その触媒活
性は補酵素と考えられるフラビン アデニン ジ
ヌクレチド（FAD）の添加により増加する。膜
積層品２０の説明で上に述べたように、選ばれた
乳酸オキシダーゼはポーラログラフセルの膜構造
中にとり入れられる。 操作においては、第１図の膜ポーラログラフ装
置を、乳酸オキシダーゼにより変換されて過酸化
水素を生成しうる乳酸または乳酸誘導体の定量測
定に用いる。水性電解液および緩衝溶液を試料室
８に導入する。乳酸オキシダーゼは膜積層物２０
中に含まれる。分析下におかれた試料は隔壁コー
ドを経て注射器により室８の中に導入される。酸
素は透過性のシリコーンゴム膜を通つて通気され
た試料室中にかきまぜポンプにより与えられる。
試料中の乳酸が外膜層３４と接触するにつれ乳酸
は膜層を経て酵素層３６中に拡散する。人皿のよ
うなある種の試料中に含まれるかもしれないカタ
ラーゼは層３４の細孔の小寸法のため膜層３４の
通過が妨げられる。酵素層中を通る乳酸または乳
酸塩誘導体は酸化されて過酸化水素を生じ、この
ものは内膜層３２を通つて移動する。この過酸化
水素は陽極１１の活性面と内膜層３２との間の毛
細管空間３８を横切つて通り電流を生じさせる。
セルを横切るこの電流は層３２中を拡散する過酸
化水素の量と直接比例する。セルを横切つて流れ
る電流の検流計１６による測定は生じた過酸化水
素の量の関数であり、試料中の乳酸または乳酸塩
の量の指標となる。この測定は動力学的測定であ
る。最初は電流は低いが、第４図に示したよう
に、電流は急速に増加し約10から０秒後に水準を
超える。この点で過酸化水素の生成は定常状態に
達し、これは生じた過酸化水素の量に比例する。
この電流と第３図に示したように既知量の乳酸塩
を用いてつくつた校正曲線との比較は試料中の乳
酸濃度を与える。 最適操作条件は試料および酵素源により変化す
る。しかし、フアームコ乳酸オキシダーゼを用い
るときは、約37℃の温度を６と８との間のPHと共
に使用すべきであることが見出された。 第３図および第４図に示した結果はフアームコ
乳酸オキシダーゼをFAD添加なしで用いること
により得たものである。緩衝剤はPH7.28を有する
Na2HPO4およびNaH2PO4の水性混合物である。
温度は37℃である。試料量は25μでこれを350μ
キユベツト中に注入した。これらの条件を用い
ると乳酸塩０〜300mg／ｄから直線性は優秀で
ある。前述した通り、酵素の寿命は緩衝剤へ少量
のFADを添加することにより増加させることが
できる。 膜積層物２０の酵素層へ任意にピルビン酸塩オ
キシダーゼを加えることにより、乳酸から生じた
ピルバン酸塩を酸化して過酸化水素と酢酸を生じ
させることができる。これは次式により実証され
る： O2＋ピルビン酸塩ピルビン酸塩オキシターゼ ―――――――――――――――→ 酢酸＋H2O2 ピルビン酸塩オキシダーゼの適当な供給源は
Analytica Chemica Acta118（1980）65〜71に記
載のペデイオコツカス種（Padiococus Sp.）
（EC1，２，３，３）により産生される酵素であ
る。本出願においては、なるべく等モル量のピル
ビン酸塩オキシダーゼと乳酸塩オキシダーゼとを
酵素層に用いることが好ましい。積層膜は上記の
通りにしてつくられ、ピルビン酸塩オキシダーゼ
を添加することだけ異なる。従つて、この方法に
よれば、下記の反応が起こる。 乳酸オキシターゼ 乳酸―――――――――→ピルビン酸塩＋H2O2 ↓ピルビン酸塩オキシダーゼ 酢酸＋H2O2 このスキームによれば、理論的には同量の乳酸
から２倍多く過酸化水素が生ずることになる。こ
れは生じた過酸化水素の量を定量的に増加させ
る。それ故に、この方法によれば低量の乳酸また
は乳酸塩を検出できる。この方法はもし試料がピ
ルビン酸塩を含んでいるなら余り正確でないこと
に注意すべきである。 医科学では最近人血中の乳酸とピルビン酸の比
の重要性が考えられるようになつた。これは今に
も起ろうとしているシヨツクの重要な指標である
とある人々により考えられている。前記の乳酸測
定法を用いると、血液中の乳酸対ピルビン酸の比
を決定することもできる。この変法は試料として
ヒト全血を用いる同じ前記の乳酸検出法を用いる
ことによつて達成される。ヒト全血中の乳酸を測
定した後、乳酸デヒドゲナーゼとNADHを電極
のキユベツト中に注入して血液試料中のピルビン
酸と反応させる。ピルビン酸はLDHおよび
NADHと反応して乳酸を生ずる。従つて乳酸濃
度が増加し、電流も増加するであろう。この電流
増加は血液中のピルビン酸から誘導された乳酸に
より起こる。従つて、血液中の乳酸濃度を示す最
初の読みを血液中のピルビン酸により起こる増加
を示す二番目の読みと比較することにより、乳酸
対ピルビン酸の比を決定できる。ピルビン酸から
乳酸を生ずるこの機構はAnalytica Chemica
Acta118（1980），65〜７の中で議論されている。
このようにして、本発明方法によれば、血液中の
乳酸を定量できるだけでなく、また血液中のピル
ビン酸の濃度も測定できる。 本発明方法の更にもう一つの使用は乳酸塩を生
成するある種の細胞の観察と研究に対してであ
る。グリセルアルデヒドを用いることにより電極
端に細胞または他の細胞を固定することは公知で
ある。グリセルアルデヒドと細菌を一緒に混合
し、電極のチツプ上に物理的に被覆する。本発明
方法を用いることにより、電極端にラクタス・バ
チルス・アシドフイルス（Lactus Bacillus
acidophilus）といつた細菌を置くことができる。
この細菌は乳酸産生のため使用され乳製品工業で
重要である。種々な条件下で生じた乳酸を測定す
ることにより、その細菌を一層厳密に、かつ細菌
に及ぼす種々な環境の影響を研究できる。乳酸を
つくり出すことが知られている他の細胞は肝臓細
胞と白血球細胞である。これらもまた本法により
研究することができる。 この使用に加えて、本発明方法はまた生体内の
乳酸濃度を測定するのに使用できる。機能不全の
心臓は時には乳酸を生ずることが知られている。
従つて、プローブ５と同様の電極をカテーテルの
チツプに付けることにより、心臓における乳酸濃
度を直接測定できる。 このようにして、上記方法によれば、哺乳動物
全血中に、あるいは多数の他の型の試料中に含ま
れる乳酸の量をポーラログラフで直接測定でき
る。本発明方法は乳酸オキシダーゼとピルビン酸
オキシダーゼを併合することにより測定感度を増
加させることができる。本発明方法はまた例えば
哺乳動物血液中の乳酸対ピルビン酸の比を検知す
る迅速安価な方法を提供するものである。この方
法はまた乳酸をつくり出す細胞を研究する手段な
らびに生体内乳酸濃度を測定する手段も提供す
る。このように、本発明はきわめて応用範囲が広
く、従来の方法よりはるかに融通性に富み、かつ
安価、迅速である。
第１図は電気回路、ポーラログラフセル、およ
び試料室の全体配列を示すポーラログラフ装置の
図解であり、第２図は第１図のポーラログラフセ
ルの下方中心部の拡大図であり、第３図は本発明
方法により典型的な検量線であり、第４図は全血
試料に対する電流対時間のプロツトである。
び試料室の全体配列を示すポーラログラフ装置の
図解であり、第２図は第１図のポーラログラフセ
ルの下方中心部の拡大図であり、第３図は本発明
方法により典型的な検量線であり、第４図は全血
試料に対する電流対時間のプロツトである。
Claims (1)
- １ 液体中の乳酸またはその誘導体を測定しつい
でその液体中のピルビン酸塩を測定する方法にお
いて、この乳酸またはその誘導体を乳酸オキシダ
ーゼと反応させて、ピルビン酸塩および過酸化水
素を生成させ、そしてこの過酸化水素をポーラロ
グラフイで測定し、またこのピルビン酸塩をピル
ビン酸オキシダーゼと接触させて、酢酸と過酸化
水素を生成させ、ついで生成した過酸化水素をポ
ーラログラフイで測定することを特徴とする、乳
酸またはその誘導体の測定方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US346951 | 1982-02-08 | ||
| US06/346,951 US4467811A (en) | 1979-08-02 | 1982-02-08 | Method of polarographic analysis of lactic acid and lactate |
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