JPH0690177B2 - 酵素電極を用いるアデノシン５´―二リン酸濃度又は酵素活性の測定方法 - Google Patents
酵素電極を用いるアデノシン５´―二リン酸濃度又は酵素活性の測定方法Info
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- JPH0690177B2 JPH0690177B2 JP58226590A JP22659083A JPH0690177B2 JP H0690177 B2 JPH0690177 B2 JP H0690177B2 JP 58226590 A JP58226590 A JP 58226590A JP 22659083 A JP22659083 A JP 22659083A JP H0690177 B2 JPH0690177 B2 JP H0690177B2
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、アデノシン５′−二リン酸（以下ADPと略記
する）濃度又はADPを生成物とする酵素の酵素活性を、
迅速かつ容易に測定する新規な方法な関するものであ
る。
する）濃度又はADPを生成物とする酵素の酵素活性を、
迅速かつ容易に測定する新規な方法な関するものであ
る。
近年、生化学、臨床医学の進歩に伴い、生体中の物質濃
度や酵素活性を迅速、簡便、かつ正確に測定することが
要求されている。
度や酵素活性を迅速、簡便、かつ正確に測定することが
要求されている。
ADPは、高エネルギーリン酸化合物として、代謝系の中
で重要な位置を占める物質である。また、ADPを生成す
る酵素としては、例えば６−ホスホフルクトキナーゼ
（EC2,7,2,11）、ヘキソキナーゼ（EC2,7,1,1）、クレ
アチンキナーゼ（EC2,7,3,2）など代謝系の中で重要な
酵素が挙げられる。特に、血清中におけるクレアチンキ
ナーゼ活性の測定は、代謝系疾患の診断の指標となるこ
とから、臨床医学上でも重要である。
で重要な位置を占める物質である。また、ADPを生成す
る酵素としては、例えば６−ホスホフルクトキナーゼ
（EC2,7,2,11）、ヘキソキナーゼ（EC2,7,1,1）、クレ
アチンキナーゼ（EC2,7,3,2）など代謝系の中で重要な
酵素が挙げられる。特に、血清中におけるクレアチンキ
ナーゼ活性の測定は、代謝系疾患の診断の指標となるこ
とから、臨床医学上でも重要である。
このような、ADP濃度やADPを生成物とする酵素の酵素活
性の測定方法の開発は、生化学及び臨床医学の分野にお
いて強く要望されている。
性の測定方法の開発は、生化学及び臨床医学の分野にお
いて強く要望されている。
従来、ADP濃度やADPを生成物とする酵素の酵素活性の測
定方法としては、ピルベートキナーゼとラクテートデヒ
ドロゲナーゼ（EC1,1,1,27）との組合せ、若しくは、ミ
オキナーゼ（EC2,7,4,3）、ホスホグリセレートキナー
ゼ（EC2,7,2,3）及びグリセロアルデヒドホスフェート
デヒドロゲナーゼ（EC1,2,1,12）の組合せを利用した分
光学的方法が提案され、実用に供されてきた。しかしな
がら、このような方法では、酵素が使い捨てされて繰り
返し使用ができないし、また煩雑な操作を必要とするた
め測定に長時間を要するという欠点があった。
定方法としては、ピルベートキナーゼとラクテートデヒ
ドロゲナーゼ（EC1,1,1,27）との組合せ、若しくは、ミ
オキナーゼ（EC2,7,4,3）、ホスホグリセレートキナー
ゼ（EC2,7,2,3）及びグリセロアルデヒドホスフェート
デヒドロゲナーゼ（EC1,2,1,12）の組合せを利用した分
光学的方法が提案され、実用に供されてきた。しかしな
がら、このような方法では、酵素が使い捨てされて繰り
返し使用ができないし、また煩雑な操作を必要とするた
め測定に長時間を要するという欠点があった。
本発明者らは、従来のADP濃度及びADPを生成物とする酵
素の酵素活性の測定方法の欠点を改良し、迅速、簡便、
正確、かつ繰り返し使用のできる方法を開発すべく種々
検討を重ねた結果、固定化ピルベートオキシダーゼ及び
固定化ピルベートキナーゼの２種類の固定化酵素と、酵
素電極若しくは過酸化水素電極とを組み合わせた酵素電
極を用いるとき、その目的を達成しうることを見出し本
発明を成すに至った。
素の酵素活性の測定方法の欠点を改良し、迅速、簡便、
正確、かつ繰り返し使用のできる方法を開発すべく種々
検討を重ねた結果、固定化ピルベートオキシダーゼ及び
固定化ピルベートキナーゼの２種類の固定化酵素と、酵
素電極若しくは過酸化水素電極とを組み合わせた酵素電
極を用いるとき、その目的を達成しうることを見出し本
発明を成すに至った。
すなわち、本発明は、ホスホエノールピルビン酸及び場
合により酵素活性を測定しようとする酵素の基質を含む
緩衝溶液中に、固定化ピルベートオキシダーゼ及び固定
化ピルベートキナーゼと酸素電極又は過酸化水素電極と
で構成された酵素電極を挿入したのち、緩衝溶液中にア
デノシン５′−二リン酸を含む試料又はアデノシン５′
−二リン酸を生成物として与える酸素を含む試料を添加
し、この際の酸素電極における電流の減少量又は過酸化
水素電極における電流の増加量を検知し、この変化量か
ら該酵素の酵素活性を求めることを特徴とする測定方法
を提供するものである。
合により酵素活性を測定しようとする酵素の基質を含む
緩衝溶液中に、固定化ピルベートオキシダーゼ及び固定
化ピルベートキナーゼと酸素電極又は過酸化水素電極と
で構成された酵素電極を挿入したのち、緩衝溶液中にア
デノシン５′−二リン酸を含む試料又はアデノシン５′
−二リン酸を生成物として与える酸素を含む試料を添加
し、この際の酸素電極における電流の減少量又は過酸化
水素電極における電流の増加量を検知し、この変化量か
ら該酵素の酵素活性を求めることを特徴とする測定方法
を提供するものである。
本発明の方法において用いられるピルベートオキシダー
ゼとしては、ペディオコッカス種（Pediococcus sp.）
由来のものなどが使用でき、例えば東洋醸造（株）より
入手できる。ピルベートキナーゼは、ウサギあるいはイ
ヌの筋肉由来のものなどが使用でき、例えばシグマ社、
ベーリンガー・マンハイム社などより入手できる。固定
化酵素としては、これらの酵素を別個に、あるいは混合
して固定化してなるものを用いることができ、その固定
化方法としては、通常酵素の固定化に採用されている担
体結合法、あるいは包括法のいずれを採用してもよい。
固定化酵素の形状、配置としては、通常の酵素電極にお
いて利用されるものでよい。例えば膜状の固定化酵素を
酵素電極若しくは過酸化水素電極表面への密着固定化、
カラム状の固定化酵素を酸素電極若しくは過酸化水素電
極表面近傍への配置などがある。また、固定化ピルベー
トオキシダーゼを膜状として酸素電極若しくは過酸化水
素電極上に密着固定化し、固定化ピルベートキナーゼを
カラム状として近傍に配置してもよい。本発明の方法に
おいて用いられる上記酸素電極としては、多孔性ポリマ
ー隔膜の酸素透過性を利用したクラーク形のポーラログ
ラフ式若しくは電池式の一般に用いられるものが使用で
きる。また、上記過酸化水素電極としては、白金電極、
あるいは銀電極、若しくはこれらの電極表面上に多孔性
ポリマー膜を被覆した一般に用いられるポーラログラフ
式のものが使用できる。
ゼとしては、ペディオコッカス種（Pediococcus sp.）
由来のものなどが使用でき、例えば東洋醸造（株）より
入手できる。ピルベートキナーゼは、ウサギあるいはイ
ヌの筋肉由来のものなどが使用でき、例えばシグマ社、
ベーリンガー・マンハイム社などより入手できる。固定
化酵素としては、これらの酵素を別個に、あるいは混合
して固定化してなるものを用いることができ、その固定
化方法としては、通常酵素の固定化に採用されている担
体結合法、あるいは包括法のいずれを採用してもよい。
固定化酵素の形状、配置としては、通常の酵素電極にお
いて利用されるものでよい。例えば膜状の固定化酵素を
酵素電極若しくは過酸化水素電極表面への密着固定化、
カラム状の固定化酵素を酸素電極若しくは過酸化水素電
極表面近傍への配置などがある。また、固定化ピルベー
トオキシダーゼを膜状として酸素電極若しくは過酸化水
素電極上に密着固定化し、固定化ピルベートキナーゼを
カラム状として近傍に配置してもよい。本発明の方法に
おいて用いられる上記酸素電極としては、多孔性ポリマ
ー隔膜の酸素透過性を利用したクラーク形のポーラログ
ラフ式若しくは電池式の一般に用いられるものが使用で
きる。また、上記過酸化水素電極としては、白金電極、
あるいは銀電極、若しくはこれらの電極表面上に多孔性
ポリマー膜を被覆した一般に用いられるポーラログラフ
式のものが使用できる。
本発明のADP濃度の測定方法においては、上記のように
して作成された酵素電極は、緩衝溶液中に挿入される。
緩衝溶液としては、そのpHが５〜10の範囲であれば、特
にその濃度、種類に制限はないが、少なくともピルベー
トキナーゼの基質例えばホスホエノールピルビン酸を含
むことが必要である。ホスホエノールピルビン酸濃度に
は特に制限はないが、0.1〜10mmol/lの範囲の濃度であ
ることが好ましい。また、ピルベートオキシダーゼの活
性を高めるためには、少なくとも1mmol/l程度のリン酸
イオン、0.1mmol/l程度のコカルボキシラーゼを含有し
ていることが好ましく、ピルベートキナーゼの活性を高
めるためには、少なくとも1mmol/L程度のマグネシウム
イオンを含有し、かつ、ナトリウムイオン濃度が1mmol/
l程度以下であることが好ましい。従って、例えば1mmol
/lのホスホエノールピルビン酸、10mmol/lのリン酸−カ
リウム、1mmol/lのコカルボキシラーゼ、及び5mmol/lの
塩化マグネシウムを含有する0.2〜1.0mol/lのグリシン
と水酸化カリウムとから成る緩衝溶液が好都合に使用で
きる。さらに、本発明のADPを生成物として与える酵素
の酵素活性の測定方法においては、目的酵素の酵素反応
を開始させるために上記緩衝溶液中に、適当濃度の上記
酵素の基質を添加することが必要である。
して作成された酵素電極は、緩衝溶液中に挿入される。
緩衝溶液としては、そのpHが５〜10の範囲であれば、特
にその濃度、種類に制限はないが、少なくともピルベー
トキナーゼの基質例えばホスホエノールピルビン酸を含
むことが必要である。ホスホエノールピルビン酸濃度に
は特に制限はないが、0.1〜10mmol/lの範囲の濃度であ
ることが好ましい。また、ピルベートオキシダーゼの活
性を高めるためには、少なくとも1mmol/l程度のリン酸
イオン、0.1mmol/l程度のコカルボキシラーゼを含有し
ていることが好ましく、ピルベートキナーゼの活性を高
めるためには、少なくとも1mmol/L程度のマグネシウム
イオンを含有し、かつ、ナトリウムイオン濃度が1mmol/
l程度以下であることが好ましい。従って、例えば1mmol
/lのホスホエノールピルビン酸、10mmol/lのリン酸−カ
リウム、1mmol/lのコカルボキシラーゼ、及び5mmol/lの
塩化マグネシウムを含有する0.2〜1.0mol/lのグリシン
と水酸化カリウムとから成る緩衝溶液が好都合に使用で
きる。さらに、本発明のADPを生成物として与える酵素
の酵素活性の測定方法においては、目的酵素の酵素反応
を開始させるために上記緩衝溶液中に、適当濃度の上記
酵素の基質を添加することが必要である。
本発明のADP濃度の測定方法の原理は次のとおりであ
る。すなわち、ADPはピルベートキナーゼの触媒作用に
よりホスホエノールピルビン酸と反応してアデノシン
５′−３リン酸（以下ATPと略記することがある）とピ
ルビン酸とを生じる。生成したピルビン酸は、ピルベー
トオキシダーゼの触媒作用により酸化されるが、この過
程において緩衝溶液中の溶存酸素が消費され、過酸化水
素が生成する。酸素の消費若しくは過酸化水素の生成
は、ただちに、それぞれ酸素電極における電流の減少若
しくは過酸化水素電極における電流の増加として検知さ
れる。このようにして、酵素電極における電流の変化の
程度から、試料中のADP濃度を測定することができる。
る。すなわち、ADPはピルベートキナーゼの触媒作用に
よりホスホエノールピルビン酸と反応してアデノシン
５′−３リン酸（以下ATPと略記することがある）とピ
ルビン酸とを生じる。生成したピルビン酸は、ピルベー
トオキシダーゼの触媒作用により酸化されるが、この過
程において緩衝溶液中の溶存酸素が消費され、過酸化水
素が生成する。酸素の消費若しくは過酸化水素の生成
は、ただちに、それぞれ酸素電極における電流の減少若
しくは過酸化水素電極における電流の増加として検知さ
れる。このようにして、酵素電極における電流の変化の
程度から、試料中のADP濃度を測定することができる。
また、本発明のADPを生成物として与える酵素の酵素活
性方法の原理は次のとおりである。目的酵素の基質存在
下では、この酵素はその酵素活性に比例した速度でADP
を生成する。このADPの生成速度若しくは酵素反応開始
から一定時間後のADP濃度は、上記ADP濃度の測定方法の
原理と同様の原理で、酵素電極における電流の変化とし
て検知される。このようにして酵素電極における電流の
変化の程度から試料中の目的酵素の酵素活性を測定する
ことができる。
性方法の原理は次のとおりである。目的酵素の基質存在
下では、この酵素はその酵素活性に比例した速度でADP
を生成する。このADPの生成速度若しくは酵素反応開始
から一定時間後のADP濃度は、上記ADP濃度の測定方法の
原理と同様の原理で、酵素電極における電流の変化とし
て検知される。このようにして酵素電極における電流の
変化の程度から試料中の目的酵素の酵素活性を測定する
ことができる。
次に添付図面により、本発明の方法をさらに具体的に説
明する。
明する。
第１図は、本発明の方法に用いられる装置の１例を示す
概略断面図で、酵素電極又は過酸化水素電極１の表面
に、ピルベートオキシダーゼ固定化膜２及びピルベート
キナーゼ固定化膜３がＯリングなどほ用いて固定され、
酵素電極が形成される。ホスホエノールピルビン酸を含
む緩衝溶液４が容器10に満たされ、この溶液中に酵素電
極が挿入される。また溶液中の溶存酸素量を上げ、かつ
一定に保つための空気あるいは酵素の吹き込み管５が設
けられているが、さらにマグネットスターラー６などを
用いて溶液をかき混ぜるのが好ましい。酵素電極の出力
電流は電流計又は抵抗７を介して電圧に変換され、記録
計８に記録される。電極１が電池式のものでない場合に
は、外部電源11を用いて電極１に適当な電圧を印加す
る。試料添加前の電極１における電流値は電極１として
酵素電極を用いた場合には、緩衝溶液３中の溶存酵素量
に比例した一定値を示し、過酸化水素電極を用いた場合
には、緩衝溶液３中に過酸化水素が全く存在しないから
零である。
概略断面図で、酵素電極又は過酸化水素電極１の表面
に、ピルベートオキシダーゼ固定化膜２及びピルベート
キナーゼ固定化膜３がＯリングなどほ用いて固定され、
酵素電極が形成される。ホスホエノールピルビン酸を含
む緩衝溶液４が容器10に満たされ、この溶液中に酵素電
極が挿入される。また溶液中の溶存酸素量を上げ、かつ
一定に保つための空気あるいは酵素の吹き込み管５が設
けられているが、さらにマグネットスターラー６などを
用いて溶液をかき混ぜるのが好ましい。酵素電極の出力
電流は電流計又は抵抗７を介して電圧に変換され、記録
計８に記録される。電極１が電池式のものでない場合に
は、外部電源11を用いて電極１に適当な電圧を印加す
る。試料添加前の電極１における電流値は電極１として
酵素電極を用いた場合には、緩衝溶液３中の溶存酵素量
に比例した一定値を示し、過酸化水素電極を用いた場合
には、緩衝溶液３中に過酸化水素が全く存在しないから
零である。
試料中のADP濃度を測定する場合には、緩衝溶液３にADP
を含む試料の所定量を、例えば供給管９などを用いて添
加すると、ADPとホスホエノールピルビン酸とは、ピル
ベートキナーゼ固定化膜３中に拡散し、ピルビン酸が生
成される。生成したピルビン酸は、さらにピルベートオ
キシダーゼ固定化膜２中に拡散し酸化され、この際、酸
素を消費し、過酸化水素を発生する。これに伴い、電極
１の電流は、電極１して酸素電極を用いた場合には減少
し、過酸化水素電極を用いた場合には増加する。しかも
この電流の減少若しくは増加の程度はADP濃度に比例す
るから、電流の減少若しくは増加の程度を求めれば、試
料中のADP濃度を測定することができる。
を含む試料の所定量を、例えば供給管９などを用いて添
加すると、ADPとホスホエノールピルビン酸とは、ピル
ベートキナーゼ固定化膜３中に拡散し、ピルビン酸が生
成される。生成したピルビン酸は、さらにピルベートオ
キシダーゼ固定化膜２中に拡散し酸化され、この際、酸
素を消費し、過酸化水素を発生する。これに伴い、電極
１の電流は、電極１して酸素電極を用いた場合には減少
し、過酸化水素電極を用いた場合には増加する。しかも
この電流の減少若しくは増加の程度はADP濃度に比例す
るから、電流の減少若しくは増加の程度を求めれば、試
料中のADP濃度を測定することができる。
試料中のADPを生成する酵素の酵素活性を測定する場合
には、目的酵素の基質をあらかじめ緩衝溶液３に加えて
おき、目的酵素を含む試料の所定量を例えば供給管９な
どを用いて添加するか、若しくは、緩衝溶液３に目的酵
素を含む試料の所定量を例えば供給管９などを用いて添
加した後、さらに目的酵素の基質を加えるかのいずれか
の手順により、目的酵素の酵素反応を開始させる。する
と、ADP濃度は、目的酵素の活性に比例して時間と共に
直線的に増加する。この変化は、ピルベートキナーゼ固
定化膜３及びピルベートオキシダーゼ固定化膜２におけ
る反応を介してただちに電極１における電流の直線的な
変化、すなわち、電極１として酸素電極を用いて場合に
は、電流の直線的な減少、過酸化水素電極を用いた場合
には、電流の直線的な増加をひき起す。しかも、この直
線部の電流変化の時間に対する場合は目的酵素の酵素活
性に比例するから、上記割合を求めれば試料中の目的酵
素の酵素活性を測定することができる。
には、目的酵素の基質をあらかじめ緩衝溶液３に加えて
おき、目的酵素を含む試料の所定量を例えば供給管９な
どを用いて添加するか、若しくは、緩衝溶液３に目的酵
素を含む試料の所定量を例えば供給管９などを用いて添
加した後、さらに目的酵素の基質を加えるかのいずれか
の手順により、目的酵素の酵素反応を開始させる。する
と、ADP濃度は、目的酵素の活性に比例して時間と共に
直線的に増加する。この変化は、ピルベートキナーゼ固
定化膜３及びピルベートオキシダーゼ固定化膜２におけ
る反応を介してただちに電極１における電流の直線的な
変化、すなわち、電極１として酸素電極を用いて場合に
は、電流の直線的な減少、過酸化水素電極を用いた場合
には、電流の直線的な増加をひき起す。しかも、この直
線部の電流変化の時間に対する場合は目的酵素の酵素活
性に比例するから、上記割合を求めれば試料中の目的酵
素の酵素活性を測定することができる。
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１ ADP濃度の測定 ピルベートオキシダーゼ（東洋醸造、131U/mg）10mgをp
H6.7のリン酸緩衝溶液（0.1mol/l）に溶解し、感光性ポ
リビニルアルコール10％溶液1mlと混合し、これを約10c
m2の面積に展開した後風乾し、さらに光照射して水に不
溶のピルベートオキシダーゼ固定化膜を得た。ピルベー
トキナーゼ（シグマ、400IU/mg）5mgをpH6.7のリン酸緩
衝溶液（0.1mol/l）に溶解し、上記の感光性ポリビニル
アルコール10％溶液1mlと混合し、上記と同様の操作に
より約10cm2の面積のピルベートキナーゼ固定化膜を得
た。いずれの固定化膜も直径1cmに切り抜き、面積約0.1
cm2の白金電極を作用極とし、多孔性ポリテトラフルオ
ロエチレン膜を隔膜とする電池式酸素電極の隔膜上に、
ピルベートオキシダーゼ固定化膜、ピルベートキナーゼ
固定化膜の順で載せ、Ｏリングで全体を締めつけた。こ
のようにして製作した酵素電極を、1mmol/lのホスホエ
ノールピルビン酸、10mmol/lのリン酸−カリウム、1mmo
l/lのコカルボキシラーゼ、及び5mmol/lの塩化マグネシ
ウムを含む0.4mol/lグリシン−水酸化カリウム緩衝溶液
（pH9.0）10ml中に挿入した。
H6.7のリン酸緩衝溶液（0.1mol/l）に溶解し、感光性ポ
リビニルアルコール10％溶液1mlと混合し、これを約10c
m2の面積に展開した後風乾し、さらに光照射して水に不
溶のピルベートオキシダーゼ固定化膜を得た。ピルベー
トキナーゼ（シグマ、400IU/mg）5mgをpH6.7のリン酸緩
衝溶液（0.1mol/l）に溶解し、上記の感光性ポリビニル
アルコール10％溶液1mlと混合し、上記と同様の操作に
より約10cm2の面積のピルベートキナーゼ固定化膜を得
た。いずれの固定化膜も直径1cmに切り抜き、面積約0.1
cm2の白金電極を作用極とし、多孔性ポリテトラフルオ
ロエチレン膜を隔膜とする電池式酸素電極の隔膜上に、
ピルベートオキシダーゼ固定化膜、ピルベートキナーゼ
固定化膜の順で載せ、Ｏリングで全体を締めつけた。こ
のようにして製作した酵素電極を、1mmol/lのホスホエ
ノールピルビン酸、10mmol/lのリン酸−カリウム、1mmo
l/lのコカルボキシラーゼ、及び5mmol/lの塩化マグネシ
ウムを含む0.4mol/lグリシン−水酸化カリウム緩衝溶液
（pH9.0）10ml中に挿入した。
溶液表面からは毎分約200mlの空気を吹きつけ、マグネ
ットスターラーを用いて溶液をかくはんした。溶液の温
度は30℃に保った。第２図は、上記溶液に濃度0.1mmol/
lのADPを添加した時の酵素電極における電流の時間変化
を示すグラフである。この図から明らかなように、ADP
添加後、約30秒で電流は定常値になる。第３図はADP含
有試料添加後の定常状態での電流の減少値とADP濃度と
の関係を示したグラフである。ADP濃度0.5mmol/l以下で
は完全に比例関係が成立しているから、第３図に示した
グラフを用いて、この濃度以下の試料中の未知ADP濃度
を電流の減少値から求めることができる。
ットスターラーを用いて溶液をかくはんした。溶液の温
度は30℃に保った。第２図は、上記溶液に濃度0.1mmol/
lのADPを添加した時の酵素電極における電流の時間変化
を示すグラフである。この図から明らかなように、ADP
添加後、約30秒で電流は定常値になる。第３図はADP含
有試料添加後の定常状態での電流の減少値とADP濃度と
の関係を示したグラフである。ADP濃度0.5mmol/l以下で
は完全に比例関係が成立しているから、第３図に示した
グラフを用いて、この濃度以下の試料中の未知ADP濃度
を電流の減少値から求めることができる。
実施例２ クレアチンキナーゼ活性の測定 実施例１に用いた酵素電極を1mmol/lのホスホエノール
ピルビン酸、10mmol/lのリン酸−カリウム、1mmol/lの
コカルホキシラーゼ及び5mmol/lの塩化マグネシウム、
さらに標記酵素の基質として5mmol/lのATP及び33mmol/l
のクレアチンを含む0.4mol/lグリシン−水酸化カリウム
緩衝溶液（pH9.0）10ml中に挿入した。溶液表面からは
毎分約200mlの空気を吹きつけ、マグネットスターラー
を用いて溶液をかきまぜた。溶液の温度は30℃に保っ
た。
ピルビン酸、10mmol/lのリン酸−カリウム、1mmol/lの
コカルホキシラーゼ及び5mmol/lの塩化マグネシウム、
さらに標記酵素の基質として5mmol/lのATP及び33mmol/l
のクレアチンを含む0.4mol/lグリシン−水酸化カリウム
緩衝溶液（pH9.0）10ml中に挿入した。溶液表面からは
毎分約200mlの空気を吹きつけ、マグネットスターラー
を用いて溶液をかきまぜた。溶液の温度は30℃に保っ
た。
この溶液にクレアチンキナーゼを添加すると、次の反応
に従ってADP濃度は、時間と共に直線的に増加する。
に従ってADP濃度は、時間と共に直線的に増加する。
第４図は、緩衝溶液中に100U/lの活性のクレアチンキナ
ーゼを添加した時の酵素電極における電流の時間変化を
示すグラフであって、クレアチンキナーゼ添加の約30秒
後から電流は時間の経過と共に直線的に減少している。
第５図は、クレアチン含有試料添加後の直線部分におけ
る電流減少の時間的割合と、クレアチンキナーゼ活性と
の関係を示したグラフである。クレアチンキナーゼ活性
200U/l以下では完全に比例関係が成立しているから、第
５図に示したグラフを用いて、この活性以下の試料中の
未知クレアチンキナーゼ活性を電流減少の時間的割合か
ら求めることができる。
ーゼを添加した時の酵素電極における電流の時間変化を
示すグラフであって、クレアチンキナーゼ添加の約30秒
後から電流は時間の経過と共に直線的に減少している。
第５図は、クレアチン含有試料添加後の直線部分におけ
る電流減少の時間的割合と、クレアチンキナーゼ活性と
の関係を示したグラフである。クレアチンキナーゼ活性
200U/l以下では完全に比例関係が成立しているから、第
５図に示したグラフを用いて、この活性以下の試料中の
未知クレアチンキナーゼ活性を電流減少の時間的割合か
ら求めることができる。
第１図は、本発明方法で用いる測定装置の一例を示す概
略図面、第２図はADP含有試料を添加した場合の電流の
経時的変化を示すグラフ、第３図はADP濃度と電流との
関係を示すグラフ、第４図は、クレアチンキナーゼ含有
試料を添加した場合の電流の経時的変化を示すグラフ、
第５図は、本発明のADPを生成物とする酵素の酵素活性
測定方法による電流減少の時間的割合とクレアチンキナ
ーゼ活性との関係を示すグラフである。 第１図中の符号１は、酵素電極又は過酸化水素電極、２
は固定化ピルベートオキシダーゼ膜、３は固定化ピルベ
ートキナーゼ膜、４は緩衝溶液、５は空気吹き込み管、
６はマグネットスターラー、７は電流計又は抵抗、８は
記録計、９は試料供給管、10は容器、11は外部電源であ
る。
略図面、第２図はADP含有試料を添加した場合の電流の
経時的変化を示すグラフ、第３図はADP濃度と電流との
関係を示すグラフ、第４図は、クレアチンキナーゼ含有
試料を添加した場合の電流の経時的変化を示すグラフ、
第５図は、本発明のADPを生成物とする酵素の酵素活性
測定方法による電流減少の時間的割合とクレアチンキナ
ーゼ活性との関係を示すグラフである。 第１図中の符号１は、酵素電極又は過酸化水素電極、２
は固定化ピルベートオキシダーゼ膜、３は固定化ピルベ
ートキナーゼ膜、４は緩衝溶液、５は空気吹き込み管、
６はマグネットスターラー、７は電流計又は抵抗、８は
記録計、９は試料供給管、10は容器、11は外部電源であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 7363−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３ Ｕ
Claims (2)
- 【請求項１】ホスホエノールピルビン酸を含む緩衝溶液
中に、固定化ピルベートオキシダーゼ及び固定化ピルベ
ートキナーゼと酸素電極又は過酸化水素電極とで構成さ
れた酵素電極を挿入したのち、この緩衝溶液中にアデノ
シン５′−二リン酸を含む試料を添加し、この際の電極
における電流の減少量又は過酸化水素電極における電流
の増加量を検知し、この変化量から試料中のアデノシン
５′−二リン酸濃度を求めることを特徴とする測定方
法。 - 【請求項２】ホスホエノールピルビン酸及び酵素活性を
測定しようとする酵素の気質を含む緩衝溶液中に、固定
化ピルベートオキシダーゼ及び固定化ピルベートキナー
ゼと酸素電極又は過酸化水素電極とで構成された酵素電
極を挿入したのち、この緩衝溶液中にアデノシン５′−
二リン酸を生成物として与える酵素を含む試料を添加
し、この際の酸素電極における電流の減少量又は過酸化
水素電極における電流の増加量を検知し、この変化量か
ら該酵素の酵素活性を求めることを特徴とする測定方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58226590A JPH0690177B2 (ja) | 1983-11-29 | 1983-11-29 | 酵素電極を用いるアデノシン５´―二リン酸濃度又は酵素活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58226590A JPH0690177B2 (ja) | 1983-11-29 | 1983-11-29 | 酵素電極を用いるアデノシン５´―二リン酸濃度又は酵素活性の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60119459A JPS60119459A (ja) | 1985-06-26 |
| JPH0690177B2 true JPH0690177B2 (ja) | 1994-11-14 |
Family
ID=16847558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58226590A Expired - Lifetime JPH0690177B2 (ja) | 1983-11-29 | 1983-11-29 | 酵素電極を用いるアデノシン５´―二リン酸濃度又は酵素活性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0690177B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090162881A1 (en) * | 2005-11-14 | 2009-06-25 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method of measuring adenine nucleotide |
| JP2007155713A (ja) * | 2005-11-14 | 2007-06-21 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | アデニンヌクレオチドの測定方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4467811A (en) * | 1979-08-02 | 1984-08-28 | Children's Hospital Medical Center | Method of polarographic analysis of lactic acid and lactate |
| JPS5786752A (en) * | 1980-11-19 | 1982-05-29 | Omron Tateisi Electronics Co | Measuring method for enzyme activity by electrode method |
-
1983
- 1983-11-29 JP JP58226590A patent/JPH0690177B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60119459A (ja) | 1985-06-26 |
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