JPS5840465B2 - ピルビン酸オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ピルビン酸オキシダーゼ ※ 〈（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ ）の製造法に
関する。

ピルビン酸オキシダーゼは、ピルビン酸、リン酸および
酸素からアセチルリン酸、二酸ｆヒ炭素および過酸ｆヒ
水素を生ずる反応を触媒するものであって、ラクトバチ
ルス・デルプリツキイ（Ｌａｃｔ。

ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｉｉｃｋｉｉ ）に存在
することが報告されているにすぎない。

本発明者らは、静岡県田方郡大仁町の大根畑の土壌から
分離したペディオコッカス （Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ）属に属する菌と同定され
たＢ２Ｏ３３、ストレプトコッカス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ）属に属する菌と同定されたＢ−０６６
８がその培養物中にピルビン酸オキシダーゼを生産する
ことを見い出し、さらにアエロコツカス・ビリダンス（
Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ ） Ｉ Ｆ
Ｏ１２２１９およびＩＦＯ−１２３１７が同様にピル
ビン酸オキシダーゼを生産することを見い出した。

また、上記の分離した菌株Ｂ−０６６７、およびＢ−０
６６８の菌学的性状は次に記載する通りである。

以上の菌学的性状における、車両Ｂ−０６６７、Ｂ−０
６６８はグラム陽性球菌で、カタラーゼ、オキシダー明
雲性で、グルコースから発酵的に酸を産生ずるが、糖（
グルコース）からガスを産生じないことなどから、バー
シース・マニュアル・オブ・デイタミネイテイフ・バク
テリオロジイー※Ｋ （Ｂ ｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｎａ
ｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍ ｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒ
ｉｏｒｏｇｙ ）第８版（１９７４）および医学細菌同
定の手引き（坂崎利−訳）により検索すると、ペディオ
コッカス属、ストレプトコツカス属、が挙られ、さらに
車両とこれらの属との鑑別にて性状を比較すれば、次の
通りである。

従って、車両Ｂ−０６６７についてみれば、ペディオコ
ッカス属またはストレプトコツカス属に属するものと認
められ、さらにその諸性状について医学細菌の同定の手
引き、ジャーナル・オブ・ジュネラル・ミクロバイオロ
ジイー（Ｊ ｏｕｒｎａｌｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ）２旦、■８５〜１９７（１９
６１）にて対比すればペディオコッカス・ウリチーエク
イ（Ｐ ｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｅｑｕｉ
）とよ（一致するが、バーシース・マニュアル・オブ・
デイタミネイテイフ・バクテリオロジイー第８版（１９
７４）におけるペディオコッカス・ウリチーエクイの性
状とは若干違っているため、車両Ｂ−０６６７をペディ
オコッカス属に属する菌と同定し、ペディオコッカス・
ニス・ピーＢ−０６６７（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｐ、Ｂ−０６６７）と命名した。

さらに車両Ｂ−０６６８についてみれば、その性状より
ペディオコッカス属よりストレプトコツカス属に属する
菌と同定されるもので、さらに医学細菌同定の手引きに
て対比すればストレプトコッカス・ファエシウム・ハリ
エタス・トランス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａ
ｅｃｉｕｍ ｖａｒ 、 ｄｕｒａｎｓ ）とよく似て
いるが、バーシース・マニュアル・オプ・テイタミネイ
テイフ・バクテリオロジイー第８版（１９７４）ではス
トレプトコッカス・ファエシウム・バリエタス・トラン
スの記載力ないため詳細な対比が行なえなかったため、
よって車両Ｂ−０６６８（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ Ｂ−０６６８）と命名した。

さらに、このペディオコッカス・ニス・ピーＢ−０６６
７、およびストレプトコッカス・ニス・ピーＢ−０６６
８は、各々、工業技術院微生物工業技術研究所に微生物
受託番号 微工研菌寄第４４３８号、ＦＥＲＭ ＰＡ
４４３８１、および「微生物受託番号 微工研菌寄第４
４３９号、Ｆ Ｅ ＲＭ Ｐ Ａ、４４３９ ｊとし
て寄託した。

本発明は上記の知見に基いて完成されたもので、ペディ
オコッカス属、ストレプトコツカス属、またはアエロコ
ツカス属に属するピルビン酸オキシダーゼ生産菌を培地
に培養し、その培養物からピルビン酸オキシダーゼを採
取することを特徴とするピルビン酸オキシダーゼの製造
法であって、このピルビン酸オキシダーゼは、生体内物
質代謝経路における重要中間体であるピルビン酸を基質
とする酸ｆヒ酵素であるため、血清中のピルビン酸の定
量、グルタミン酸−オギザロ酢酸トランスアミナーゼ、
グルタミン酸−ピルピン酸トランスアミナーゼ、チクチ
ートチヒドロゲナーゼなどの酵素活性を必要に応じて他
の酵素類と組合せて、虫取するピルビン酸を測定するこ
とにより種々の酵素の活性測定または物質の定量などの
研究用試薬、診断用試薬として有用なものである。

本発明における使用菌としては、例えばペディオコッカ
ス・ニス・ピーＢ−０６６７、ストレプトコッカス・ニ
ス・ピーＢ−０６６８、アエロコツカス・ビリダンスＩ
ＦＯ１２２１９，７エロコツカス・ビリダンスＩＦ０１
２３１７などが挙られるが、これらの菌だけに限らず、
ペディオコッカス属、ストレプトコツカス属またはアエ
ロコツカス属に属する菌でピルビン酸オキシダーゼを生
産する菌は、すべて本発明において使用することができ
る。

本発明を実施するに当っては、ペディオコッカス属、ス
トレプトコツカス属またはアエロコツカス属に属するピ
ルビン酸オキシダーゼ生産菌を、酵素を生産する通常の
方法で培養する。

培養の形態は通常液体培養で行うが、工業的には深部通
気攪拌培養を行うのが有利である。

培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用され得る。

炭素源としては同１ヒ可能な炭素ｆヒ合物であればよく
、例えばグルコース、シュクロース、ラクトース、マル
トース、フラクトース、糖蜜などが使用される。

窒素源としては利用可能な窒素１１合物であればよく、
例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水
分解物などが使用される。

その他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウ
ム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要に応じて使用
される。

培養温度は菌が発育し、ピルビン酸オキシダーゼを生産
する範囲内で適宜変更し得るが、特に好ましくは２５〜
３７℃程度である。

培養時間は、条件によって多少異なるが、ピルビン酸オ
キシダーゼが最高収量に達する時期を見計って適当な時
期に培養を終了すればよく、通常は１８〜４８時間程度
である。

次いで、この様にして得られた培養物からピルビン酸オ
キシダーゼを採取するのであるが、本酵素は主として菌
体内に存在する。

本酵素を採取するには、まず得られた培養物をＪ−Ｔ過
または遠心分離などの手段により、その菌体：（を採取
し、次いでこの菌体を種々の機械的方法またはリゾチー
ムなどの酵素的方法にて破壊し、また必要に応じてエチ
レンジアミンテトラアセティツクアシド（ＥＤＴＡ）お
よびトリトンＸ−１００１アデカトール５Ｏ−１２０な
どの界面活性剤を添加してピルビン酸オキシダーゼを可
溶ｆヒ［２て水溶液として分離、採取する。

このようにして得たピルビン酸オキシダーゼの水溶液は
、さらに濃縮するか、または濃縮することなく可溶性塩
類例えば硫安、食塩などを用いて塩析せしめるが、さら
に親水性有機溶媒例えばメタノール、エタノール、アセ
トンなどを添加することにより沈澱せしめればよい。

さらにこの沈澱物は、水に溶解し、半透膜にて透析せし
めて、より低分子量の不純物を除去することができる。

また吸着剤あるいはゲル沢過剤などによる吸着クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィーあるいはゲ
ル１過などの手段を用いてピルビン酸オキシダーゼの溶
液中の不純物を有効に除去し、これらの手段により得ら
れる酵素溶液は、減圧濃縮、凍結乾燥などの処理にて固
形のピルビン酸オキシダーゼを得る。

さらにこのピルビン酸オキシダーゼをさらに精製するに
当っては、蛋白質、酵素などの精製に通常用いられる手
段、例えば吸着クロマトグラフィーイオン交換クロマト
グラフィー、ゲル１過などを用いて精製すればよい。

次に、本発明のピルビン酸オキシダーゼの埋ｆヒ学的性
質について述べる。

なお、ペディオコッカス・ニス・ピーＢ−０６６７につ
いては単にＢ−０６６７、ストレプトコッカス・ニス・
ピーＢ −０６６８についてはＢ−０６６８、アエロコ
ツカス・ビリダンスＩＦＯ１２２１９についてはＩＦＯ
１２２１９，７エロコツカス・ビリダンスＩＦＯ１２３
１７についてはＩＦＯ１２３１７としてその生産菌を示
す。

（１）作用 ピルビン酸、無機リン酸および酸素からアセチルリン酸
、二酸ｆヒ炭素および過酸化水素を生じる反応を触媒す
る。

（２）至適ｐＨ Ｂ−０６６７、Ｂ−０６６８、ＩＦＯ １２２１７およびＩＦＯ１２３１７の各菌株より得られ
たピルビン酸オキシダーゼについて、反応ｐＨの影響を
求めた。

測定において、力価測定における緩衝液としてｐＨ６〜
８の各リン酸塩緩衝液を使用し、各ｐＨでのピルビン酸
オキシダーゼ活性の測定結果は、第１図に示す通りで、
また第１図における○−○はＢ−０６６７、△−△はＢ
−０６６８、ローロはＩＦＯ １２２１９、☆−☆はＩＦＯ１２３１７の各菌株により
得られたピルビン酸オキシダーゼを示すものであり、そ
れらのピルビン酸オキシダーゼの至適ｐＨは次の通りで
ある。

（３）熱安定性 各４種の菌より得た酵素液０．１ ｍｌに、１０μＭの
ＦＡＤを含む１０ｍＭ！Ｊン酸塩緩衝液（ＰＨ６，５）
０．９ｍｌを加え、０，４０．５０．６０および７０
℃で１０分間加熱した後、力価測定法に準じて、各加熱
酵素の活性を測定した。

その結果は、第２図に示す通りで、また第２図における
○−○はＢ−０６６７、△−△はＢＯ６６８、ローロは
ＩＦＯ１２２１９、☆−☆はＩＦＯ１２３１７の各菌株
による酵素を示すものであり、それらの熱安定性をみれ
ば、Ｂ −０６６７、ＩＦＯ１２２１９、ＩＦＯ１２３
１７より得た酵素は４０℃において弱く活性１ヒされ※
く るが６０℃以上ではほぼ完全に失活し、さらにＢ−
０６６８より得た酵素は４０℃における活性１ヒの現象
がみられず、６０°Ｃ以上ではほぼ完全に失活する。

（４）’ＰＨ安定性 各酵素溶液０．’１ ｍ１．に、１０μＭＦＡＤを含む
０．２Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６〜８）および０．２Ｍト
リス−塩酸緩衝液（ＰＨ７〜９）を０．９ ｍｌ加え、
４０℃で１０分間加熱した。

この加熱した酵素の酵素活性を、酵素液２０μｌを用い
、力価測定法に準じて測定した。

その結果第３図に示す通りで、また第３図における〇−
〇（リン酸緩衝液）、・−・（トリス−塩酸緩衝液）は
Ｂ−０６６７、△−△（リン酸緩衝液）、ムム（トリス
−塩酸緩衝液はＢ−０６６８、日日（リン酸緩衝液）、
−一−（トリス−塩酸緩衝液）はＩＦＯ１２２１９、☆
−☆（リン酸緩衝液）、★−★（トリス−塩酸緩衝荏）
はＩＦＯ１２３１７より得た酵素を示すもので、Ｂ−０
６６７、ＩＦＯ１２２１９およびＩＦＯ１２３１７より
得た酵素はＰＨ７付近で最も安定であり、Ｂ−０６６８
より得た酵素は酸性側で安定であった。

（５）種々の物質的影響 ■ 力価測定法において、ＭｇＣ１□の代りに、次に示
す種々の物質の水溶液を用いて、各菌体から得た酵素の
酵素活性を測定した。

また各物質の反応液中での濃度は５ｍＭであり、さらに
表示は５ｍＭ ＭｇＣｌ□のときの活性を１００とし
て相対活性で示した。

その結果、各菌体より得た酵素は、すべてＥＤＴＡに完
全に阻害され、Ｍ ｇ ２ ＋、Ｃａ２＋Ｍｎ”＋およ
びＣｏ”＋により活性ｆヒされている。

＠ さらに、力価測定にて示す反応系より、下記の物質
を除去した場合の酵素活性を次表に相対活性として示し
た。

なお、リン酸除去の※場合は、緩衝液として０．１ Ｍ
ジメチルグルタル酸−水酸ｆヒナ） ＩＪウム緩衝液を
用い、また相対活性において力価測定における反応液の
未処理のときの活性を１００としたものである。

以上のことより、各酵素は、コファクターとしてチアミ
ンピロフォスフェート、ＦＡＤが必要であり、また基質
としてリン酸を必要とするものであることが明らかであ
る。

＊＊ また酸素電極を用いて、
酵素反応中における酸素消費量を測定した結果、酵素活
性（過酸ｆヒ水素の発生）に比例した酸素の消費が認め
られた。

一方、反応生成物は、次表の通りであった。

なお、酸素消費量は溶存酸素計（商品名ＹＳＩ−溶存酸
素計Ｍｏｄｅ ｌ−５３）を用い、アセチルリン酸の定
量はＦ、Ｌｉｐｍａｎｎらの方法ＣＪ、 Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、１３４．４６３−４６４（１９４０）〕によ
り、また過酸ｆヒ水素の定量はＮＮ−ジメチルアニリン
、４−アミノアンチピリンおよびワサビのペルオキシダ
ーゼによる方法により測定した。

以上の結果より、上記の４種の菌より産生ずる酵素は、
明らかにピルビン酸オキシダーゼと分類つけられるもの
であって、さらにこれら４種の酵素はすべてフラビン蛋
白であった。

また本発明のピルビン酸オキシダーゼの力価測定法は次
の通りである。

０．５Ｍピルビン酸カリウム ０．１ｍ１０．
５Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＨ７，０） ０．２ ｍ
１０．２％４−アミノアンチピリン ０．１ｍ１０
．２％Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリ７０．２ｍ１１０ｍＭＭ
ｇｃ１２ ５０ μｍ１０ｍＭチア
ミノピロフォスフェート ２０ ｔｔｌペルオキシ
ダーゼ（４５Ｕ／ｍＡ） ０．１ ｍｌｌｍＭＦ
ＡＤ １０ ｐｌ蒸留
水 ０．２２ｒｒＬｌ上記
の組成の反応液１．０ｍｌを試験管に分取し、３７℃、
３分間予備加温した後、酵素液２０μｌを加えて３７℃
、１０分間反応を行い、反応後、０．３ｍｌの０．１Ｍ
ＥＤＴＡ（ＰＨ７，５’）を加えて反応を停止し、次い
でこれに蒸留水１．７ｍｌを加えた後生じた紫色を５６
５ｎｍの波長にて比色定量する。

１分間に一１μｍ ｏ ｌ ｅの過酸ｆヒ水素を生じる
活性を１単位（Ｕ）とした。

さらに、本発明のピルビン酸オキシダーゼは、上述の如
く種々の有用性を有するものであって、以下に、例えば
ピルビン酸の簡便な分析法、分析用キットについて述べ
る。

まず対象とするピルビン酸としては、生体成分、例えば
血清、尿などのピルビン酸の定量、また、グルタミン酸
−ピルピン酸トランスアミナーゼ、ラクテートデヒドロ
ゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダ
ーゼ（Ｌ−アラニンオキシダーゼ）、グルタミン酸−オ
ギザロ酢酸トランスアミナーゼとオギザロ酢酸脱炭酸酵
素との組合せ系などの酵素反応系にて生成されるピルビ
ン酸の定量による酵素活性測定、またはこれらの酵素反
応系における基臂の純度測定、などの種々のものであっ
て、これらの系にてピルビン酸を有してなるものであれ
ばよく、このピルビン酸を含有する糸に、ピルビン酸オ
キシダーゼを作用せしめ、次いで好ましくは消費される
酸素、生成されろ過酸ｆヒ水素を測定することによって
分析し得るものであって、また消費される無機リン酸や
生成するアセチルリン酸を測定してもよい。

さらに消費される酵素の定量としては溶存酸素計を用い
ることが簡便でよく、また生成されろ過酸ｆヒ水素の定
量としては過酸ｆヒ水素電極メーター（ＹＳＩ−オキシ
ダーゼメーター）を用いるか、ペルオキシダーゼを用い
てキルイミド色素または螢光物質に導き、その色素を比
色定量または螢光定量するものである。

髪さらに、上記の分析において、少なくともピルビン酸
オキシダーゼチアミンピロフォスフェート、ＦＡＤ、リ
ン酸、さらに金属イオンとしてＭｇ ２ ＋、Ｍｎ２＋
。

Ｃｏ２＋、Ｃａ２＋などのイオン放出性塩類を有してい
ればよいものであるが、特に生成する過酸ｆヒ水素の測
定において比色定量または螢光定量するに当っては、さ
らに４−アミノアンチピリン、ペルオキシダーゼおよび
フェノールあるいは、Ｎ。

Ｎ−ジメチルアニリンやペルオキシダーゼおよびホモバ
ニリン酸などを併用すればよい。

次いでこの様な分析用キットに、一定量の被検体たるピ
ルビン酸を含有する糸を加えて、一定時間、好ましくは
１０〜２０分間程度、一定温度、好ましくは２０〜４０
℃程度、特に好ましくは約３５〜３７℃程度で反応を行
なえばよく、次いでその反応系に基く消費された酸素、
生成された過酸ｆヒ水酸を測定すればよい。

以上の通り、本発明のピルビン酸オキシダーゼは種々の
有用性、特に酵素的な臨床診断薬として有用なものであ
る。

次に、本発明の実施例および参考例を挙げて本発明を具
体的に述べるが、本発明はこれらにより何んら限定され
るものではない。

実施例 １ グルコース１％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、
ＮａＣｌ０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、Ｋ２ＨＰＯ
４０，１％、Ｍｇ８０４０．０５％、およびＣａＣＯ３
０，３％を含有する培地（ＰＨ７，０）ｌＯＯｍｌを５
００ｍ１容三角フラスコに分注し、１２０’Ｃ，２０分
間加熱滅菌した後、ペディオコッカス・ニス・ピー−Ｂ
−０６６７、ストレプトコッカス・ニス・ピーＢ−０６
６８，７エロコツカス・ビリダンスＩＦＯ１２２１９，
７エロコツカス・ビリダンスＩＦＯ１２３１７の各々の
菌株を接種し、各々３０’Ｃ１２４時間、３００ ｒｐ
ｍの条件下振盪培養し、培養終了後培養物を遠心分離し
て菌体を回収し１０ｍＭ！Ｊン酸塩緩衝液（ＰＨ６，５
）にて洗浄後、再び遠心分離して菌体を回収した。

次いでこの得られた菌体を、０．０２％リゾチームおよ
び０．１％トリトンｘ−ｉｏｏを含有する１０ｍＭリン
酸緩衝液（ＰＨ７，０） １０ｍｌに添加して、３７℃
で６０分間リゾチームを作用せしめた後、遠心分離して
、ピルビン酸オキシダーゼを含有する上清液を得た。

この上清液中の酵素活性は、各々次表に示す通りであっ
た。

実施例 ２ 実施例１と同一の組成を有する培地２０１を、３０Ｊ容
ジヤー・ファーメンタ−に加えて加熱滅菌した後、これ
に、実施例１と同様の方法にて予備培養したペディオコ
ッカス・ニス・ピーＢ−０６６７の培養液２００ ｍｌ
を移植し、３０°Ｃにて２４時間培養し、培養後、この
培養物を遠心分離して菌体（約ＬＯＯＰ）を回収し、こ
れを４１のリゾチーム溶液（０，２ｙｎ４）７ｍ０に浮
遊せしめ、さらにこれに４２のトリトンＸ−１００，３
ＰのＥＤＴＡ、４０ｍ１の１Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＨ６
５）を加え、３７℃で６０分間攪拌し、菌体を破壊し、
次いで得られた溶液を遠心分離して、その上清液（約６
０００Ｕ含有）を得た。

次いで、この上清液に硫安を添加し、その０．５４〜０
．７３飽和硫安で沈澱した両分を遠心分離して回収し、
得られた沈澱物を１０１００Ｏの１０ｍＭ！Ｊン酸塩緩
衝液（ＰＨ６，５）に加えて溶解しく５１６０Ｕ１回収
率８６％）、この溶液に０．６３容の冷アセトンを加え
て遠心分離して生じた沈澱物を除去し、得られた上清液
に、さらに０．３容のアセトンを加えて生じた沈澱物を
遠心分離して回収した。

さらにこの沈澱物を、１０ｍＭ’Ｊン酸塩緩衝液（ＰＨ
６，５）７０ｍｌに溶解しく４７５０Ｕ１回収率７９．
２％）、さらに硫安分画を行い、０５４〜０．１０飽和
硫安で沈澱した両分を遠心分離して、沈澱物を回収し、
これを１０ ｍＭ ’）ン酸塩緩衝液（ＰＨ６，５）に
溶解後、セファデックスＧ−２５のカラム（６，Ｏｘ
７０ｃｒｆＬ）にチャージして、２８０ｎｍの吸収を有
する両分を回収、併合し、次いで凍結乾燥してピルビン
酸オキシダーゼ粉末（３９４０Ｕ、７５８ｒｎ９、回収
率６５．７％）を得た。

参考例 １ 上記の反応液組成を有する試験液に、各々人血清無添加
および人血清５０μｌを加え、さらにこれに蒸留水を加
えて最終容量１．□ｍｌとし、この溶液にピルビン酸カ
リウム（０〜０．２５μｍｏｌｅ）を加え、３７°Ｃ１
１０分間反応せしめた後、０．３ ｍｌのＯ，ＩＭＥＤ
ＴＡ（ＰＨ，７，５）を加えて反応を停止し、さらにこ
れに１．７ｒｎｌの蒸留水を加えて、波長５６５ｎｍに
て比色定量を行なった。

その結果第４図に示す通りで、また第４図における〇−
〇は人血清無添加の場合を示し、・−・は人血清５０μ
ｌ添加の場合を示すもので、その図より明らかな通り、
血清の存在する場合および血清の存在しない場合、とも
にピルビン酸量と５６５ｎ ｍにおける吸光度の間に直
線関係が成立し、またこの結果は、スタンダードとして
用いた同モル量の過酸ｆヒ水素の場合の吸光度とよく一
致したもので、血清中、または血清以外のピルビン酸の
定量法および定量用キットとして使用し得るものであっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のピルビン酸オキシダーゼの至適ＰＨ１
第２図は本発明のピルビン酸オキシダーゼの熱安定性、
第３図は本発明のピルビン酸オキシダーゼのＰＨ安定性
を示すもので、第４図は本発明のピルビン酸オキシダー
ゼを用いてなるピルビン酸の測定結果を示すものである
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ペディオコッカス属、ストレプトコツカス属または
   アエロコツカス属に属するピルビン酸オキシダーゼ生産
   菌を培地に培養し、その培養物からピルビン酸オキシダ
   ーゼを採取することを特徴とするピルビン酸オキシダー
   ゼの製造法。