JPS6026978B2 - ポーラログラフ分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、コレステロールのようなステロール類、およ
び他の高分子物質のポーラログラフ分析法に関する。

生物医学的また工業的応用のため、これまで多くの分析
技術的研究が行われてきた。

臨床診断を含め、これらの応用分野における分析技術の
重要性はきわめて大きい。たとえば、過去２０年間に、
コレステロールやトリグリセラィドと動脈硬化症の関係
は確立されたものとなり解決された。まずコレステロー
ルまたはトリグリセライドの上昇が確認されれば、リピ
ドおよびリポ蛋白のさらに詳細な評価が診断と治療に有
用である。血数コレスブロールの定量によるスクリーニ
ング操作は、動脈硬化症の治療の第一歩である。コレス
テロールと動脈硬化症との密接な関係から、血酸コレス
テロ−ルの定量については多くの研究が行われてきた。
最近、イソプロパノールによる抽出および鹸化ののち比
色により定量する方法が広く用いられるようになり、１
時間に３０蓑体の速さでかなり正確な自動分析も可能に
なっている。しかしながら、この比色法は高価につき、
比較的非特異的で、わずかな湿度やピリルビン濃度の変
化にも影響されやすく、また濃硫酸、無水質酢酸、酢酸
のような腐蝕性の強い薬剤を用いる必要がある。しかも
、比色法では少なくとも５ないし１０ｃｃの血液サンプ
ルを静脈穿刺で採取する必要がある。さらに最近になり
、コレステロール定量に２つの大きな改良法が出現した
。

ひとつは気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）の利用であ
り、もうひとつは酵素的定量法である。ＧＬＣ法はコレ
ステロールに対し特異性が高く、正確で、またきわめて
感度が高い。定量準備操作における有機溶媒抽出は不要
となるが、鹸化は省けない。ＧＬＣ法は血数サンプル必
要量１０−５０仏〆程度の微量定量法であって、サンプ
ルは毛細管サンプリングの範囲で十分である。ＧＬＣ法
は自動化もできるが、一方、比較的高価な装置を必要と
し、また精度を維持するためには熟練した技術的管理が
要求される。これまで用いられてきた酵素法は、２種の
酵素、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）とコレステ
ロールヒドラーゼ（ＣＥ）を比色技術と組み合わせたも
のである。

この比色法は、コレステロールまたはそのェステルを酵
素でコレステノンと過酸化水素に変換し、ついでこの過
酸化物と各種化合物との反応により、色素源または蟹光
源を生成せしめるものである。約１３芋前、物質のポー
ラ。

グラフ分析に際し、酵素と組み合わせた電極を用いる方
法が報告された。たとえば、本発明者の米国特許第３既
製５５号には、従来、ポーラログラフ法では直接分析す
ることは困難であった物質を迅速かつ正確に定量するた
めの、膜ポーラログラフ電極系および方法が記載されて
いる。上記特許の記述によれば、グルコースのような低
分子物質が膜ポーラログラフ電極系により定量できる。
グルコースのような低分子物質は透過するが、蛋白など
は透過しないセルロールやその他の膜を用い、膜の陰極
側にはグルコースと反応するようにグルコースオキシダ
ーゼを保持させる。したがって、たとえば血液サンプル
を膜の電極と反対側に置き、膜の電極側には酵素水溶液
と酵素を直けば、グルコースのような低分子物質は血液
サンプルから膜を通過し、電極側で酵素反応が起こる。
一定時間後には安定状態に到達し、このとき過酸化水素
濃度はグルコース濃度に正比例し、セルには生成した過
酸化水素量の函数としての電流が流れる。これらグルコ
ース量を指示することになる。本発明者による‘‘Ｅｌ
ｅｃｔｒｏｄｓＳｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｉｎｕ
ｏ瓜 Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓ
ｕｌａｒ Ｓｍ餌【ｙ”、Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏ
ｆＳｃｉｅｍｅｓ、Ｖｏｌ．１０２、ｐｐ．２９一４５
（１９６２）の論文中には、酵素反応により消費される
酵素がグルコース含；に比例するから、ＣＩａｒｋ酸素
電極をグルコール感受性に配置できることも記載されて
いる。

このような配直では、内腰はグルコース非透過性で、反
応は酸素の低下により監視される。しかしながら、副生
成物日２０２を測定するこの従釆の膜ポーラログフラフ
法は、酵素が膜の電極側に置かれるので、酵素反応のた
めに膜を透過できるような低分子の定量に限られていた
。本発明は、コレステロールのような高分子物質には透
過性を示さない膜ポーラログラフ陰極系を用いることに
よって、このように高分子物質に正確、高感度、特異的
定量が可能であることの発見がひとつの基盤となってい
る。

詳しくは、膜の電極と反対側に設けたサンプル室におい
て、この種の高分子物質が少なくとも１種の酵素によっ
て変換され最終的に過酸化水素を生成した場合、少なく
とも一部の過酸化水素は腰内に拡散されて電極と接触し
、セルを流れる電流は過酸化水素生成率の尺度として、
すなわち検体中に存在する高分子物質の量を示すものと
して測定される。すなわち、本発明は、腰ポーラログラ
フ法では従来定量不能と考えられていた高分子物質の定
量法を提供するものである。

従来の膿ポーラログラフ法を用いた場合、高分子物質に
たいして所望の透過性を示すような膜は知られていない
。しかしながら、ポーラログラフ膜を薄遇できない高分
子物質の反応を膿内または膜に近い位置で起こさせ、日
２Ｑの生成率を、高分子物質の正確な指標としてポーラ
ログラフ電極により測定する方法を発見し本発明は完成
されたものである。このような結果は、これまで膿ポー
ラログラフ法については考えられないことであった。本
発明には多くの利点がある。

上述のコレステロールの場合、今日広く用いられている
方法は自動比色法であり、この方法は高価につき、多く
の共存物質の影響をうけやすく、また腐蝕性の高い物質
を使用しなければならない。しかも、この方法は少なく
とも５ないし１０ｃｃの血液サンプルを要し、これだけ
のサンプル採用はかなりの損失であると同時に苦痛を伴
う。これにたし、し、本発明の方法によれば、簡単かつ
安価な装置を用い、１０−５０仏そまたはそれ以下の量
の血簸で鹸化や腐蝕性の試薬は、また高度な専門技術の
必要もなく、正確、高感度かつ特異的にコレステロール
を定量できる。本発明の利点は、とくに血数中のコレス
テロール、すなわち総コレステロールおよび遊離コレス
テロールの両者を容易かつ有利に定量できる点にあるの
である。必要な電極応答は反応率の測定によるのであっ
て、コレステロールェステルがコレステロールに、また
コレステロールが過酸化水素に化学量論的に完全に変換
するかどうかは関係がないので、大部分の場合、定量は
４分以内に終る。これまで正確、迅速には検知できなか
った高分子物質が本方法により定量できる。本発明の原
理によれば、他の高分子物質も分析できる。

たとえば、高分子のデンプンをアミラ−ゼおよびその他
の加水分解酵素で分解し、この際の低分子生成物たとえ
ばグルコールまたはガラクトースにグルコースオキシダ
ーゼを作用させると、存在するデンプン量の指標となる
過酸化水素が生成し、膜の反対側で検知できる。すなわ
ち、本発明は少なくとも１種の酵素によって変換可能で
あり最終的に過酸化水素を生成する高分子物質のポーラ
ログラフによる定量分析法を提供するものである。この
種の高分子物質としては、コレスナロール、８ーシトス
テロール、力ンベステロールおよびスチグマステロール
を含めたステロール類、デンプンのようなポリサツカラ
イド、蛋白質、ポリベプチド、その他の重合物質のよう
な高分子化合物を挙げることができる。酵素コレステ。
ールオキシダーゼは、Ａ環に△４ または△５一重結合
および３８ーヒドロキシ基を有するステロールに特異的
であるから、この酵素法は血中コレステロールにとくに
特異的な方法であるといえる。しかしながら、本発明の
方法による定量には他の酵素反応も利用できる。もっと
も広義には、本発明は少なくとも１種の酵素によって変
換可能であり、最終的に過酸化水素を生成する物質の定
量的ポーラログラフ（函量的）分析法を意図するもので
ある。

ポーラログラフセルには過酸化水素に感受性を有する少
なくとも１種の電極および電解質を内蔵する。この電極
は、過酸化水素透過性で測定される物質を透過しない膜
の後方に位置させる。セル中には少なくとも１種の酵素
を膜の電極と反対側にあるサンプル室内に加えて、分解
する物質と酵素反応を起こさせ、技終的に過酸化水素を
生成させる。生成した過酸化水素量に比例した電流を生
ずるように、セルに電圧をかける。このような腰ポーラ
ログラフセル中に、測定される物質を含有する検体の一
定量を加えて、膜の電極と反対側で酵素反応を起こさせ
、少なくとも一部の過酸化水素を膿内に拡散させ、電極
と接触させる。次に、生成した過酸化水素量の函数とし
て、すなわち検体中の物質量の指標としてセル中を流れ
る電流を測定する。流れる電流は分析する物質との酵素
反応による過酸化水素生成率の尺度となる。コレステロ
ールの定量的ポーラログラフ分析の好ましい形態は、コ
レステロールおよびそのュステルとコレステロールオキ
シダーゼ（ＣＯ）およびコレステロールェステラーゼ（
ＣＥ）を連続的かつ同時に反応させてコレスティンと過
酸化水素を生成させ、過酸化水素感知性ポーラログラフ
白金陰極によりこれを検知する。

はじめ１種の物質、たとえば遊離コレステロールのみを
定童したい場合は、まずコレステロールオキシダーゼの
みを用い、ついで第２の物質たとえばコレステ。ールェ
ステルをコレステロールェステラーゼで遊離コレステロ
ールに変換して定量する。また、関係する全酵素を用い
て全反応を同時に進行させることもできる。たとえば、
エステラーゼとオキシダーゼを同時に加えれば、各酵素
を時間をずらせて反応させた場合に得られる反応に相当
する電極反応を得ることができる。この方法は、血清コ
レステロールの測定にとくに有用であり、上述のような
利点が得られる。

また、他の形態として、全血サンプルの分析もできる。
たとえば、酵素を全血サンプルを含むサンプル室溶液に
加えると、オキシダーゼによって生成した過酸化水素は
血中の高いカタラーゼ活性により速やかに分解してしま
う可能性がある。しかしながら、わずかに溶血を起こし
た血数にナトリウムアジドのような薬剤を用いると、こ
の問題は解決できる。たとえば、ヘモグロビン値約２０
−２００のｏ％のわずかに溶血した血液に、アジドまた
は類似薬剤を加えてカタラーゼ活性を阻害できる。アジ
ドが過酸化水素の自然分解を阻止し、またその殺菌作用
によりｐＨ調整用緩衝剤に防腐にも役立つことが明らか
にされている。したがって、本発明は、血鰍中およびわ
ずかに溶血した血数中のコレステロールを迅速に測定で
きる方法を提供するものである。本発明によれば、また
、新しい電極構造および方法を用い、全血サンプル中の
高分子物質を膜ポーラログラフ法によって分析すること
が可能になる。

上述のように、コレステロール定量のための酵素反応は
、ポーラログラフ膜の外側、すなわち電極と逆の側で起
こり、酵素もこの側にある。すなわち、酵素は膜の電極
と反対側にあるセル溶液中に加えられる。酵素が固定さ
れていないときは、各測定毎に酵素を捨てなければなら
ず、各測定に要する費用は高くなる。したがって、好ま
しい態様においては、酵素の１種または２種以上を電極
膜の外側表面またはサンプル室内に結合させて酵素の固
定化をはかることもできる。この形態においては、固定
酵素とともに電極も再使用でき、これにより、もっと高
価な高純度の酵素を用い、定量速度および電極感度を改
良することも可能になる。さらに、固定自体が不安定な
酵素の安定化に役立ち、再現性を上昇させること、また
対照試験の施行回数を減らすことができるようになる。
膜固定酵素は、また、全血サンプルの直接分析を可能に
する。本発明およびその利点を、以下、図面を参照しな
がら、さらに詳細に説明する。

第１図は、本発明の方法に用いられるポーラログラフ装
置およびその他の手段を図解的に例示したものであり、
電気回路、ポーラログラフセルおよびサンプル室の配置
の概略を、サンプル室の部分断面図とともに示したもの
である。

第２図は第１図に示したタイプの電極プロ‐べの好まし
い形態および酵素固定を例示したものである。第３図は
血環および人工血鰍サンプルについて電流と時間の関係
をプロントしたものである。第４図は第１図の電極プロ
一べ構造、および第２図の結合酵素構造を採用し、あら
かじめ定通した対照サンプルについて電流とコレステロ
ールの濃度をプロツトしたものである。本発明の原理を
、血※コレステロール含量分析の場合を参照して説明す
る。

血数中コレステロールェステルは、以下の酵素反応１に
したがい、コレステロールエステルヒドラーゼ（ＣＥ）
により変換される。コレステロールェステル＋比Ｏ ＣＥ −− コレステロール十創生酸 上記ェステルの反応で遊離したコレステロールおよび血
数中遊離コレステロールの両者が、酸素（０２）および
コレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）の存在下に反応し
、次の反応２にしたがってコレステノンおよび過酸化水
素を生成する。

Ｃ○ コレステロール６７コレステノン十日２０２第１図のポ
ーラログラフ装置中、電極５の白金電極６において、一
定量の過酸化水素が酸化され、これは反応３によって表
わすことができる。

比０２→２Ｈ＋＋０２十を‐回路は銀陽極で完成され、
ここで酸素は水に還元される。

これは反応４で表わされる。岬＋０２一地０地‐ 第１図に示した装贋の操作原理と上記反応を以下に関連
づけながら説明する。

第１図には、ポーラログラフセル９、電極プロ‐べ５お
よびサンプルキューペットまたはサンプル室８が例示さ
れている。以下の詳細な操作法では、ＹｅｌｌｏｗＳｐ
ｒｉｎ袋ｌｎｓ口ｍｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙグルコース
分析計２２型を改良して用いた。すなわち、セルには電
源として約０．６ボルトの電池１０を用いた。電池１０
の陽極は、極面１ １の径０．５側の白金ポーラログラ
フ陽極６に結合ごて、活性表面１２の表面積約０．５地
の銭補助電極７に隣接させる。出力のフルスケールは１
００１十アンペアのオーダーとする。電流の測定にはＧ
−２５００Ｖａｎａｎ帯状チャート記録計（図示してい
ない）を用いた。電極プロ−べ５は絶縁支持体１３とと
もに図式的に示したのみであるが、電極も互に絶縁され
ている。電極プロ‐べの瓶はセ。フアン腹１４（１言ｉ
ｎ．透析チューブ、Ａ．日．Ｔｈｏｍａｓ Ｃｏ．、Ｃ
ａｔ．Ｎｏ．４４６５一Ａ２）によってカバーされ、こ
れは電極を保護するとともに、容量０．４０凧‘、滋℃
に恒溢化されたサンプル室８から電極への拡散通路を形
成する。膜１４は環１５によって電極プロ‐べにはめ込
む。セロフアン膜１４は過酸化水素、水、酸素および塩
を容易に通過させるに十分な透過性を有するが、測定す
べき物質、カタラーゼのような阻害物質、酸素の存在下
に過酸化水素を遊離する反応を起こす酵素は透過させな
い。サンプル室８の側には、薄い酸素透過性膜たとえ‘
よシリコンラバーを位置させる。これは、蝿梓ポンプか
らサンプル室８中の酵素−電解質混合物へ空気または酸
素を通過させ〜気体は排出口を通じて排出する。陰極の
活性表面１ １は、セロフアン膜１４から毛管距離に位
置させ、電解質混合物と接触させる。上述のように補助
銀陽極表面１２は白金陰極表面１１に隣接して位置させ
、これも電解質混合物と接触させる。ほかに、皿糠サン
プル注入用シリンジ、また、緩衝液供給部、注入口、隔
壁帯および廃棄物取出口を図示したが、これは分析の手
順を例示している。典型的な電気回路図も示したが、電
圧計１６を組み込んで、これにより、酵素ーコレステロ
ール反応の過酸化水素副生物を検知して生成した亀流を
読むことができる。かくして得られた電流は血※中のコ
レステロール濃度に比例する。第１図に例示したタイプ
のポーラログラフ電極系および構造に関しての詳細は米
国特許第総３班５５号の記載を参照されたい。酵素によ
って変換可能で最終的に過酸化水素を生成するコレステ
ロールの定量に用いられる第１図の膜ポーラログラフ装
置の操作は次のとおりである。

電解質水溶液および緩衝液をサンプル室８に入れる。コ
レステロールオキシダーゼおよびエステラーゼ酵素の両
者をサンプル室中、膜１４の電極と逆の側に入れ、ここ
で血数サンプル中のコレステロールと反応させ最終的に
過酸化水素を生成させる。分析する皿嫌サンプルは、シ
リンジにより隔壁帯を適してサンプル室８内に導入する
。酸素は鷹梓ポンプにより透過性シリコンラバーを通じ
てサンプル室内に供野合される。かくして、分析すべき
コレステロール含有血数の一定量および酵素が膜の電極
プロ‐べ５と逆の側に加えられる。血数中の遊離および
結合コレステロールの両者は酵素系ＣＯおよびＣＥと接
触し、上述のように酸素の存在下、酵素反応が起こって
、コレステノンおよび過酸化水素を生成する。ついで過
酸化水素はセロフアソ膜内に拡散し、白金陰極と接触す
る。この時点で、上述の白金陰極および綾陽極での反応
が起こる。かくして、拡散した過酸化水素量に比例して
電流を生じ、これがセルを横切って流れる。電圧計１６
により、セルを流れる電流、すなわち生成した過酸化水
素の函数であり、血数中のコレステロール墨を示す電流
を測定する。ポーラログラフ陰極は過酸化水素の生成率
を測定するのであって、酵素反応は完全に進行する必要
はない。とくに好ましい態様によれば、コレステロール
の定量においては以下の材料および方法を用いることが
できる。

キューペット試薬−キューペット試薬の組成を表１に示
す。ｐＨ‘ま２種のリン酸塩により６．６に調整する。
表 １キューペット試薬の機能も表１に示したとおりで
ある。

緩衝剤の防腐およびカタラーゼの阻害に用いられるナト
リウムアジドはキューペット中に放出された過酸化水素
を安定化する効果もある。上述のように、全血中にはカ
タラーゼが多く含まれているので、全血または溶血が著
しい血液を結合させてし、ない酵素で分析することはで
きない。酵素ーコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）〔
酵素番号１．１．３．６〕は、Ｎ比ａｒｄｉａまたはＢ
ｒｅｖｉ舷ｃｔｅｈｕｍｓｐ．から得られる。ＣＯは酵
素９．４ｕを１％トリトンＸ−１００（非イオン性アル
カリポリェーテル、Ｒｈｏｍｑ Ｈａａｓ）１の【に溶
解して調製する。酵素活性は国際単位（ｕ）で示す。コ
レスナロールェステルヒドラーゼ（ＣＯ）〔酵素番号３
１．１．１３〕はウシ藤減から得、９．４ｕを１％トリ
トンＸ−１００の１の‘に溶解して調製する。コレステ
ロール襟品−コレステロールはアセトンから再結晶し、
シリカゲル上で乾燥して精製する。これをＢ的ｎｓｏｎ
Ｊ１７Ａ型ソニケーターを用いて界面活性剤溶液中に乳
化する。適当なコレステロール乳化液濠品は、１％ステ
アリン酸ェステル溶液中２００ｍｃ％を含有しｐＨは７
．１に調整するか、またはトリトン×−１００中２０肋
９％に調製する。市販の標品を用いて希釈曲線の検定を
行ってもよい。保存ヒト血数を、Ａ−０比色法ぐＬｉｐ
ｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏ財ａｍ”、Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ ＬａｂｏｒａｔｏひＯｐｅｒａｔｉｏ船 、
ＮａｔｉｏＭＩ Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ
ｌｎｓｔｉ机ｔｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｎｂｒｙｌａｎ
ｄ、Ｖｏｌ、１、１９７４）によってくり返し定量し、
これをヒト血数サンプル分析用標準曲線の作成に使用す
る。本発明のコレステロール電極法によってヒト血※サ
ンプルを分析し、Ａ−０比色法と比較する前に、酵素濃
度、温度、風、反応時間等の実験条件および機械感度の
セッテイングを、それぞれ単独に、また組み合わせて検
討し、至適条件を次のように決定した。コレステロール
オキシダーゼ濃度−ＣＯ注入にたし・する電極応答の初
期の研究には、ィヌ血鰍５０仏夕と各種量のＣＯを用い
た。

もっとも安定で再現性のある応答は、０．１５ｕのＣＯ
で観察され、安定した読みは６−８分に得られた。もっ
と大量のＣ０（１．繋、０．５２ぬ）を用いた場合のピ
ーク活動性は２、３および４分にそれぞれ得られたが、
総電極反応は０．１４ｕの場合と差がなかった。ヒト血
数５０山そを用いた場合の至適電極応答は０．１５ｕで
得られ、これより大力では変動性のある結果を生じ、こ
れにより小量では反応が安定したピークレベルをもたら
さなかった。コレステロールェステラ−ゼ濃度ーヒト血
数５０山そおよびＣＯの０．１５山を用い、ＣＥ濃度を
かえて一連の研究を実施した。

最大電極応答は０．０凶ないし０．４肌で、またもっと
も再現性の高い応答曲線は０．幼で得られた。血嬢をＣ
Ｅとともにあらかじめ別個にインキュベートし、ついで
血糠ＣＥ混合物をＣＯとともに注入した場合も、ＣＯと
ＣＥを同時に注入した場合と総コレステロールの読み（
６一８分内）は同一であることも確認した。温度の影響
−血酸５０〃そ、ＣＯ（０．１５ｕ）およびＣＥ（０．
２肌）の至通濃度を用いて、温度の影響を検討した。３
びＣ以下の温度では、反応速度はきわめて遅く（ピーク
鰭極応答には１２−１５分で到達）、総電極応答も低か
った。

このような低い温度でも直線の標準曲線は得られるが、
鏡斜が低く、電極応答のわずかな変化が標準曲線から読
みとられるコレステロール測定値の大きな変化に相当し
てしまう。５ぴ および６ぴ○では反応速度は速く（ピ
ーク活動性は２分で得られる）電量計の読みも増大する
。

しかしながら、この湿度では、多分、セロフアン膜の急
速な劣化および膜を保持する環のゆるみによると思われ
る電極応答の変動が大きくなる。現在用いられている３
？０では、反応速度も中程度（４一８分）で、標準曲線
も直線性を示し、膜もすぐれた耐久性を示して、数週間
とりかえないで使用できる。至適ｐＨ−表０‘こ示すよ
うに、酵素反応は広域のｐＨで安定である。

表ロ イヌ血策とコレスブロールオキソグーゼおよび添加コレ
スブロールオキソグーゼ＋コレスナロ‐ルェステルヒド
ラ−ゼの存在下における電極電流とＰＨキューペット試
薬のｐＨはリン酸または濃水酸化カリウム溶液で調整す
る。

キューペットに適当な緩衝液を満たしたのち、イヌ血数
５０ムクついでＣＯを注入する。ピーク鰭流に達したの
ち、ＣＥを注入して、ピークに達し安定化したのち電流
を記録する。最終定量法に用いたｐＨ６．６を便宜上選
定した。至道キューペット試薬、酵素濃度、反応条件を
設定したのち、血※コレステロールを以下の方法により
、あらかじめ定量した、または秤量によって調整した標
準コレステロール溶液について測定し、希釈曲線の偏差
、精度、感度および特異性の検討を行った。

血簸、サンプル調製および分析−血糠サンプルは、１２
−１岬時間絶食後、静脈穿刺によりＥＤＴＡ含有チュー
ブに採取し、血凝を４℃で遠心分離して調製した。

小動物の血液は、眼橋出血または心臓穿刺によって採取
した。分析装置のキューペットは１回の分析毎に、斑。
○、ｐＨ６．６の０．９Ｍリン酸塩緩衝液でくり返し洗
浄して準備する。洗浄後、よく水をきって、表１に示し
た組成を有するキュ−ペット試薬を満たす。つぎにマイ
クロリッターシリンジを用いて血数（２０一５０ｒそ）
を注入し、さらにコレステロールオキシダーゼ２５山夕
（０．１５ｕ）およびＣＥ２０仏夕（０．２肌）を加え
る。

安定した電流の読みが得られたのち（４一８分）、電極
応答を読む。遊離およびェステル化コレステロールを測
定する場合には、血鰍をまず注入し、ついでＣＯを加え
る。安定した電流応答が遊離コレステロールについて得
られたのち、ＣＥを注入し、コレステロールェステルに
ついて第２の安定した読みを得る。各血酸サンプルの分
析後、キューペットをリン酸塩緩衝液で３回洗浄し、次
にサンプルを加える。はじめ、第１図の装置によりコレ
ステロール懸濁液を測定した。

第３図に示したように、１％トリロンＸ−１００に加え
た結晶コレステロールのポーラログラフ曲線は血数の場
合とほとんど一致した。ついで、既知の１％トリトンＸ
−１００中結晶コレステロールサンプル（曲線Ａ）およ
びあらかじめ定量した標準皿鮫サンプル（曲線Ｂ）につ
いての希釈曲線を作成した（第４図）。

第４図の〆−ターの読みは、単に、各サンプルの電流ピ
ークにおける非検定電流における読みを、各サンプルの
既知コレステロール含童にたいしてプロツトしたもので
ある。第４図の希釈曲線は１２５−３００倣／１００の
上の間で高い直線性を示している（ｙ＝０．９９９ ０
．９９３）。すなわち、電流の読みはサンプル中のコレ
ステロール舎量と比例し、本方法の有効性が確立された
。人工乳イＱ夜は血酸と完全に同じではないので、ヒト
血嬢コレステロール濃度についてのこの一連の研究では
、上述のＡＡ−０比色法であらかじめ測定した対照血嬢
標品を用いた。一連の標準希釈曲線の作成に際し、感度
が時間とともに次第に、多くの場合わずかながら低下す
る煩向がみられた。

この結果、標準希釈曲線は平行に下方に移動したが、懐
斜および直線性の変動はなかった。正確かつ再現性のあ
る結果を確認するためには、１日に２回以上標準希釈曲
線を作ること、時々未知サンプル中に対照血※を含めて
感度をチェックすることが必要である。保存血験、対照
既知血策を何回も、同一の日にまた別の印こ測定して評
価した。

同一日内の変動係数は総コレステロール合童２３０雌／
私の同一既知対照血数から２０のサンプルを作り、その
コレステロールを測定して計算した。同一日内での変動
係数は１．３％であった。同じく２３０雌／１００Ｍの
既知対照血数からの多数のサンプルについて、コレステ
ロール磁極系の日間再現性を評価した。このプールから
１０日間をおいて２個のサンプルを取り（計２０サンプ
ル）測定した変動係数は１．２％であった。コレステロ
ール電極法の精度を同一サンプルについての上述のＡＡ
−０比色法による結果との比較により評価した。

スクリーニング研究に用いた血酸コレステロール範囲１
２６−斑１のｏ／１００の‘の血糠サンプル１２の固を
用いた。２つの方法で得られた測定値は高い相関性を示
し（ｙ＝０．９１４ ｐ＜０．００１）、比色法および
電極法の平均土ＳＥＭはそれぞれ、１７５±３．３およ
び１磯士２．６の９／１００の【であった。

平均７．０６夕／１００の【の差は、比色法の方が電極
法よりも常に高に値を示し、差の対検定の結果は有意で
あった。（ｐく０．００１）が、両方法の差は４％にす
ぎない。結晶コレステロール乳化液（１０仇ｏ／１００
の【）２５仏そを血数（１１５のｃ／１００の‘）２５
山そに加えた場合の回収率は期待値の９７％であつた。
結合酵素法−本発明の結合酵素法は、第２図のコラーゲ
ン膜１８およびグルタルアルデヒド結合コレステロール
オキシダーゼ（ＣＯ）１９を有するプロ一べ１７を用い
て実施された。

第１図を参照して上述したように、電極上にコラーゲン
膜１７をセットしたのち、この膜を２５％グルタルァル
デヒドのきわめて薄い注意深く覆う。つぎに、結晶ＣＯ
の２０Ｕをグルタミンアルデヒド処理膜の表面に静かに
置き、ついで酵素の上部にグルタミンアルデヒド１滴を
加える。結合酵素電極を３０分間風乾し、第１図のプロ
‐べ５の代りに、キューペット室３に挿入する。膜結合
酵素系を用いる場合は、上述のように血数およびＣＥを
注入し、ＣＯの補給注入は行わない。分析の目的では、
注入後に安定な読みが得られたならば、ＣＯの標準注入
を行って、結合酵素によって与えられる酵素の過剰下に
どれだけの酵素−基質反応性があるかを定量した。第２
図の結合コレステロールオキシダーゼ膜を用いて、血簸
およびコレステロールヱステラーゼを注入した場合も、
直線の標準線（曲線Ｃ）が得られた（第４図）。電位計
の応答は非結合オキシダーゼを注入した場合の約１０分
の１である。膜結合酵素系によれば、予想外に、カタラ
ーゼ、阻害の必要はなく、直接全血を分析できることも
わかった。この場合、酵素層１９の部またはそのすぐそ
ばで起こった酵素反応率（すなわち、比０２生成）は、
陰極で検知され、これが全血中のコレステロール含量を
示す。サンプル室に比０２が拡散してカタラーゼで分解
されるとしても、それ以前に電流の読みは得られている
。上述の全血中コレステロール定量技術を用いて、他の
動物の血糠についても同様に分析できることは、以下の
表ｍに示すとおりである。表ｍ 他の各種液体サンプルの分析結果を表Ｗに示す。

表Ｗ 表ｍおよびＷには、動物血液中および各種液体中の遊離
コレステロールおよびコレステロールェステルの鰭流ピ
ークを示した。

遊離コレステロール対コレステロール含量の比は文献値
とよく一致している。上に述べたように、鯵極は電気的
に絶縁されていて、サンプル室中の電解質が両極間の電
気通路となっている。

電解質としては、たとえば、アルカリまたはアルカリ士
類金属の炭酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、酢酸塩
を含む塩化ナトリウムまたはカリウム緩衝液もしくはそ
の他の有機緩衝液、またはその混合物がある。この種の
電解質の溶媒としては、水、グリコール、グリセリンお
よびその混合物が用いられる。これまで電極としては白
金陰極および銀陽極を挙げたが、これは代表例として示
したもので、他の電極も本発明の実施に際し適宜選択で
きることは、本技術分野においては自明のとおりである
。また、これまで、セロフアンおよびコラーゲン膜の例
のみを示してきたが、被検高分子物質には透過性を示さ
ず、過酸化水素は透過させるこの他の膜も使用できる。
本発明に用いられる膜には特定の限定はない。さらに、
酸素透過性膜としてのシリコン可塑性ゴムも、たとえば
、米国特許第３球弘５５号記載の他の材質に代えること
もできる。以上、本発明の特徴を血液およびその他の液
体中のコレステロール含量の定量を参照しながら詳細に
説明したが、この記述から、本発明は、膜の電極と逆側
で酵素反応して過酸化水素を生成し、これが膜を透過し
てポーラログラフ電極に検知されればよく、他の高分子
物質への応用を含む広い意味をものであることが明らか
であろう。すなわち、本発明の精神および範囲から逸脱
することなく、上述の方法には多くの改変が可能である
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法に用いられるポーラログラフ装
置を図解的に例示したものであり、第２図はその電極部
の酵素固定法における好ましい態様を例示したものであ
り、第３図は、本発明の方法により血数および人工血酸
サンプルを分析した場合の時間経過と電流の関係をプ。 ットした図であり、第４図は、コレステロールオキシダ
ーゼ非結合酵素を用いて既知濃度のコレステロール乳化
液Ａおよびあらかじめ定量した対照肌糠Ｂを分析した場
合のコレステロール濃度と電流の関係、ならびに結合酵
素法を用いて対照血※Ｃを分析した場合の上記関係を示
す。オー図 矛２図 矛３図 オ４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも１種の酵素により変換可能で最終的に過
   酸化水素を産生する物質をポーラログラフにより定量測
   定する方法において、過酸水素に対しては透過性を有す
   るが上記測定物質に対しては透過性を示さない膜の後方
   に位置させた少なくとも１個の過酸化水素感受性電極を
   内蔵しかつ電解質を含有するポーラログラフセルを設け
   、少なくとも１種の酵素を上記物質と酵素反応して過酸
   化水素を発生するように上記膜の上記電極と逆の側のセ
   ル中に置き、過酸化水素の生成量に比例して電流を生ず
   るようにセルに電圧をかけ、上記物質を含有する検体を
   上記膜の上記電極と逆の側に加えて上記酵素反応を起こ
   させ、生成した過酸化水素の少なくとも一部を上記膜内
   に拡散させて電極と接触させ、生成した過酸化水素量の
   凾数として上記セル中を流れる電流すなわち検体中の上
   記物質の量を示す電流を測定することを特徴とする、上
   記方法。 ２ 定量する物質なステロールである、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３ ステロールはコレステロールであり、酵素はコレス
   テロールオキシダーゼである、特許請求の範囲第２項記
   載の方法。 ４ ステロールは３−βヒドロキシステロールであり、
   酵素はコレステロールオキシダーゼである、特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ５ 検体は血漿または血清であり、定量する物質はコレ
   ステロールである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 検体はさらにコレステロールエステルを含有し、コ
   レステロールエステルをコレステロールに変換するため
   コレステロールエステルヒドロラーゼを用いる、特許請
   求の範囲第５項記載の方法。７ 酵素は膜の電極と反対
   側に固定させた、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８ 酵素は膜上に固定した、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ９ 検体は血液である、特許請求の範囲第８項記載の方
   法。 １０ 酵素はコレステロールオキシダーゼ、コレステロ
   ールエステルヒドロラーゼまたはその混合物である、特
   許請求の範囲第７項記載の方法。 １１ 定量する物質は酵素反応により、さらに酵素反応
   を受けて最終的に過酸化水素を産生する基質に変換可能
   なポリサツカライドである、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 １２ ポリサツカライドは酵素反応によつてモノまたは
   ジサツカライドに変換されるデンプンであり、モノまた
   はジサツカライドは少なくとも１種の第２の酵素との酵
   素反応によつて最終的に過酸化水素を産生する、特許請
   求の範囲第１１項記載の方法。 １３ 電極は白金陰極である、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 １４ 銀陽極を用いる、特許請求の範囲第１３項記載の
   方法。 １５ 血中コレステロールを定量する方法において、過
   酸化水素に対しては透過性を有するがコレステロールに
   対しては透過性を示さない膜の後方に位置させた少なく
   とも１種の過酸化水素感受性電極を内蔵するポーラログ
   ラフセルを設け、血液から血漿または血清成分を分離し
   、コレステロールオキシダーゼをコレステロールと酵素
   反応して過酸化水素を発生するように上記膜の上記電極
   と逆側のセル中に入れ、上記酵素反応のための酸素をセ
   ル中に導入し、過酸化水素の生成量に比例して電流を生
   ずるようにセルに電圧をかけ、上記成分の一定量を加え
   て酵素反応を起こさせ、生成した過酸化水素の少なくと
   も一部を上記膜内に拡散させて電極と接触させ、生成し
   た過酸化水素量の凾数として上記セル中を流れる電流す
   なわち上記血液中のコレステロール量を示す電流を測定
   することを特徴とする、上記方法。 １６ 成分はわずかに溶血し、また抗カタラーゼ剤を含
   有する、特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７ 抗カタラーゼ剤はナトリウムアジドである、特許
   請求の範囲第１６項記載の方法。 １８ 成分と酵素反応する酵素としてさらにコレステロ
   ールエステルヒドラーゼも加える、特許請求の範囲第１
   ５項記載の方法。 １９ ポーラログラフセルは過酸化水素感受性白金陰極
   、およびそれに隣接した銀陽極を内蔵する、特許請求の
   範囲第１５項記載の方法。 ２０ 膜はセロフアン膜である、特許請求の範囲第１５
   項記載の方法。 ２１ 酵素は膜の電極と逆の側に固定されている、特許
   請求の範囲第１５項記載の方法。 ２２ 血液中のコレステロールを定量する方法において
   、過酸化水素に対して透過性を有するがコレステロール
   に対しては透過性を示さない膜の後方に位置させた少な
   くとも１種の過酸化水素感受性電極を内蔵するポーラロ
   グラフセルを設け、コレステロールオキシダーゼをコレ
   ステロールと反応して過酸化水素を発生するように上記
   膜の上記電極と逆の側の膜上に固定し、上記酵素反応の
   ための酵素をセル中に導入し、過酸化水素の生成量に比
   例して電流を生ずるようにセルに電圧をかけ、血液の一
   定量を加えて酵素反応を起こさせ、生成した過酸化水素
   の少なくとも一部を上記膜内に拡散させて電極と接触さ
   せ、生成した過酸化水素量に応じて上記セル中に流れる
   電流すなわち上記血液中のコレステロール量を示す電流
   を測定することを特徴とする、上記方法。 ２３ 血液との酵素反応のため、コレステロールエステ
   ルヒドロラーゼをも膜の電極と逆の側に固定させる、特
   許請求の範囲第２２項記載の方法。