JPS5910190B2 - 新規な乳酸オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
新規な乳酸オキシダ−ゼの製造法Info
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- JPS5910190B2 JPS5910190B2 JP53073619A JP7361978A JPS5910190B2 JP S5910190 B2 JPS5910190 B2 JP S5910190B2 JP 53073619 A JP53073619 A JP 53073619A JP 7361978 A JP7361978 A JP 7361978A JP S5910190 B2 JPS5910190 B2 JP S5910190B2
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- lactate oxidase
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- acid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な乳酸オキシダーゼおよびその製造法、な
らびに新規な乳酸オキシダーゼを用いる液体の分析法、
分析用キットに関する。
らびに新規な乳酸オキシダーゼを用いる液体の分析法、
分析用キットに関する。
従来、乳酸を基質としてなる酸化酵素としては、エンザ
イム・ハンドブック第１巻第１１１頁（１９６９年、Ｅ
・バーマン著）に記載されているマイコバクテリウム−
フレイ（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍＰｈｌｅｉ
）またはネイチャー第１７０巻第２０７頁に記載されて
いるマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ Ａｖｉｕｍ ）由来のし−ラクテート：
オキシゲン・オキシドレダクターゼ（Ｌ−Ｌａｃｔａｔ
ｅ ： ｏｘｙｇｅｎ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ
，酵素番号１．ｔ ．３．２）、常用名乳酸オキシダー
ゼ（ Ｌａｃｔａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ ）が最もよく
知られているが、この公知の酵素は次式の反応を触媒す
るもので、またその反応生成物として酢酸、二酸化炭素
および水を生成するものであった。
イム・ハンドブック第１巻第１１１頁（１９６９年、Ｅ
・バーマン著）に記載されているマイコバクテリウム−
フレイ（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍＰｈｌｅｉ
）またはネイチャー第１７０巻第２０７頁に記載されて
いるマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ Ａｖｉｕｍ ）由来のし−ラクテート：
オキシゲン・オキシドレダクターゼ（Ｌ−Ｌａｃｔａｔ
ｅ ： ｏｘｙｇｅｎ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ
，酵素番号１．ｔ ．３．２）、常用名乳酸オキシダー
ゼ（ Ｌａｃｔａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ ）が最もよく
知られているが、この公知の酵素は次式の反応を触媒す
るもので、またその反応生成物として酢酸、二酸化炭素
および水を生成するものであった。
本発明者らは、乳酸に作用してピルビン酸に酸化する過
程において、化学量論的に対応して過酸化水素を生成せ
しめる新規な乳酸オキシダーゼを見い出した。
程において、化学量論的に対応して過酸化水素を生成せ
しめる新規な乳酸オキシダーゼを見い出した。
また本発明の新規な乳酸オキシダーゼが微生物の培養に
よって得られる製造法を確立した。
よって得られる製造法を確立した。
特にこの微生物としては、ペディオコツカス（ ｐｅｄ
ｉｏｃｏｃｃｕａ ）属、ストレプトコツカス（ Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｅｕｓ ）属に属する菌と同定され
、さらにアエロコツカス（ Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ）
属に属する菌も同様に、この新規な乳酸オキシダーゼを
産生ずることを見い出した。
ｉｏｃｏｃｃｕａ ）属、ストレプトコツカス（ Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｅｕｓ ）属に属する菌と同定され
、さらにアエロコツカス（ Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ）
属に属する菌も同様に、この新規な乳酸オキシダーゼを
産生ずることを見い出した。
本発明の新規な酵素、乳酸オキシダーゼは、上記の既知
の酵素とは本質に異なるもので、次に示す基質特異性お
よび酵素作用を有するものである。
の酵素とは本質に異なるもので、次に示す基質特異性お
よび酵素作用を有するものである。
基質特異性：Ｌ一乳酸
酵素作用：反応式ＣＩ，１
で表わされる反応を触媒する作用、
また本酵素は、至適ｐＨが６−７付近であり、至適温度
が３５℃付近、等電点がｐＨ４．６±０．３（キャリア
・アンフオライトを用いる電気泳動法、分子量ｐ： ｓ
ｏ ｏ ｏ ｏ±１ｏｏｏｏの物理的性状を有するも
のであり、さらに本酵素は、その酵素反応において補酵
素の添加を必要とせず、かつＬ −乳酸たる基質を直接
酸素と反応せしめ、１モルのし一乳酸をビルビン酸に酸
化して、１モルの過酸化水素を生成せしめる反応を触媒
するものである。
が３５℃付近、等電点がｐＨ４．６±０．３（キャリア
・アンフオライトを用いる電気泳動法、分子量ｐ： ｓ
ｏ ｏ ｏ ｏ±１ｏｏｏｏの物理的性状を有するも
のであり、さらに本酵素は、その酵素反応において補酵
素の添加を必要とせず、かつＬ −乳酸たる基質を直接
酸素と反応せしめ、１モルのし一乳酸をビルビン酸に酸
化して、１モルの過酸化水素を生成せしめる反応を触媒
するものである。
さらに、本発明において見い出された新規乳酸〕オキシ
ダーゼ生産菌で、ペデイオコツカス属に属すると同定さ
れ、ペディオコツカス・エス・ピー・Ｂ−０６ ６ ７
（ Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｂ−０６ ６７
）と命名され、ストレプトコツカス属に属すると同定
され、ストレプトコツカス・エス・ピー・Ｂ一０ ６
６ ８ （ Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ，
Ｂ − ０ ６ ６ ８ ）と命名された。
ダーゼ生産菌で、ペデイオコツカス属に属すると同定さ
れ、ペディオコツカス・エス・ピー・Ｂ−０６ ６ ７
（ Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｂ−０６ ６７
）と命名され、ストレプトコツカス属に属すると同定
され、ストレプトコツカス・エス・ピー・Ｂ一０ ６
６ ８ （ Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ，
Ｂ − ０ ６ ６ ８ ）と命名された。
これらの菌は静岡県田方郡大仁町の大根畑の土壌から分
離したものであって、この分離した菌１３−０６６７、
およびＢ−０６６８の菌学的性状は次に記載する通りで
ある。
離したものであって、この分離した菌１３−０６６７、
およびＢ−０６６８の菌学的性状は次に記載する通りで
ある。
以上の菌学的性状における、本菌Ｂ−０６６７、３３−
０６６８はダラム陽性球菌で、ヵタラーゼ、オキシダー
矧婆性で、グルコースから発酵的に酸を産生ずるが、糖
（グルコース）からガスを産生じないことなどから、バ
ージース・マニュアル・オプ・デイタミネイティブ・バ
クテリオロジイー（ Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢ ａｃｔｅｒ
ｉｏｒｏｇｙ ）第８版（１９７４）および医学細菌同
定の手引き（坂崎利一訳）により検索すると、ベディオ
コッカス属、ストレプトコッヵス属、が挙られ、さらに
本菌とこれらの属との鑑別にて性状を比較すれば、次の
通りである。
０６６８はダラム陽性球菌で、ヵタラーゼ、オキシダー
矧婆性で、グルコースから発酵的に酸を産生ずるが、糖
（グルコース）からガスを産生じないことなどから、バ
ージース・マニュアル・オプ・デイタミネイティブ・バ
クテリオロジイー（ Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢ ａｃｔｅｒ
ｉｏｒｏｇｙ ）第８版（１９７４）および医学細菌同
定の手引き（坂崎利一訳）により検索すると、ベディオ
コッカス属、ストレプトコッヵス属、が挙られ、さらに
本菌とこれらの属との鑑別にて性状を比較すれば、次の
通りである。
？って、本菌Ｂ−０６６７についてみれば、ペディオコ
ッカス属またはストレプトコッカス属に属するものと認
められ、さらにその諸性状について医学細菌の同定の手
引き、ジャーナル・オブ・ジエネラル・ミクロバイオロ
ジイー（ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌＯｇｙ） ２ ６ ． １８ ５〜１９
７（１９６１）にて対比すればペディオコッカス．ウリ
ナーエクイ（ Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａ−
ｅｑｕｉ）とよ《一致するが、バージース・マニュアル
・オブ・デイタミネイティブ・バクテリオロジイー第８
版（１９７４）におけるペデイオコツカス・ウリナーエ
クイの性状とは若干違っているため、本菌Ｂ−０６６７
をペデイオコツカス属に属する菌と同定し、ペデイオコ
ツカス・エス・ピーＢ−０ ６ ６ ７ （Ｐｅｄｉｏ
ｃｃｃｕｓ ｓｐ．Ｂ−０ ６ ６７ ）と命名した。
ッカス属またはストレプトコッカス属に属するものと認
められ、さらにその諸性状について医学細菌の同定の手
引き、ジャーナル・オブ・ジエネラル・ミクロバイオロ
ジイー（ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌＯｇｙ） ２ ６ ． １８ ５〜１９
７（１９６１）にて対比すればペディオコッカス．ウリ
ナーエクイ（ Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａ−
ｅｑｕｉ）とよ《一致するが、バージース・マニュアル
・オブ・デイタミネイティブ・バクテリオロジイー第８
版（１９７４）におけるペデイオコツカス・ウリナーエ
クイの性状とは若干違っているため、本菌Ｂ−０６６７
をペデイオコツカス属に属する菌と同定し、ペデイオコ
ツカス・エス・ピーＢ−０ ６ ６ ７ （Ｐｅｄｉｏ
ｃｃｃｕｓ ｓｐ．Ｂ−０ ６ ６７ ）と命名した。
さらに本菌Ｂ−０６６８についてみれば、その性状より
ペデイオコッカス属よりストＬ／７”トコツカス属に属
する菌と同定されるもので、さらに医学細菌同定の手引
きにて対比すればストレプトコツカス・ファエシウム・
ハリエタス・ドランス（ Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｆａｅｃｉｕｍ ｖａｒ， ｄｕｒａｎｓ ）とよ
く似ているが、バージース・マニュアル・オプ・デイタ
ミネイティブ・バクテリオロジイー第８版（１９７４）
ではストレプトコッヵス・ファエシウム・バリエタス・
ドランスの記載がないため詳細な対比が行なえなかった
ため、よって本菌Ｂ−０ ６６ ８ （ Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｂ−０６ ６８）と命名した。
ペデイオコッカス属よりストＬ／７”トコツカス属に属
する菌と同定されるもので、さらに医学細菌同定の手引
きにて対比すればストレプトコツカス・ファエシウム・
ハリエタス・ドランス（ Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｆａｅｃｉｕｍ ｖａｒ， ｄｕｒａｎｓ ）とよ
く似ているが、バージース・マニュアル・オプ・デイタ
ミネイティブ・バクテリオロジイー第８版（１９７４）
ではストレプトコッヵス・ファエシウム・バリエタス・
ドランスの記載がないため詳細な対比が行なえなかった
ため、よって本菌Ｂ−０ ６６ ８ （ Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｂ−０６ ６８）と命名した。
さらに、このペディオコッカス・エス・ピー・Ｂ−０６
６７，およびストレプトコツ？ス・エス・ピー・Ｂ−０
６６８は、各々、工業技術院微生物工業技術研究所に微
生物保管委託申請書受理番号票（微生物受託番号通知書
微生物受託番号「微工研菌寄第４４３８号 ＦＥＲＭ
一ＰＡ４４３８、微生物受託番号「微工研菌寄第４４３
９号、ＦＥＲＭ−Ｐ，％４ ４ ３ ９Ｊ ）として寄
託申請したものである。
６７，およびストレプトコツ？ス・エス・ピー・Ｂ−０
６６８は、各々、工業技術院微生物工業技術研究所に微
生物保管委託申請書受理番号票（微生物受託番号通知書
微生物受託番号「微工研菌寄第４４３８号 ＦＥＲＭ
一ＰＡ４４３８、微生物受託番号「微工研菌寄第４４３
９号、ＦＥＲＭ−Ｐ，％４ ４ ３ ９Ｊ ）として寄
託申請したものである。
さらに、本発明における新規な乳酸オキシダーゼ生産菌
として、アエロコッカス属に属するアエロコツカス・ビ
リダンス（ Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ
）ＩＦＱｌ２２１９およびアエロコッカス・ビリダンス
ＩＦＱＩ ２３１ ７をも見い出したものである。
として、アエロコッカス属に属するアエロコツカス・ビ
リダンス（ Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ
）ＩＦＱｌ２２１９およびアエロコッカス・ビリダンス
ＩＦＱＩ ２３１ ７をも見い出したものである。
本発明は上記の知見に基℃・て完成されたもので、少な
くとも、Ｌ一乳酸に対し基質特異性を有し、かつ反応式
ＣＩ） Ｌ−乳酸＋０→ヒルヒン酸＋Ｈ２ｏ２ 〔Ｉ〕で表わ
される反応を触媒する酵素作用を有する乳酸オキシダー
ゼを生産する乳酸オキシダーゼ生産菌を培地に培養し、
培養物から該乳酸オキシダーゼを採取することを特徴と
する新規な乳酸オキシダーゼの製造法である。
くとも、Ｌ一乳酸に対し基質特異性を有し、かつ反応式
ＣＩ） Ｌ−乳酸＋０→ヒルヒン酸＋Ｈ２ｏ２ 〔Ｉ〕で表わ
される反応を触媒する酵素作用を有する乳酸オキシダー
ゼを生産する乳酸オキシダーゼ生産菌を培地に培養し、
培養物から該乳酸オキシダーゼを採取することを特徴と
する新規な乳酸オキシダーゼの製造法である。
本発明における該乳酸オキシダーゼ生産菌としては、例
えばペデイオコッカス・エス・ピー・Ｂ−０６６７，ス
トレプトコツカス・エス・ピー・Ｂ−０６６８、７エロ
コッカス・ビリタンスＩＦＯ１２２１９、７エロコツカ
ス・ヒリダンスＩＦ９１２３１７などが挙げられ、さら
に本菌に限らず本発明の新規な乳酸オキシダーゼを生産
する菌はすべて本発明において使用することができる。
えばペデイオコッカス・エス・ピー・Ｂ−０６６７，ス
トレプトコツカス・エス・ピー・Ｂ−０６６８、７エロ
コッカス・ビリタンスＩＦＯ１２２１９、７エロコツカ
ス・ヒリダンスＩＦ９１２３１７などが挙げられ、さら
に本菌に限らず本発明の新規な乳酸オキシダーゼを生産
する菌はすべて本発明において使用することができる。
本発明を実施するに当っては、該乳酸オキシダーゼ生産
菌を、酵素を生成する通常の方法で培養する。
菌を、酵素を生成する通常の方法で培養する。
培養の形態は通常液体培養で行なうのが有利である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広《使用され得る。
ものが広《使用され得る。
炭素源としては同化可能な炭素化合物であればよ《、例
えばグルコース、シュウクロース、ラクトース、マルト
ース、フラクトース、糖密などが使用される。
えばグルコース、シュウクロース、ラクトース、マルト
ース、フラクトース、糖密などが使用される。
窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例
えばペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、
大豆粉、・カゼイン加水分解物などが用いられる。
えばペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、
大豆粉、・カゼイン加水分解物などが用いられる。
その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カ
ルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛
などの塩類が必要に応じて使用される。
ルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛
などの塩類が必要に応じて使用される。
培養温度は菌が発育し、該乳酸オキシダーゼを生産する
範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは２５〜３７℃程
度がよく、また培養時間は条件によって異なるが、乳酸
オキシダーゼが最適収量に達する時期を見計って適当な
時期に培養を終了すればよく、通常１０〜４０時間程度
である。
範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは２５〜３７℃程
度がよく、また培養時間は条件によって異なるが、乳酸
オキシダーゼが最適収量に達する時期を見計って適当な
時期に培養を終了すればよく、通常１０〜４０時間程度
である。
次いで、このようにして得られた培養物から乳酸オキシ
ダーゼを採取するのであるが、本酵素は主として菌体内
に存在する。
ダーゼを採取するのであるが、本酵素は主として菌体内
に存在する。
本酵素を採取するには、まず得られた培養物を沢過また
は遠心分離などの手段によりその菌体を採取し、次いで
この菌体を種々の機械的方法、またはリゾチームなどの
酵素的方法にて破壊し、また必要に応じてエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やトリトンＸ−１ ０ ０ （
Ｔｒｉｔ■ Ｘ−１ ０ ０二商品名）、アデカトー
ル Ｓｏ−１２０（商品名）などの界面活性剤を添加し
て本酵素を可溶化して分離、採取する。
は遠心分離などの手段によりその菌体を採取し、次いで
この菌体を種々の機械的方法、またはリゾチームなどの
酵素的方法にて破壊し、また必要に応じてエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やトリトンＸ−１ ０ ０ （
Ｔｒｉｔ■ Ｘ−１ ０ ０二商品名）、アデカトー
ル Ｓｏ−１２０（商品名）などの界面活性剤を添加し
て本酵素を可溶化して分離、採取する。
さらにこのようにして得られた乳酸オキシダーゼ含有溶
液は濃縮する力ゝ・またヲマ濃縮することな《可溶性塩
類、例えば硫安などを用いて塩析せしめるか、親水性有
機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン、イ
ソプロパノールなどの添加により本酵素を沈澱せしめれ
ばよい。
液は濃縮する力ゝ・またヲマ濃縮することな《可溶性塩
類、例えば硫安などを用いて塩析せしめるか、親水性有
機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン、イ
ソプロパノールなどの添加により本酵素を沈澱せしめれ
ばよい。
次いで、この沈澱物は水または緩衝液に溶解し、半透膜
にて透析せしめて低分子量の不純物を除去することがで
きる。
にて透析せしめて低分子量の不純物を除去することがで
きる。
また、′吸着剤あるいはゲル沢過剤などによるクロマト
夛ラフイー法により乳酸オキシダーゼを精製する。
夛ラフイー法により乳酸オキシダーゼを精製する。
さらにこれらの手段により得られた酵素溶液は減圧濃縮
、限外ｆ過膜濃縮、さらに凍結乾燥などの処理により精
製された乳酸オキシダーゼを得る。
、限外ｆ過膜濃縮、さらに凍結乾燥などの処理により精
製された乳酸オキシダーゼを得る。
次に本発明の乳酸オキシダーゼの力価の測定法、性質な
どについて述べる。
どについて述べる。
■ 力価の測定法
０．２Ｍジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ ｐＨ
６．５ ） ０．２ｍｌ１０．５ ｍＭＬ一乳酸ｏ．
ｌｍｌ，０． ２ Ｗ／Ｖ％Ｎ，Ｎ−ジ） チル７＝
Ｉ） ン０． ２ｍｌ、０．２Ｗ／Ｖ％４−アミノア
ンチピリン０．ｔｍ，４５ＴＪ／ｍｌパーオキシダーゼ
（ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ：シグマ社製、９０Ｕ／■
）溶液０．１ｒｒＬｌ、蒸留水９．３ｍｌよりなる反応
液１．０ｒＩＬｌに、本発明の乳酸オキシダーゼ溶液１
０μｌを加え、３７℃、１０分間反応させた後、これに
１％（Ｗ／Ｖ）カチオンＦＢ−５００（商品名：日本油
脂社製、界面活性剤）０．５ｍＡ加えて反応を停止し、
さらに１．５ｍｌの蒸留水を加える。
６．５ ） ０．２ｍｌ１０．５ ｍＭＬ一乳酸ｏ．
ｌｍｌ，０． ２ Ｗ／Ｖ％Ｎ，Ｎ−ジ） チル７＝
Ｉ） ン０． ２ｍｌ、０．２Ｗ／Ｖ％４−アミノア
ンチピリン０．ｔｍ，４５ＴＪ／ｍｌパーオキシダーゼ
（ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ：シグマ社製、９０Ｕ／■
）溶液０．１ｒｒＬｌ、蒸留水９．３ｍｌよりなる反応
液１．０ｒＩＬｌに、本発明の乳酸オキシダーゼ溶液１
０μｌを加え、３７℃、１０分間反応させた後、これに
１％（Ｗ／Ｖ）カチオンＦＢ−５００（商品名：日本油
脂社製、界面活性剤）０．５ｍＡ加えて反応を停止し、
さらに１．５ｍｌの蒸留水を加える。
比色定量は５６５ｎ７７Ｌにて行ない、酵素活性は１分
間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生ずる活性を１単位（
１ ｕｎｉｔ， Ｉ Ｕ， ）とする。
間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生ずる活性を１単位（
１ ｕｎｉｔ， Ｉ Ｕ， ）とする。
また力価の算出は次式に従う。
酵素活性（ Ｕ．／ｌｌｌｌ） ＝ （ △Ａ５６，／
＝ ） ｘ １５．５（なお、△Ａ５６，は波長５ ６
５ ｎｍにおける１分当りの吸光度変化を示す） ■基質特異性 上記の力価の測定法における反応液中の乳酸の代りに、
下記の種々の物質を用いて乳酸オキシダーゼの基質特異
性を検討した。
＝ ） ｘ １５．５（なお、△Ａ５６，は波長５ ６
５ ｎｍにおける１分当りの吸光度変化を示す） ■基質特異性 上記の力価の測定法における反応液中の乳酸の代りに、
下記の種々の物質を用いて乳酸オキシダーゼの基質特異
性を検討した。
その結果を、乳酸に対する相対活性で示す。
物質（基質） 相対活性（％）
Ｌ一乳酸 １００Ｄ一乳酸
θピルビン酸
ＯＤ．Ｌ一α−アラニン
Ｏ コハク酸 Ｏマレイン
酸 Ｏ物質（基質）
相対活性（％） Ｌ−アスコルビン酸 ＯＤ．Ｌ−セ
リン ０ジハイドロオキシアセト
ン ２．７Ｄ．Ｌ−グリセリン酸
Ｏ上記の結束より、本酵素は少なくともＬ一乳
酸に対し非常に高い特異性を示すものと認められる。
θピルビン酸
ＯＤ．Ｌ一α−アラニン
Ｏ コハク酸 Ｏマレイン
酸 Ｏ物質（基質）
相対活性（％） Ｌ−アスコルビン酸 ＯＤ．Ｌ−セ
リン ０ジハイドロオキシアセト
ン ２．７Ｄ．Ｌ−グリセリン酸
Ｏ上記の結束より、本酵素は少なくともＬ一乳
酸に対し非常に高い特異性を示すものと認められる。
■酵素作用
Ｌ一乳酸を酸化してピルビン酸となし、その際に１分子
の酸素の消費と１分子の過酸化水素の生成を伴う反応を
触媒する。
の酸素の消費と１分子の過酸化水素の生成を伴う反応を
触媒する。
■至適ｐＨ
４ ０ ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４−５．５）、４０ｍＭ
ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４−８）、
４０ｍＭリン酸緩衝液（ ｐＨ ６．３ −８）、４０
ｍＭ｝リスー塩酸緩衝液（ ｐＨ ７−９）および４０
ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９−１０）を用いて、本発明
の乳酸オキシダーゼの乳酸に対する酵素活性を測定した
結果、第１図に示す通りであって、その至適ｐＨは６−
７付近と認められる。
ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４−８）、
４０ｍＭリン酸緩衝液（ ｐＨ ６．３ −８）、４０
ｍＭ｝リスー塩酸緩衝液（ ｐＨ ７−９）および４０
ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９−１０）を用いて、本発明
の乳酸オキシダーゼの乳酸に対する酵素活性を測定した
結果、第１図に示す通りであって、その至適ｐＨは６−
７付近と認められる。
■ 至適温度
上記の力価の測定法を利用して、その温度条件を変えて
酵素反応を行い、乳酸オキシダーゼの乳酸に対する酵素
活性を測定した結果、第２図に示す通りであって、その
至適温度は３５℃付近と認められる。
酵素反応を行い、乳酸オキシダーゼの乳酸に対する酵素
活性を測定した結果、第２図に示す通りであって、その
至適温度は３５℃付近と認められる。
■ 等電点
ｐＨ４．６±０．３（キャリア・アンフォライトを用い
る電気泳動法により測定） ■ 分子量 ｓｏｏｏｏ±１００００［セファデックスＧ−４５０（
商品名：ファルマシア社製）によるゲルｒ過法にて測定
］、 ４００００±５０００１ＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動法にて測定（また上記のデーターから、本酵素は２
量体からなるものと推定される）〕 ９００００±１００００（セファデックスＧ−２００（
商品名：ファルマシア社製）によるゲル沢過法にて測定
〕 ■ ｐＨ安定註 ０．１Ｍジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ ｐＨ
４ −７ ）、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．７
−８）、０．１Ｍ｝リスー塩酸緩衝液（ ｐＨ７−９）
０．１ｍｌに、乳酸オキシダーゼ（ ５ ｔｔｆ蛋白）
を溶解し、５０℃で１０分間処理した後水冷する。
る電気泳動法により測定） ■ 分子量 ｓｏｏｏｏ±１００００［セファデックスＧ−４５０（
商品名：ファルマシア社製）によるゲルｒ過法にて測定
］、 ４００００±５０００１ＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動法にて測定（また上記のデーターから、本酵素は２
量体からなるものと推定される）〕 ９００００±１００００（セファデックスＧ−２００（
商品名：ファルマシア社製）によるゲル沢過法にて測定
〕 ■ ｐＨ安定註 ０．１Ｍジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ ｐＨ
４ −７ ）、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．７
−８）、０．１Ｍ｝リスー塩酸緩衝液（ ｐＨ７−９）
０．１ｍｌに、乳酸オキシダーゼ（ ５ ｔｔｆ蛋白）
を溶解し、５０℃で１０分間処理した後水冷する。
次いでこの処理液１０μｌを分取し、上記の力価の測定
法に従って乳酸オキシダーゼの乳酸に対する酵素活性を
１１１２した。
法に従って乳酸オキシダーゼの乳酸に対する酵素活性を
１１１２した。
その結果は第３図に示す通りであって、そのｐＨ安定性
はｐＨ ６． ８ − ＆５付近と認められる。
はｐＨ ６． ８ − ＆５付近と認められる。
■ 熱安定性
乳酸オキシダーゼ（酵素蛋白５μｆ？）を含有してなる
０．１Ｍリン酸緩衝液（１）Ｈ７．Ｏ）０．１一を、θ
〜８０℃の各温度で１０分間処理し、その後水冷し、そ
の１０μｌを用い、上記の力価の測定法に従って乳酸オ
キシダーゼの乳酸に対する酵素活性（残存活性）を測定
した結果、第４図に示す通りであって、その熱安定性に
おいて本酵素は４０℃付近以下では安定であり、それ以
上の温度で番鳩、速に低下するものと認められる。
０．１Ｍリン酸緩衝液（１）Ｈ７．Ｏ）０．１一を、θ
〜８０℃の各温度で１０分間処理し、その後水冷し、そ
の１０μｌを用い、上記の力価の測定法に従って乳酸オ
キシダーゼの乳酸に対する酵素活性（残存活性）を測定
した結果、第４図に示す通りであって、その熱安定性に
おいて本酵素は４０℃付近以下では安定であり、それ以
上の温度で番鳩、速に低下するものと認められる。
［相］種々の物質の影響
上記の力価の測定法において、種々の添加物を加えて乳
酸オキシダーゼの乳酸に対する酵素活性を測定した結果
は次の通りである。
酸オキシダーゼの乳酸に対する酵素活性を測定した結果
は次の通りである。
なお、添加物の内、金属塩およびＥＤＴＡの添加濃度は
１０ｍＭ、界面活性剤は０．１％（Ｗ／Ｖ）、ｐ−クロ
ロマーキュリーベンゾエイト（ＰＣＭＢ）は０．０５ｍ
Ｍ，フラビンアデノシンジヌクレオタイド（ＦＡＤ）は
１０μＭ、フラビンモノヌクレオタイド（ＦＭＮ）およ
びリボフラビンは０．１ｍＭである。
１０ｍＭ、界面活性剤は０．１％（Ｗ／Ｖ）、ｐ−クロ
ロマーキュリーベンゾエイト（ＰＣＭＢ）は０．０５ｍ
Ｍ，フラビンアデノシンジヌクレオタイド（ＦＡＤ）は
１０μＭ、フラビンモノヌクレオタイド（ＦＭＮ）およ
びリボフラビンは０．１ｍＭである。
添 加 物 相対活性（％）
無添加 ｉ ｏ ｏ． ｏＭ
１１Ｃ１２９７．４ ＭｇＣｌ２ １０１．７ＣａＣ
ｌ２ １ ０ ５．５ＣｏＣ
ｌ２ ９５．７ＬｉＣｌ
９５．３ＦｅＣｌ３
８．１２ＥＤＴＡ
９８．ＯＰＣＭＢ
８９．７ＦＡＤ
１０１．３ＦＭＮ ９
４．０リボフラビン ９６．４
ラウリルベンゼンスルホン酸ナ ２ｌ．５トリウム ドデシル硫酸ナトリウム １．８アデカト
ールＳＯ−１２０（商 １０２．８品名） トリトンＸ−１００（商品名） １０７．２ブリッ
ジ−３５（商品名） ９８−２セチルテトラ
アンモニウムブロ １０．８マイド カチオンＦＢ−５００（商品名）３．７ カチオンＤＴ−２０５（商品名） ８＆６０ 電気
泳動 ポリアクリルアミドゲル（ ｐＨ ７．５ ） ，泳動
用緩衝液としてトリスーバルビタール緩衝液（ｐＨ７．
１５）を用い、ゲル当り４ｍＡの定電流でポリアクリル
アミドディスク電気泳動を行なった。
１１Ｃ１２９７．４ ＭｇＣｌ２ １０１．７ＣａＣ
ｌ２ １ ０ ５．５ＣｏＣ
ｌ２ ９５．７ＬｉＣｌ
９５．３ＦｅＣｌ３
８．１２ＥＤＴＡ
９８．ＯＰＣＭＢ
８９．７ＦＡＤ
１０１．３ＦＭＮ ９
４．０リボフラビン ９６．４
ラウリルベンゼンスルホン酸ナ ２ｌ．５トリウム ドデシル硫酸ナトリウム １．８アデカト
ールＳＯ−１２０（商 １０２．８品名） トリトンＸ−１００（商品名） １０７．２ブリッ
ジ−３５（商品名） ９８−２セチルテトラ
アンモニウムブロ １０．８マイド カチオンＦＢ−５００（商品名）３．７ カチオンＤＴ−２０５（商品名） ８＆６０ 電気
泳動 ポリアクリルアミドゲル（ ｐＨ ７．５ ） ，泳動
用緩衝液としてトリスーバルビタール緩衝液（ｐＨ７．
１５）を用い、ゲル当り４ｍＡの定電流でポリアクリル
アミドディスク電気泳動を行なった。
本発明の乳酸オキシダーゼを電気泳動せしめ、泳動後の
ゲルをアミドプラツクにて染？した結果、第５図に示す
通りであって、濃青色の単一の染色帯が認められた。
ゲルをアミドプラツクにて染？した結果、第５図に示す
通りであって、濃青色の単一の染色帯が認められた。
このことより、本発明の乳酸オキシダーゼま単一の蛋白
質であると認められた。
質であると認められた。
＠ 作用機序の確認試験
ＤＬ−乳酸またはＬ一乳酸な０−０．４
μｍｏｌｅ ，ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（
ｐＨ ６．５ ） ４ ０ μｍｏｌｅ ， ４−ア
ミノアンチピリン３００μ？、Ｎ−Ｎ−ジメチルアニリ
ン２００μグ、パーオキシダーゼ４．５ ［Ｊ，、乳酸
オキシダーゼ２Ｕ， （ ２ ０ ０Ｕ．／■）を含有
する反応液１．ｍ７！を３７℃、１０分間反応せしめ、
その後これに０． ５ ｍｌのＩＷ／Ｖ％のカチオンＦ
１３−５００（商品名）水溶液および１．５ｍｌノ蒸留
水を加えて、次いでこの呈色を５ ６５ ｎｍの波長に
て吸光度を測定した。
ｐＨ ６．５ ） ４ ０ μｍｏｌｅ ， ４−ア
ミノアンチピリン３００μ？、Ｎ−Ｎ−ジメチルアニリ
ン２００μグ、パーオキシダーゼ４．５ ［Ｊ，、乳酸
オキシダーゼ２Ｕ， （ ２ ０ ０Ｕ．／■）を含有
する反応液１．ｍ７！を３７℃、１０分間反応せしめ、
その後これに０． ５ ｍｌのＩＷ／Ｖ％のカチオンＦ
１３−５００（商品名）水溶液および１．５ｍｌノ蒸留
水を加えて、次いでこの呈色を５ ６５ ｎｍの波長に
て吸光度を測定した。
また、乳酸の代りに一定量の過酸化水素を加えて、同様
に行なって検量線を求めた。
に行なって検量線を求めた。
その結果、第６図に示す通りであって、図中、ω→は基
質としてＬ一乳酸、■は基質としてＤＬ−乳酸を用いた
場合の測定結果を示し、←は基質の代りに過酸化水素を
用いてなる検量線を示すものであり、この結果より本酵
素はＬ７乳酸１モルより過酸化水素１モルを生成する反
応を触媒することが確認された。
質としてＬ一乳酸、■は基質としてＤＬ−乳酸を用いた
場合の測定結果を示し、←は基質の代りに過酸化水素を
用いてなる検量線を示すものであり、この結果より本酵
素はＬ７乳酸１モルより過酸化水素１モルを生成する反
応を触媒することが確認された。
さらに、上記溶液に、酸素電極（ＹＳＩ溶存酸素計）を
用いて酸素の消費量を測定した結果、Ｌ一乳酸１モルが
酸化されるとき１モルの酸素が消費されることが確認さ
れた。
用いて酸素の消費量を測定した結果、Ｌ一乳酸１モルが
酸化されるとき１モルの酸素が消費されることが確認さ
れた。
さらにまた、生成したピルビン酸の確認を、次の方法に
て行なった。
て行なった。
ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液４０μｍｏｌｅ，
カタラーゼ４００Ａ？、Ｌ一乳酸またはＤＬ一乳酸０
− ０． ５ ｔｔ ｍｏｌｅ ，乳酸オキシダーゼ２
［Ｊ，を含有する反応液１．ｍｌを、３７℃、１０分間
反応せしめた後、沸騰水浴中で５分間処理して反応を停
止せしめ、さらに水冷後、１ ０ ｍＭＮＡＤＨ２ｏ．
１ｍｌおよび蒸留水１．９１１Ｌｌを加え、さらに変性
した蛋白質を遠心分離して除去し、その上清液２．５１
ｒＬｌを石英セルに分取し、３７℃に予備加温した後、
２０Ｕ．乳酸脱水素酵素（牛肝臓由来、ペーリンガー・
マンハイム社製）溶液５１ｒＬｌを添加し、３７℃、５
分間反応せしめ、その後３４０Ｈｍの波長にて吸光度を
４１１定した。
カタラーゼ４００Ａ？、Ｌ一乳酸またはＤＬ一乳酸０
− ０． ５ ｔｔ ｍｏｌｅ ，乳酸オキシダーゼ２
［Ｊ，を含有する反応液１．ｍｌを、３７℃、１０分間
反応せしめた後、沸騰水浴中で５分間処理して反応を停
止せしめ、さらに水冷後、１ ０ ｍＭＮＡＤＨ２ｏ．
１ｍｌおよび蒸留水１．９１１Ｌｌを加え、さらに変性
した蛋白質を遠心分離して除去し、その上清液２．５１
ｒＬｌを石英セルに分取し、３７℃に予備加温した後、
２０Ｕ．乳酸脱水素酵素（牛肝臓由来、ペーリンガー・
マンハイム社製）溶液５１ｒＬｌを添加し、３７℃、５
分間反応せしめ、その後３４０Ｈｍの波長にて吸光度を
４１１定した。
なお、上記反応において、Ｌ一乳酸の代りに一定量のピ
ルビン酸を加えて同様に行なって検量線を求めた。
ルビン酸を加えて同様に行なって検量線を求めた。
その結果、第７図に示す通りであって、図中、ｃ−ｏは
基質としてＬ一乳酸、−ＪはＤＩ，一乳酸を用いた測定
結果を示し、→は基質の代りにピルビン酸を用いた検量
線を示すものであって、さらに上記反応液１． ０ｍｌ
を用いて３７℃、１０分間反応を行った後、生成したα
−ケト酸を２・４−ジニトロフエニルヒドラジンによる
ヒドラジド法により測定した結果、Ｌ一乳酸１モルに対
し１モルのα−ケト酸力唖じたことが確認され、以上の
結果より、本酵素はＬ一乳酸のみに作用し、Ｌ一乳酸１
モル当り１モルのピルビン酸を１モルの過酸化水素を生
成し、かつこの反応において１モルの酸素を消費する反
応を触媒することを確認した。
基質としてＬ一乳酸、−ＪはＤＩ，一乳酸を用いた測定
結果を示し、→は基質の代りにピルビン酸を用いた検量
線を示すものであって、さらに上記反応液１． ０ｍｌ
を用いて３７℃、１０分間反応を行った後、生成したα
−ケト酸を２・４−ジニトロフエニルヒドラジンによる
ヒドラジド法により測定した結果、Ｌ一乳酸１モルに対
し１モルのα−ケト酸力唖じたことが確認され、以上の
結果より、本酵素はＬ一乳酸のみに作用し、Ｌ一乳酸１
モル当り１モルのピルビン酸を１モルの過酸化水素を生
成し、かつこの反応において１モルの酸素を消費する反
応を触媒することを確認した。
また本酵素のＬ一乳酸に対するＫｍ値は約０． ７ｍＭ
であった。
であった。
以上の通り、本発明の乳酸オキシダーゼはＬ−乳酸に作
用し一ｍ化せしめる際、補酵素の添加を必要とせず、直
接水素と反応せしめ、ピルビΔ唆に酸化せしめ、過酸化
水素を生成せしめるものであり、またその等電点がｐＨ
４．６、その分子量が９００００±ｉｏｏｏｏであるこ
となどの理化学的性質より、公知の乳酸オキシダーゼと
異なるものと認められ、本発明の酵素、乳酸オキシダー
ゼは新規な酵素と認められた。
用し一ｍ化せしめる際、補酵素の添加を必要とせず、直
接水素と反応せしめ、ピルビΔ唆に酸化せしめ、過酸化
水素を生成せしめるものであり、またその等電点がｐＨ
４．６、その分子量が９００００±ｉｏｏｏｏであるこ
となどの理化学的性質より、公知の乳酸オキシダーゼと
異なるものと認められ、本発明の酵素、乳酸オキシダー
ゼは新規な酵素と認められた。
さらにまた、上記の本酵素の作用機序の確認試験に使用
した、生成する過酸化水素、ピルビン酸、消費される酸
素の定量手段はその一例であるが、Ｌ一乳酸を含有する
液体に、本発明の新規な乳酸オキシダーゼを作用せしめ
、その酵素反応によって生成する過酸化水素、ピルビン
酸、消費される酸素を測定してなるＬ一乳酸の新規な分
析法、および分析用キットを見い出した。
した、生成する過酸化水素、ピルビン酸、消費される酸
素の定量手段はその一例であるが、Ｌ一乳酸を含有する
液体に、本発明の新規な乳酸オキシダーゼを作用せしめ
、その酵素反応によって生成する過酸化水素、ピルビン
酸、消費される酸素を測定してなるＬ一乳酸の新規な分
析法、および分析用キットを見い出した。
さらにこのＬ−乳酸９新規な分析法および分析用キット
は、乳酸の試薬の純度測定、血清中の乳酸の定量分析、
乳酸の誘導体を分解せしめて乳酸を遊離する乳酸誘導体
ｆ量、反応生成物として乳酸を生成する酵素の活性測定
などの種々の分析法、分析用キットとしてなし得ること
を見い出した。
は、乳酸の試薬の純度測定、血清中の乳酸の定量分析、
乳酸の誘導体を分解せしめて乳酸を遊離する乳酸誘導体
ｆ量、反応生成物として乳酸を生成する酵素の活性測定
などの種々の分析法、分析用キットとしてなし得ること
を見い出した。
即ち、本発明は乳酸を含有する液体に、乳酸オキシダー
ゼを作用せしめ、次いで生成する過酸化水素、ビルビン
酸、または消費される酸素を測定することを特徴とする
液体の分析法、および少なくとも、乳酸オキシダーゼを
含有する系からなることを特徴とする液体の分析用キッ
トである。
ゼを作用せしめ、次いで生成する過酸化水素、ビルビン
酸、または消費される酸素を測定することを特徴とする
液体の分析法、および少なくとも、乳酸オキシダーゼを
含有する系からなることを特徴とする液体の分析用キッ
トである。
本発明における乳酸を含有する液体としては、本発明の
新規な乳酸オキシダーゼの基質としての乳酸を含有して
なるものであれば何んら限定されるものではなく、例え
ば乳酸試料、乳酸カルシウム、乳酸鉄などの乳酸塩医薬
品、血清、乳酸菌（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｉａｎｔａｒｕｍ，Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉ
ｎｄｎｅｒｉなど）の乳酸発酵物、その他ピルビン酸試
料にラクテートデヒドロゲナーゼを作用せしめた後の生
成する乳酸を対象とするピルビン酸試料中のピルビン酸
定量のための組合せ、ラクテートデヒドロゲナーゼ試料
にピルビン酸を作用せしめた後の生成する乳酸を対象と
するラクテートデヒドロゲナーセ試料中のラクテートデ
ヒドロゲナーゼ活性または定量測定のだめの組合せ、な
どの水性媒体、好ましくはｐＨ ６ − ７程度の緩衝
液が挙げられる。
新規な乳酸オキシダーゼの基質としての乳酸を含有して
なるものであれば何んら限定されるものではなく、例え
ば乳酸試料、乳酸カルシウム、乳酸鉄などの乳酸塩医薬
品、血清、乳酸菌（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｉａｎｔａｒｕｍ，Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉ
ｎｄｎｅｒｉなど）の乳酸発酵物、その他ピルビン酸試
料にラクテートデヒドロゲナーゼを作用せしめた後の生
成する乳酸を対象とするピルビン酸試料中のピルビン酸
定量のための組合せ、ラクテートデヒドロゲナーゼ試料
にピルビン酸を作用せしめた後の生成する乳酸を対象と
するラクテートデヒドロゲナーセ試料中のラクテートデ
ヒドロゲナーゼ活性または定量測定のだめの組合せ、な
どの水性媒体、好ましくはｐＨ ６ − ７程度の緩衝
液が挙げられる。
さらに使用される乳酸オキシダーゼは、上記した通りの
本発明Ｑ新規な酵素であって、その使用量としては、乳
酸を含有する液体中の乳酸−ｆｆｌ化するに充分な量で
あればよく、通常２Ｕ，程度使用すればよく、さらに本
酵素を単独または緩衝液に溶解したものでもよ《、さら
にこれらを凍結乾燥せしめたものでもよい。
本発明Ｑ新規な酵素であって、その使用量としては、乳
酸を含有する液体中の乳酸−ｆｆｌ化するに充分な量で
あればよく、通常２Ｕ，程度使用すればよく、さらに本
酵素を単独または緩衝液に溶解したものでもよ《、さら
にこれらを凍結乾燥せしめたものでもよい。
また本酵素はその酵素活性を劣化せしめない状態にて、
マイクロカプセル化手段、有機または無機担体などとの
共有結合手段、吸着手段などの酵素の固定化手段を施し
たものを用いてもよい。
マイクロカプセル化手段、有機または無機担体などとの
共有結合手段、吸着手段などの酵素の固定化手段を施し
たものを用いてもよい。
このようにして、該液体に本発明の乳酸オキシダーゼを
作用せしめ、一定時間インキュベートせしめるのである
が、その反応時間、反応温度としては酵素が充分に反応
せしめる程度であればよ《、通常５〜３０分程度で、３
５〜３７℃程度で行なわれ、その結果、該液体中に過酸
化水素、ピルビン酸が生成され、対応した酸素の減少を
生じるもので、次いでこれらの過酸化水素、ピルビΔ浚
、酵素を測定するものである。
作用せしめ、一定時間インキュベートせしめるのである
が、その反応時間、反応温度としては酵素が充分に反応
せしめる程度であればよ《、通常５〜３０分程度で、３
５〜３７℃程度で行なわれ、その結果、該液体中に過酸
化水素、ピルビン酸が生成され、対応した酸素の減少を
生じるもので、次いでこれらの過酸化水素、ピルビΔ浚
、酵素を測定するものである。
酸素の測定においては、上記した通り、酸素電極を用い
る方法が最も簡便であり、ピルビン酸の測定においては
、上記した通り、ラクテートデヒドロゲナーゼなどを用
いる方法やヒドラゾン法が使用でき、さらにピルビン酸
を基質とする酵素、例えばピルビン酸オキシダーゼを、
ピルビン酸オキシダーゼ（１５０Ｕ／ ＴＬｌ） ２
０ ｔｔｌ１１ ０ ｍＭチアミンピ口フオスフェート
２ ０ ｔｔＬ １ ｍＭＦＡＤ１ ０ μｉ，
１ ０ｍＭＭｎｃ １２ ５ ０ ｔｔ ７３，パーオ
キシダーゼ（４５Ｕ ／ｔｒＬｌ ） ０． Ｉ ＴＩ
Ｌｌ， ０． ２％Ｎ−Ｎ−ジメチルアニリン０．２Ｔ
Ｌｌ，０．３％４−アミノアンチピリン０，ｌｒｕｌ１
０．ＩＭり４塩緩衝液（ ｐＨ ７．５ ） ０． １
ｍｌ（７）反応液組成として用いる方法などが挙られる
。
る方法が最も簡便であり、ピルビン酸の測定においては
、上記した通り、ラクテートデヒドロゲナーゼなどを用
いる方法やヒドラゾン法が使用でき、さらにピルビン酸
を基質とする酵素、例えばピルビン酸オキシダーゼを、
ピルビン酸オキシダーゼ（１５０Ｕ／ ＴＬｌ） ２
０ ｔｔｌ１１ ０ ｍＭチアミンピ口フオスフェート
２ ０ ｔｔＬ １ ｍＭＦＡＤ１ ０ μｉ，
１ ０ｍＭＭｎｃ １２ ５ ０ ｔｔ ７３，パーオ
キシダーゼ（４５Ｕ ／ｔｒＬｌ ） ０． Ｉ ＴＩ
Ｌｌ， ０． ２％Ｎ−Ｎ−ジメチルアニリン０．２Ｔ
Ｌｌ，０．３％４−アミノアンチピリン０，ｌｒｕｌ１
０．ＩＭり４塩緩衝液（ ｐＨ ７．５ ） ０． １
ｍｌ（７）反応液組成として用いる方法などが挙られる
。
また過酸化水素の測定としては、過酸化水素電極を用い
る方法や過酸化水素と反応してその色調に変化を生ずる
１種もし《は２種以上の呈色剤からなるシステムによっ
て比色測定する方法が挙られる。
る方法や過酸化水素と反応してその色調に変化を生ずる
１種もし《は２種以上の呈色剤からなるシステムによっ
て比色測定する方法が挙られる。
またこの呈色剤としては、例えば生成する過酸化水素と
反応して安定した赤色を形成する４価のチタン化合物と
キシレノールオ，レンジによる反応、あるいはフェノー
ルあるいはＮ−Ｎ−ジメチルアニリン、４−アミノアン
チピリンおよびパーオキシダーゼによる反応を利用する
方法などが挙られる。
反応して安定した赤色を形成する４価のチタン化合物と
キシレノールオ，レンジによる反応、あるいはフェノー
ルあるいはＮ−Ｎ−ジメチルアニリン、４−アミノアン
チピリンおよびパーオキシダーゼによる反応を利用する
方法などが挙られる。
さらにこのフェノール、４−アミノアンチビリンおよび
パーオキシダーゼによる反応においては、フェノールあ
るいはＮ−Ｎ−ジメチルアニリンは全液量に対し０．０
０５〜０．０５％程度使用すればよ《、４−アミノアン
チピリンは生成する過酸化水素量に対して１モル以上、
好ましくは２モル以上、さらにパーオキシダーゼは１［
Ｊ，以上使用すればよく、このように調整された呈色剤
は必要に応じて、本発明の乳酸オキシダーゼとともに調
整してもよく、さらに調整においてＰＣＭＢを０．０１
〜１７７１Ｍ程度添加してもよく、次いでその結果にお
いて呈色せしめた色調を適当な波長にて測定してその検
量線より過酸化水素を定量すればよい。
パーオキシダーゼによる反応においては、フェノールあ
るいはＮ−Ｎ−ジメチルアニリンは全液量に対し０．０
０５〜０．０５％程度使用すればよ《、４−アミノアン
チピリンは生成する過酸化水素量に対して１モル以上、
好ましくは２モル以上、さらにパーオキシダーゼは１［
Ｊ，以上使用すればよく、このように調整された呈色剤
は必要に応じて、本発明の乳酸オキシダーゼとともに調
整してもよく、さらに調整においてＰＣＭＢを０．０１
〜１７７１Ｍ程度添加してもよく、次いでその結果にお
いて呈色せしめた色調を適当な波長にて測定してその検
量線より過酸化水素を定量すればよい。
特に人血清に対してＰＣＭＨの使用はその呈色を安定化
せしめるものである。
せしめるものである。
以上の通りに、調整された、本発明の新規な乳酸オキシ
ダーゼを使用してなる分析法、分析用キットは、その生
成する過酸化水素、ピルビン酸または消費される酸素を
測定することによって、例えば生体成分、例えば血清中
の乳酸の定量測定、乳酸試薬の乳酸純度試験、種々乳酸
塩を用いた医薬品中の乳酸の定量測定、乳酸発酵におけ
る乳酸の定量測定、乳酸を生成する酵素の酵素測定やそ
れに対応する酵素の基質の定量測定や乳酸を基質とする
酵素などの酵素活性浜淀などの種々の分析に使用される
有用なものである。
ダーゼを使用してなる分析法、分析用キットは、その生
成する過酸化水素、ピルビン酸または消費される酸素を
測定することによって、例えば生体成分、例えば血清中
の乳酸の定量測定、乳酸試薬の乳酸純度試験、種々乳酸
塩を用いた医薬品中の乳酸の定量測定、乳酸発酵におけ
る乳酸の定量測定、乳酸を生成する酵素の酵素測定やそ
れに対応する酵素の基質の定量測定や乳酸を基質とする
酵素などの酵素活性浜淀などの種々の分析に使用される
有用なものである。
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発
明は何んら実施例によって限定されるものではない。
明は何んら実施例によって限定されるものではない。
実施例 １
グルコース２Ｗ／ｖ％、ペットｙｌＷ／Ｖ％、酵母エキ
ス０．５Ｗ／ｖ％、食塩０．２Ｗ／Ｖ％、リン酸第一カ
リウム０．１Ｗ／Ｖ％、リン醇第二カリウム０．１Ｗ／
Ｖ％、髄酸マグネシウム・７水塩０．０５Ｗ／Ｖ％およ
び炭酸カルシウム９．３Ｗ／Ｖ％を含有する培地（ ｐ
Ｈ ７．０ ） １０ ０ｒａｌを５００１ｎｌ容三角
フラスコに分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した後
、ペデイオコツカス．エス・ピー・Ｂ−０６６７、スト
レプトコツカス・エス・ピー・３３−０６６８、７エロ
コツカス・ビリタンス・ＩＦＯ−１２２１９、７エロコ
ツカス・ビリダンス・ＩＦＯ−１２３１７の各々の菌株
を接種し、各々３０℃、１５時間、３００回転／分の条
件下振盪培養し、培養終了後、培養物を遠心分離して菌
体を回収し、１０７７１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８．０
）にて洗浄後、再び遠心分離して菌体を回収した。
ス０．５Ｗ／ｖ％、食塩０．２Ｗ／Ｖ％、リン酸第一カ
リウム０．１Ｗ／Ｖ％、リン醇第二カリウム０．１Ｗ／
Ｖ％、髄酸マグネシウム・７水塩０．０５Ｗ／Ｖ％およ
び炭酸カルシウム９．３Ｗ／Ｖ％を含有する培地（ ｐ
Ｈ ７．０ ） １０ ０ｒａｌを５００１ｎｌ容三角
フラスコに分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した後
、ペデイオコツカス．エス・ピー・Ｂ−０６６７、スト
レプトコツカス・エス・ピー・３３−０６６８、７エロ
コツカス・ビリタンス・ＩＦＯ−１２２１９、７エロコ
ツカス・ビリダンス・ＩＦＯ−１２３１７の各々の菌株
を接種し、各々３０℃、１５時間、３００回転／分の条
件下振盪培養し、培養終了後、培養物を遠心分離して菌
体を回収し、１０７７１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８．０
）にて洗浄後、再び遠心分離して菌体を回収した。
次いでこの得られた菌体を０．０２Ｗ／Ｖ％リゾチーム
（長瀬産業株式会社製、塩酸リゾチーム）および０．１
Ｗ／Ｖ％トリトンＸ一１００を含有する１ ０ ７ＦＬ
Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ８）１０１ｒＬｌに添加して、３
７℃で３０分間リゾチームを作用せしめた後、遠心分離
にて、乳酸オキシダーゼを含有する土清液を得た。
（長瀬産業株式会社製、塩酸リゾチーム）および０．１
Ｗ／Ｖ％トリトンＸ一１００を含有する１ ０ ７ＦＬ
Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ８）１０１ｒＬｌに添加して、３
７℃で３０分間リゾチームを作用せしめた後、遠心分離
にて、乳酸オキシダーゼを含有する土清液を得た。
この上清液中の酵素活性は各々次表に示す通りであった
。
。
菌 株 酵素活性（（Ｊ／ｍｌ・培養液）Ｂ−０６
６７ ９．２４Ｂ−０６６８
０．３１ＩＦＯ−１２２１９ ０
．４２ＩＦＯ−１２３１７ ０．４３実施例
２ 実施例１と同一の組成を有する培地２０Ｊを３０Ｊ容ジ
ャー・ファンメーターに加え、これに０．１Ｗ／Ｖ％に
なる様にデイスフオームＢＣ−５１Ｙ（消泡剤、商品名
二日本油脂株式会社製）を添加し、加熱滅菌した後、こ
れに実施例１と同様の方法で予備培養したべデイオコツ
カス・エス・ピーＢ−０６６７の培養液２０ｏ１ｒＬｌ
を移植し、３０℃にて、１５時間培養し、培養後、この
培養物を遠心分離して菌体（約４００Ｐ）を回収し、こ
れを４ｌのリゾチーム液〔リゾチーム８００ＷＩｇ、ト
リトンＸ−１００４ｆＩ％ＥＤＴＡ３ｙ，ＩＭリン酸緩
衝液（ ｐＨ８ ）４０ｍｌ含有〕に浮遊せしめ、３７
℃で６０分藺攪拌し、菌体な破壊する。
６７ ９．２４Ｂ−０６６８
０．３１ＩＦＯ−１２２１９ ０
．４２ＩＦＯ−１２３１７ ０．４３実施例
２ 実施例１と同一の組成を有する培地２０Ｊを３０Ｊ容ジ
ャー・ファンメーターに加え、これに０．１Ｗ／Ｖ％に
なる様にデイスフオームＢＣ−５１Ｙ（消泡剤、商品名
二日本油脂株式会社製）を添加し、加熱滅菌した後、こ
れに実施例１と同様の方法で予備培養したべデイオコツ
カス・エス・ピーＢ−０６６７の培養液２０ｏ１ｒＬｌ
を移植し、３０℃にて、１５時間培養し、培養後、この
培養物を遠心分離して菌体（約４００Ｐ）を回収し、こ
れを４ｌのリゾチーム液〔リゾチーム８００ＷＩｇ、ト
リトンＸ−１００４ｆＩ％ＥＤＴＡ３ｙ，ＩＭリン酸緩
衝液（ ｐＨ８ ）４０ｍｌ含有〕に浮遊せしめ、３７
℃で６０分藺攪拌し、菌体な破壊する。
次いで得られた溶液を遠心分離して、その上清液３．７
Ｊ（５２００Ｕ）を得た。
Ｊ（５２００Ｕ）を得た。
この上清液にアセトン１． ４ ８ ，ｇを加盈て析出
する不純物を遠心分離にて除去し、その上清液にアセト
ンを加えてアセトン濃度を６５％とし、次いで５０００
ｒｐｍＩＯ分間遠心分離して沈澱物を回収し、これを４
００Ｎの１ ０ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液（ ｐＨ ７
）に溶解し不溶物を遠心分離して除去した。
する不純物を遠心分離にて除去し、その上清液にアセト
ンを加えてアセトン濃度を６５％とし、次いで５０００
ｒｐｍＩＯ分間遠心分離して沈澱物を回収し、これを４
００Ｎの１ ０ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液（ ｐＨ ７
）に溶解し不溶物を遠心分離して除去した。
次いでこれに４７０ｍｌの飽和硫安溶液を加えて、２０
分間攪拌した後、１ ２ ０ ０ ０ ｒｐｍにて１０
分間遠心分離を行い、得られた沈澱物を１００ｍｌの１
０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ ｐＨ ７ ）に溶解し、これ
を透析膜により、ｌＯｍＭリン酸緩衝液に対して１夜透
析し脱塩した後，ｐＨ７．０で緩衝化したＤＥＡＥ−セ
ルロースカラム（ ２．６ ｘ５ ０ｃｍ）に通して酵
素を吸着せしめ、さらに０．１〜０．６ＭのＫＣＩのイ
オン強度勾配を有する溶出液を用いて溶出せしめた。
分間攪拌した後、１ ２ ０ ０ ０ ｒｐｍにて１０
分間遠心分離を行い、得られた沈澱物を１００ｍｌの１
０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ ｐＨ ７ ）に溶解し、これ
を透析膜により、ｌＯｍＭリン酸緩衝液に対して１夜透
析し脱塩した後，ｐＨ７．０で緩衝化したＤＥＡＥ−セ
ルロースカラム（ ２．６ ｘ５ ０ｃｍ）に通して酵
素を吸着せしめ、さらに０．１〜０．６ＭのＫＣＩのイ
オン強度勾配を有する溶出液を用いて溶出せしめた。
約０．５ＭＫＣＩ濃度での溶出画分を回収して、酵素活
性画分１４０ｄを得た。
性画分１４０ｄを得た。
さらにこの活性画分に８５ｍｌの飽和硫安溶液を加え、
生じた沈澱物を遠心分離にて除去し、得られた上清画分
にさらに１４５ＴｒＬｌの飽和硫安溶液を加え生じた沈
澱を遠心分離にて回収する。
生じた沈澱物を遠心分離にて除去し、得られた上清画分
にさらに１４５ＴｒＬｌの飽和硫安溶液を加え生じた沈
澱を遠心分離にて回収する。
この沈澱を５０ｒｒＬｌの１０７ＦＬＭリン酊緩衝液（
ｐＨ ７．０ ）に溶解し、透析膜による透析により
脱塩した後、１ ０ ｍＭ＋）ン酸緩衝液で緩衝化した
ＤＥＡＥ−セファデツクスＡ−５０カラム（ ２． ６
Ｘ ５ ０ｃｎ）に通して酵素を吸着せしめた後、０．
２〜０．６ＭＫＣＩ のイオン強度勾配を用いて溶出せ
しめた。
ｐＨ ７．０ ）に溶解し、透析膜による透析により
脱塩した後、１ ０ ｍＭ＋）ン酸緩衝液で緩衝化した
ＤＥＡＥ−セファデツクスＡ−５０カラム（ ２． ６
Ｘ ５ ０ｃｎ）に通して酵素を吸着せしめた後、０．
２〜０．６ＭＫＣＩ のイオン強度勾配を用いて溶出せ
しめた。
約０． ５ ＭＫＣ Ｉ で溶出した両分（１６０１７
１Ａ’）を回収した。
１Ａ’）を回収した。
この活性画分を透析膜による透析により脱塩した後、凍
結乾燥した。
結乾燥した。
得られた凍結乾燥物を５−の１０ｍＭＩＪン酸緩衝液（
ｐｎ ７．０ ）、０．１ＭＫＣｌ よりなる溶液
に溶解せしめた後、セファデツクスＧ−１５０（商品名
）を用いたカラムクロマトグラフイーな行い（カラム径
２．５ Ｘ ７ ３ｃＩｒＬ，流速８ｒｕｌ ／ｍｉｎ
， １フラクション５．２１ｎｌ）、そのフラクショ
ンＩ６２７−３５の活性画分を回収し、透析膜による透
析により脱塩し、凍結乾燥した。
ｐｎ ７．０ ）、０．１ＭＫＣｌ よりなる溶液
に溶解せしめた後、セファデツクスＧ−１５０（商品名
）を用いたカラムクロマトグラフイーな行い（カラム径
２．５ Ｘ ７ ３ｃＩｒＬ，流速８ｒｕｌ ／ｍｉｎ
， １フラクション５．２１ｎｌ）、そのフラクショ
ンＩ６２７−３５の活性画分を回収し、透析膜による透
析により脱塩し、凍結乾燥した。
この凍結乾燥吻は先の電気泳動の結果において述べた通
り、唯一の蛋白帯を示すものであった。
り、唯一の蛋白帯を示すものであった。
なお、各工程における採取された全蛋白質量、全活性、
比活性は、次に示す通りである。
比活性は、次に示す通りである。
全蛋白質量 全活性 比 活性菌体抽出液
３４ｏ４０ １１４９ ５２０
０Ｕ ０．０２８Ｕ／ｍｐ蛋白アセトン沈澱
３６５２ ■ ４７８０Ｕ
１．３１ ’［Ｊ／〜硫安沈澱
２３７８ 〜 ４５９０１１ １．９３ ［
Ｊ／■ＤＥＡＥセルロース ６６３ 〜
３６７２Ｕ ５．８０ Ｕ／ＩＩｌ９硫安
沈澱 １６３ 〜 ３２５３Ｕ
１９，９ Ｕ／〜ＤＥＡＥ−セファデツクス
４．４７〜 ２６６７Ｕ ５９．７
Ｕ／〜Ａ−５０ セファデックスＧ−１５０ １３．０７７Ｖ
２６１４Ｕ ２００ Ｕ／ｒＩＩ９実施例
３ （Ｌ一乳酸の定量） 反応液組成 ０．２Ｍジメチルグルタル酸− ０．２１１Ｌｌ
ＮａＯＨ緩衝液 パーオキシダーゼ（４５Ｕ〜） ０．１ｍ／０．３
Ｗ／Ｖ％４−アミノ７／チ０．１１ｎｌピリン ０．２Ｗ／Ｖ％Ｎ−Ｎ−ジメチル ０．２１Ｌｌアニ
リン ５ｍＭＬ一乳酸または５ｍＭ Ｏ〜８０μｌＤＬ一乳
酸 蒸留水を加えて全量を１．０ｄにする。
３４ｏ４０ １１４９ ５２０
０Ｕ ０．０２８Ｕ／ｍｐ蛋白アセトン沈澱
３６５２ ■ ４７８０Ｕ
１．３１ ’［Ｊ／〜硫安沈澱
２３７８ 〜 ４５９０１１ １．９３ ［
Ｊ／■ＤＥＡＥセルロース ６６３ 〜
３６７２Ｕ ５．８０ Ｕ／ＩＩｌ９硫安
沈澱 １６３ 〜 ３２５３Ｕ
１９，９ Ｕ／〜ＤＥＡＥ−セファデツクス
４．４７〜 ２６６７Ｕ ５９．７
Ｕ／〜Ａ−５０ セファデックスＧ−１５０ １３．０７７Ｖ
２６１４Ｕ ２００ Ｕ／ｒＩＩ９実施例
３ （Ｌ一乳酸の定量） 反応液組成 ０．２Ｍジメチルグルタル酸− ０．２１１Ｌｌ
ＮａＯＨ緩衝液 パーオキシダーゼ（４５Ｕ〜） ０．１ｍ／０．３
Ｗ／Ｖ％４−アミノ７／チ０．１１ｎｌピリン ０．２Ｗ／Ｖ％Ｎ−Ｎ−ジメチル ０．２１Ｌｌアニ
リン ５ｍＭＬ一乳酸または５ｍＭ Ｏ〜８０μｌＤＬ一乳
酸 蒸留水を加えて全量を１．０ｄにする。
上記反応液ＬＯｍｌにＬ一乳酸オキシダーゼ溶液（１０
０Ｕ／ｍｌ）２０μｌを添加し、３７℃で２０分間反応
した後、０．５ｍｌのｌｗ／Ｖ％カチオンＦＢ−５００
＜商品名）を加え、さらに１．５ｍｌの蒸留水を添加し
た後、５６５ｎ７７Ｌにて比色測定した結果は先の過酸
化水素の検量線から算出されるＬ一乳酸の量と反応液に
添加したし一乳酸の量がよ《一致した。
０Ｕ／ｍｌ）２０μｌを添加し、３７℃で２０分間反応
した後、０．５ｍｌのｌｗ／Ｖ％カチオンＦＢ−５００
＜商品名）を加え、さらに１．５ｍｌの蒸留水を添加し
た後、５６５ｎ７７Ｌにて比色測定した結果は先の過酸
化水素の検量線から算出されるＬ一乳酸の量と反応液に
添加したし一乳酸の量がよ《一致した。
実施例 ４
０．１Ｍジメチルグルタル酸−ＮａＯＨｉ暖 １０１
ＩＬｌ衝液 パーオキシダーゼ（４５［Ｊ／ｍｌ） ５一
０．３Ｗ／Ｖ％４−アミノアンチピリ ５１ｒＬ
ｌン 乳酸オキシダーゼ（ １ ０ ０［Ｊ／ｙｄ）
ｌｍｌシヨ糖 ２０
〜の組成を有する溶液を、−４０〜−５０’Ｃ、０．０
１〜０．０ ５ ｉ＋ｔＨｇにて３時間凍結乾燥して、
５０１７１／用分析用キツ｝（Ａ）を得た。
ＩＬｌ衝液 パーオキシダーゼ（４５［Ｊ／ｍｌ） ５一
０．３Ｗ／Ｖ％４−アミノアンチピリ ５１ｒＬ
ｌン 乳酸オキシダーゼ（ １ ０ ０［Ｊ／ｙｄ）
ｌｍｌシヨ糖 ２０
〜の組成を有する溶液を、−４０〜−５０’Ｃ、０．０
１〜０．０ ５ ｉ＋ｔＨｇにて３時間凍結乾燥して、
５０１７１／用分析用キツ｝（Ａ）を得た。
また分析用キツ｝（Ａ）に対し、添付液として８μｍｏ
ｌｅＰＣＭＢ含有０．２Ｗ／Ｖ％Ｎ−Ｎ−ジメチルアニ
リン水溶液５ｍｌを付した。
ｌｅＰＣＭＢ含有０．２Ｗ／Ｖ％Ｎ−Ｎ−ジメチルアニ
リン水溶液５ｍｌを付した。
まず、この分析用キツ｝（Ａ）に添付液全量を添加した
後、これに蒸留水を加えて５０．０７７１／に調整し、
得られた溶液を１回１．０一として使用する，実施例
５ 実施例４の如くして得られた乳酸分析用の調整液各々１
． ｏ ｍｌを分取した。
後、これに蒸留水を加えて５０．０７７１／に調整し、
得られた溶液を１回１．０一として使用する，実施例
５ 実施例４の如くして得られた乳酸分析用の調整液各々１
． ｏ ｍｌを分取した。
また、この分析用の調整液に、対象として５ｍＭＤＬ一
乳酸０〜１００μｌを用い、また過酸化水素の検量線と
して２．５ｍＭＯ〜１００μｌを用い、さらに人血清Ｏ
〜１００μｌおよび人血清５０ｔｔｌに５７７１ＭＤＬ
−乳酸Ｏ〜１００μｌを用いて各々添加し、３７℃、２
０分間反応し、次いで０．５ｍ／のＩＷ／Ｖ％カチオン
Ｆｌ３−５００（商品名）を加え、さらに１．５ｒＩＬ
ｌの蒸留水を添加した後、５６５ｎ７７Ｌにて比色測定
した。
乳酸０〜１００μｌを用い、また過酸化水素の検量線と
して２．５ｍＭＯ〜１００μｌを用い、さらに人血清Ｏ
〜１００μｌおよび人血清５０ｔｔｌに５７７１ＭＤＬ
−乳酸Ｏ〜１００μｌを用いて各々添加し、３７℃、２
０分間反応し、次いで０．５ｍ／のＩＷ／Ｖ％カチオン
Ｆｌ３−５００（商品名）を加え、さらに１．５ｒＩＬ
ｌの蒸留水を添加した後、５６５ｎ７７Ｌにて比色測定
した。
その結果、第８図に示す通りで、図中、ト→はＤＬ−乳
酸を用いる対象を示し、Ｈは過酸化水素を用いる検量線
を示し、Ｍは人血清を用いる血清中乳酸量を示す測定過
酸化水素量を示し、▲一＾は人血清にＤＬ一乳酸を添加
したときの測定値を示すものであって、図中より、人血
清中乳酸は著し《良好に測定されるものであり、かつ血
清添加による乳酸の測定においても良好に測定し得たも
のであった。
酸を用いる対象を示し、Ｈは過酸化水素を用いる検量線
を示し、Ｍは人血清を用いる血清中乳酸量を示す測定過
酸化水素量を示し、▲一＾は人血清にＤＬ一乳酸を添加
したときの測定値を示すものであって、図中より、人血
清中乳酸は著し《良好に測定されるものであり、かつ血
清添加による乳酸の測定においても良好に測定し得たも
のであった。
第１図は本発明の乳酸オキシダーゼの至適ｐＨを示す曲
線であり、第２図は本発明の乳酸オキシダーゼの至適温
度を示す曲線であり、第３図は本発明の乳酸オキシダー
ゼの声安定性を示す曲線であり、第４図は本発明の乳酸
オキシダーゼの熱安定性を示す曲線であり、第５図は本
発明の乳酸オキシダーゼの電気泳動図を示すものであり
、第６図は本発明の乳酸オキシダーゼの過酸化水素生成
の作用機序の確認試験における過酸化水素の測定図を示
し、図中Ｈは基質としてＬ一乳酸を用いた場合を示し、
Ｈは基質としてＤＬ一乳酸を用いた場合を示し、酔植は
基質の代りに過酸化水素を用いてなる検量線を示すもの
であり、第Ｔ図は本発明の乳酸オキシダーゼのピルビン
酸生成の作用機序の確認試験におけるピルビ濠の測定図
を示し、図中倶→は基質としてＬ一乳酸を用いた場合を
示し、１→は基質としてＤＬ一乳酸を用いた場合を示し
、ト４は基質の代りにピルビン酸を用いてなる検量線を
示すものであり、第８図は血清を用いる乳酸測定を示す
もので、図中、ＨはＤＬ一乳酸を用いた場合を示し、日
は過酸化水素を用いた場合を示し、経見は人血清を用い
てなる測定図を示し、１４は人血清とＤＬ一乳酸を用い
てなる測定図を示す。
線であり、第２図は本発明の乳酸オキシダーゼの至適温
度を示す曲線であり、第３図は本発明の乳酸オキシダー
ゼの声安定性を示す曲線であり、第４図は本発明の乳酸
オキシダーゼの熱安定性を示す曲線であり、第５図は本
発明の乳酸オキシダーゼの電気泳動図を示すものであり
、第６図は本発明の乳酸オキシダーゼの過酸化水素生成
の作用機序の確認試験における過酸化水素の測定図を示
し、図中Ｈは基質としてＬ一乳酸を用いた場合を示し、
Ｈは基質としてＤＬ一乳酸を用いた場合を示し、酔植は
基質の代りに過酸化水素を用いてなる検量線を示すもの
であり、第Ｔ図は本発明の乳酸オキシダーゼのピルビン
酸生成の作用機序の確認試験におけるピルビ濠の測定図
を示し、図中倶→は基質としてＬ一乳酸を用いた場合を
示し、１→は基質としてＤＬ一乳酸を用いた場合を示し
、ト４は基質の代りにピルビン酸を用いてなる検量線を
示すものであり、第８図は血清を用いる乳酸測定を示す
もので、図中、ＨはＤＬ一乳酸を用いた場合を示し、日
は過酸化水素を用いた場合を示し、経見は人血清を用い
てなる測定図を示し、１４は人血清とＤＬ一乳酸を用い
てなる測定図を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも、下記の基質特異性、酵素作用、至適ｐ
Ｈ、至適温度、安定ｐｎ、熱安定性、等電点、分子量の
性質を有してなる新規な乳酸オキシダーゼ 基質特異性：Ｌ一乳酸 酵素作用：反応式ＣＩ） Ｌ一乳酸＋ｏ２→ピルビン酸＋Ｈ２０２ （ ｉ
）で表わされる反応を触媒する作用 至適ｐＨ：ｐＨ６−７付近 至適温度：３５℃付近 ｐＨ安定性： ｐＨ ６．８ − ３，５付近で安定熱
安定性：４０℃付近まで安定 等電点： ｐＨ ４．６±０．３（キャリア・アンフォ
ラィトを用いる電気泳動法） 分子量：８００００±１００００． ２ ペディ蓉コツカス属、ストレプトコッヵス属または
アエ コッカス属に属する、少なくとも、Ｌ一乳酸に対
して基質特異性を有し、かつ反応式〔■〕 Ｌ一乳酸十Ｏ → ピルビン酸＋Ｈ２０２ＣＩ，１２ で表わされる反応を触媒する酵素作用を有する乳酸オキ
シグ一七を生産する乳酸オキシダーゼ生産菌を培地に培
養し、培養物から該乳酸オキシダーゼを採取することを
特徴とする新規な乳酸オキシダーゼの製造法。 ３ 至適ｐＨが６−７付近、至適温度が３５℃付近、ｐ
Ｈ ６．８−８．５付近にｐＨ安定性を示し、４０℃付
近まで安定で、等電点がｐＨ４．６±０．３（キャリア
・アンフオライトを用いる電気泳動法）、分子量が８０
０００±１００００である性質を有してなる乳酸オキシ
ダーゼである特許請求の範囲第２項記載の新規な乳酸オ
キダーゼの製造法。 ４ ペデイオコッカス属に属する乳酸オキシダーゼ生産
菌がペデイオコッカス・エス・ピー・Ｂ−０６６７であ
る特許請求の範囲第２項記載の新規な乳酸オキシタニゼ
の製造法。 ５ ストレプトコッヵス属に属する乳酸オキシダーゼ生
産菌がストレプトコッヵス・エス・ピー・Ｂ−０６６８
である特許請求の範囲第２項記載の新規な乳酸オキシダ
ーゼの製造法。 ６ アエロコッカス属に属する乳酸オキシダーゼ生産菌
カアエロコッカス・ビリタンスＩＦＯ１２２１９または
アエロコッカス・ピリダンスＩＦＯ １ ２ ３ １
７である。 特許謂求の範囲第２項記載の新規な乳酸オキシダーゼの
製造法。 ？ 乳酸を含有する液体に少なくともＬ一乳酸に対して
基質特異性を有し、かつ反応式ＣＩ，ＩＬ一乳酸＋０２
→ピルビン酸＋Ｈ２０２ （ Ｉ ，１で表わされ
る反応を触媒する酵素反応を有し、至適ｐＨが６−７付
近、至適温度が３５℃付近、等電点がｐＨ ４．６±０
．３（キャリア・アンフオライトを用いる電気泳動法）
、分子量ｓｏｏｏｏ±１００００の性債な有する乳酸オ
キシダーゼを作用せしめ、次いで生成する過酸化水素、
ピルビン酸、または消費される酸素を測定することを特
徴とする液体の分析法。 ８ 少なくともし一乳酸に対して基質特異性を有し、か
つ反応式ＣＩ） Ｌ一乳酸＋０→ビルビン酸＋Ｈ２０２ （ Ｉ ）
で表わされる反応を触媒する酵素反応を有し、至適ｐＨ
が６−７付近、至適温度が３５℃付近、等電点カｐＨ４
．６±０．３（キャリア・アンフオライトを用いる電気
泳動法）、分子量ｓｏｏｏｏ±ｉｏｏｏｏの性質を有す
る乳酸オキシダーゼを含有する系からなることを特徴と
する液体の分析用キット。 ９ 少ケ《とも、乳酸オキシダーゼと過酸化水素Ｑ生成
量を測定するに使用する呈色剤との組合せからなる特許
請求の範囲第８項記載の液体の分析用キット。 １０過酸化水素の生成量を測定するに使用する呈色剤が
、少なくとも４−アミノアンチピリン、Ｎ・Ｎ−ジメテ
ルアニリン、パーオキシダーゼからなる組成を有してな
る特許請求の範囲第９項記載の液体の分析用キット。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53073619A JPS5910190B2 (ja) | 1978-06-17 | 1978-06-17 | 新規な乳酸オキシダ−ゼの製造法 |
| GB7920724A GB2025426B (en) | 1978-06-17 | 1979-06-14 | Lactateoxidase |
| GB8009090A GB2042722B (en) | 1978-06-17 | 1979-06-14 | Determination of lactic acid |
| CA329,879A CA1130739A (en) | 1978-06-17 | 1979-06-15 | Lactate oxidase, process for manufacture thereof and analytical method and kit for the use of the same |
| FR7915374A FR2428648B1 (ja) | 1978-06-17 | 1979-06-15 | |
| DE19792954503 DE2954503A1 (ja) | 1978-06-17 | 1979-06-18 | |
| US06/049,560 US4237222A (en) | 1978-06-17 | 1979-06-18 | Lactate oxidase process for the manufacture thereof and analytical method and kit for the use of the same |
| DE2924470A DE2924470C2 (de) | 1978-06-17 | 1979-06-18 | Lactatoxidase und ihre Herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP53073619A JPS5910190B2 (ja) | 1978-06-17 | 1978-06-17 | 新規な乳酸オキシダ−ゼの製造法 |
Related Child Applications (1)
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Publications (2)
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Family Applications (1)
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