JP2984043B2 - ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 - Google Patents
ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法Info
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- JP2984043B2 JP2984043B2 JP24977590A JP24977590A JP2984043B2 JP 2984043 B2 JP2984043 B2 JP 2984043B2 JP 24977590 A JP24977590 A JP 24977590A JP 24977590 A JP24977590 A JP 24977590A JP 2984043 B2 JP2984043 B2 JP 2984043B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規かつ有用なミオ・イノシトールデヒド
ロゲナーゼおよびその製造法に関する。さらに詳しく
は、臨床生化学検査、食品検査などにおけるミオ・イノ
シトールの測定に利用されるミオ・イノシトールデヒド
ロゲナーゼおよびその製造法に関する。
ロゲナーゼおよびその製造法に関する。さらに詳しく
は、臨床生化学検査、食品検査などにおけるミオ・イノ
シトールの測定に利用されるミオ・イノシトールデヒド
ロゲナーゼおよびその製造法に関する。
ミオ・イノシトールはイノシトールの９つの異性体の
１つで、極めて安定した環状アルコールである。人の場
合、ミオ・イノシトールは食事により１日約1g、腎臓に
おける生合成により約2gが供給され、細胞への取り込み
と腎臓における排泄・再吸収および酸化により血しょう
レベルがほぼ一定になるように調節されている。そのた
め腎機能障害において血しょうミオ・イノシトールレベ
ルの著名な増加が見られる〔臨床科学24巻、11号、1448
−1455頁、嘉門信雄〕。このようにミオ・イノシトール
を測定することによって腎機能のモニタリングができ
る。
１つで、極めて安定した環状アルコールである。人の場
合、ミオ・イノシトールは食事により１日約1g、腎臓に
おける生合成により約2gが供給され、細胞への取り込み
と腎臓における排泄・再吸収および酸化により血しょう
レベルがほぼ一定になるように調節されている。そのた
め腎機能障害において血しょうミオ・イノシトールレベ
ルの著名な増加が見られる〔臨床科学24巻、11号、1448
−1455頁、嘉門信雄〕。このようにミオ・イノシトール
を測定することによって腎機能のモニタリングができ
る。
従来、ミオ・イノシトールはガスクロマトグラフイ
ー、高速液体クロマトグラフイー等で測定されており、
臨床生化学ではミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを
用いてミオ・イノシトールを測定する例は知られていな
かった。
ー、高速液体クロマトグラフイー等で測定されており、
臨床生化学ではミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを
用いてミオ・イノシトールを測定する例は知られていな
かった。
公知のミオ・イノシトールに基質特異性を有し、少な
くともミオ・イノシトールおよびNAD+からミオ・イノソ
ースおよびNADH＋H+を生成する反応を触媒する酵素生産
菌として知られているAerobacter aerogenes〔Methods
in Enzymology 36、326（1962）〔Ｖ〕〕の生産す
る酵素は至適pHが9.0、ミオ・イノシトールに対するKm
値は1.25×10-3Mであり、NAD+に対するKm値は3.3×10-4
Mであると記載されている。（酵素ハンドブック、朝倉
書店発行、p.6）。また、公知の本酵素生産菌として知
られている、Kleb siella pneumoniae、Serratia ma
rcescens（酵素ハンドブック、p.6）の２種は標準微生
物学第２版（医学書院、p.209−212）によると肺炎ある
いは日和見感染起因菌として化学療法剤、抗生物質に抵
抗性を有する難治性感染菌として知られており、工業的
規模で培養することは避けなければならず、現状ではこ
れら生産菌による当該酵素の性状についての報告はな
い。更に、従来公知のCryptococcus melibiosum〔Bioc
hem.Biophys.Acta,293,295−303（1973）〕の生産する
酵素のミオ・イノシトールに対するKm値は5.1×10-3Mで
あり、NAD+に対するKm値は6.9×10-5Mであると記載され
ている。（酵素ハンドブック、p.6）。その他、本酵素
は動物の器官として牛の脳〔Biochem.Biophys.Res.Comm
un.,68:1133−1138（1976）〕に存在することが知られ
ているが、酵素を分離するために常に新鮮な脳を入手す
ることは非常に困難なことである上に経済的でなく、ま
た分子量は74,000であると記載されている。
くともミオ・イノシトールおよびNAD+からミオ・イノソ
ースおよびNADH＋H+を生成する反応を触媒する酵素生産
菌として知られているAerobacter aerogenes〔Methods
in Enzymology 36、326（1962）〔Ｖ〕〕の生産す
る酵素は至適pHが9.0、ミオ・イノシトールに対するKm
値は1.25×10-3Mであり、NAD+に対するKm値は3.3×10-4
Mであると記載されている。（酵素ハンドブック、朝倉
書店発行、p.6）。また、公知の本酵素生産菌として知
られている、Kleb siella pneumoniae、Serratia ma
rcescens（酵素ハンドブック、p.6）の２種は標準微生
物学第２版（医学書院、p.209−212）によると肺炎ある
いは日和見感染起因菌として化学療法剤、抗生物質に抵
抗性を有する難治性感染菌として知られており、工業的
規模で培養することは避けなければならず、現状ではこ
れら生産菌による当該酵素の性状についての報告はな
い。更に、従来公知のCryptococcus melibiosum〔Bioc
hem.Biophys.Acta,293,295−303（1973）〕の生産する
酵素のミオ・イノシトールに対するKm値は5.1×10-3Mで
あり、NAD+に対するKm値は6.9×10-5Mであると記載され
ている。（酵素ハンドブック、p.6）。その他、本酵素
は動物の器官として牛の脳〔Biochem.Biophys.Res.Comm
un.,68:1133−1138（1976）〕に存在することが知られ
ているが、酵素を分離するために常に新鮮な脳を入手す
ることは非常に困難なことである上に経済的でなく、ま
た分子量は74,000であると記載されている。
このように公知の酵素はその生産菌（Aerobacter、Kl
ebsiella、Serratia）が感染菌であったり、、Cryptoco
ccus melibiosum由来の酵素のようにミオ・イノシトー
ルおよびNAD+に対するKm値が高いために十分な反応速度
が得られなかったり、牛の脳のように新鮮な原料を常に
多量に入手することが困難であった。
ebsiella、Serratia）が感染菌であったり、、Cryptoco
ccus melibiosum由来の酵素のようにミオ・イノシトー
ルおよびNAD+に対するKm値が高いために十分な反応速度
が得られなかったり、牛の脳のように新鮮な原料を常に
多量に入手することが困難であった。
そこで、本発明者らは、ミオ・イノシトールを測定す
る目的で、危険性のない、培養活性の高い、基質である
ミオ・イノシトールとNAD+に対するKm値のできるだけ低
い、安定で精製の簡単な酵素を生産する菌株を広く自然
界よりスクリーニングしたところ、静岡県賀茂郡東伊豆
町熱川の温泉近くの土壌より分離したBacillus・sp No.
3菌株が目的とする良好な性質を有する新規なミオ・イ
ノシトールデヒドロゲナーゼを産生することを見出し、
本発明を完成した。
る目的で、危険性のない、培養活性の高い、基質である
ミオ・イノシトールとNAD+に対するKm値のできるだけ低
い、安定で精製の簡単な酵素を生産する菌株を広く自然
界よりスクリーニングしたところ、静岡県賀茂郡東伊豆
町熱川の温泉近くの土壌より分離したBacillus・sp No.
3菌株が目的とする良好な性質を有する新規なミオ・イ
ノシトールデヒドロゲナーゼを産生することを見出し、
本発明を完成した。
即ち、本発明は、pH8.5において測定したミオ・イノ
シトールとNAD+に対するKm値がそれぞれ0.64mM、0.004m
Mと非常に低い、反応性の高い性質を有し、かつほぼ60
℃の緩衝液中で約15分間処理した後の活性が、処理前の
活性の95％以上の値を保持している優れた熱安定性を有
している新規なミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを
提供するものである。また、本発明は、バチルス属に属
するミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ生産菌を培地
に培養し、得られた培養物からミオ・イノシトールデヒ
ドロゲナーゼを採取することを特徴とするミオ・イノシ
トールデヒドロゲナーゼの製造法を提供するものであ
る。
シトールとNAD+に対するKm値がそれぞれ0.64mM、0.004m
Mと非常に低い、反応性の高い性質を有し、かつほぼ60
℃の緩衝液中で約15分間処理した後の活性が、処理前の
活性の95％以上の値を保持している優れた熱安定性を有
している新規なミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを
提供するものである。また、本発明は、バチルス属に属
するミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ生産菌を培地
に培養し、得られた培養物からミオ・イノシトールデヒ
ドロゲナーゼを採取することを特徴とするミオ・イノシ
トールデヒドロゲナーゼの製造法を提供するものであ
る。
ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ生産菌はバチル
ス属に属するが、例えば本発明者らが分離したNo.3菌株
は、本発明に最も有効に使用される菌株の一例であっ
て、本菌株の菌学的性質を示すと次の通りである。
ス属に属するが、例えば本発明者らが分離したNo.3菌株
は、本発明に最も有効に使用される菌株の一例であっ
て、本菌株の菌学的性質を示すと次の通りである。
尚、本菌株の同定に当たっては、同定実験は医学細菌
同定の手引き（第２版）、Microbiological Methods
（３巻）に準じて行い、実験結果をBergey's Manual
of Systematic Bacteriology Vol.1（1984）、２（1
986）などと対比して同定を行った。
同定の手引き（第２版）、Microbiological Methods
（３巻）に準じて行い、実験結果をBergey's Manual
of Systematic Bacteriology Vol.1（1984）、２（1
986）などと対比して同定を行った。
（ａ）形態的特徴 端の丸いまっすぐまたはやや曲がった桿状細菌で大き
さは0.5〜0.7×1.5〜3.5μｍで周毛で運動する。端また
は亜端に0.8×1.0〜2.0μｍの楕円〜卵形の芽胞を形成
し、芽胞によって菌体は膨張する。多形性なし。
さは0.5〜0.7×1.5〜3.5μｍで周毛で運動する。端また
は亜端に0.8×1.0〜2.0μｍの楕円〜卵形の芽胞を形成
し、芽胞によって菌体は膨張する。多形性なし。
（ｂ）各培地における生育状態 各種培地上で、１〜２日、50〜52℃で培養し、観察し
た所見は次の通りである。
た所見は次の通りである。
普通寒天平板培地 円形で丘状（convex）の集落を形成する。表面は滑ら
かで縁は丸い。黄土色〜淡黄土色を呈するが、可溶性色
素は産生しない。
かで縁は丸い。黄土色〜淡黄土色を呈するが、可溶性色
素は産生しない。
普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。淡黄土〜黄土色を呈する。可
溶性色素は産生しない。
溶性色素は産生しない。
液体培地（ペプトン水） 生育良好で一様に混濁する。
リトモスミルク培地 ４〜５日後、弱酸性になる。
DNAのGCモル％ :41.9モル％（HPLC法） 主たるイソプレノイドキノン :MK−７ （ｃ）生理的、生化学的性質〔＋；陽性、（＋）；弱陽
性、−；陰性、NT;未実験〕 グラム染色 ＋ KOH反応 − カプセル形成 − 抗酸性染色 − OFテスト （Hugh−Leifson） NT OFテスト （Ｎ源にNH4H2PO4） F 好気での生育 ＋ 嫌気での生育 ＋ 生育温度 70℃ − 60℃ ＋ 37℃ ＋ 30℃ − 食塩耐性 0％ ＋ 3％ ＋ 5％ − 生育pH 5.6 − 6.2 ＋ 9.0 ＋ ゼラチンの分解 − 澱粉の分解 （＋） カゼインの分解 − エスクリンの分解 ＋ チロシンの分解 − アルギニンの分解 − セルロースの分解 − カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ レシチナーゼ産生 − ウレアーゼ産生（SSR） − ウレアーゼ産生（Chris） − インドール産生 − 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） − アセトイン産生（K2HPO4） − アセトイン産生（NaCl） − MRテスト − 硝酸塩還元テスト（ガス産生） − （NO2 -の検出） − （NO3 -の検出） ＋ シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 − リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 − クリステンゼン培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 ＋ グルコン酸塩 − コハク酸塩 ＋ グルコースよりガスの産生 − 各種糖類より酸の産生 アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース − セロビオース ＋ ヅルシトール − メソ・エリスリトール − フラクトース ＋ フコース ＋ ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール ＋ イヌリン ＋ ラクトース ＋ マルトース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ メレジトース − メリビオース ＋ ラフィノース − ラムノース ＋ Ｄ−リボース ＋ サリシン ＋ Ｌ−ソルボース − ソルビトール − 澱粉 ＋ サッカロース ＋ トレハロース ＋ キシロース − 以上の通り、本菌株の主性状は、グラム陽性の桿状細
菌で、大きさは0.5〜0.7×1.5〜3.5μｍ、周毛で運動、
芽胞形成、多形成なし、グルコースを醗酵的に分解し、
酸を産生する。カタラーゼ・オキシダーゼ産生。高温性
の通性嫌気性であり、これらのグラム陽性桿菌で芽胞を
形成し、好気で生育する特徴から、バチルス属に属する
と判断された。
性、−；陰性、NT;未実験〕 グラム染色 ＋ KOH反応 − カプセル形成 − 抗酸性染色 − OFテスト （Hugh−Leifson） NT OFテスト （Ｎ源にNH4H2PO4） F 好気での生育 ＋ 嫌気での生育 ＋ 生育温度 70℃ − 60℃ ＋ 37℃ ＋ 30℃ − 食塩耐性 0％ ＋ 3％ ＋ 5％ − 生育pH 5.6 − 6.2 ＋ 9.0 ＋ ゼラチンの分解 − 澱粉の分解 （＋） カゼインの分解 − エスクリンの分解 ＋ チロシンの分解 − アルギニンの分解 − セルロースの分解 − カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ レシチナーゼ産生 − ウレアーゼ産生（SSR） − ウレアーゼ産生（Chris） − インドール産生 − 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） − アセトイン産生（K2HPO4） − アセトイン産生（NaCl） − MRテスト − 硝酸塩還元テスト（ガス産生） − （NO2 -の検出） − （NO3 -の検出） ＋ シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 − リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 − クリステンゼン培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 ＋ グルコン酸塩 − コハク酸塩 ＋ グルコースよりガスの産生 − 各種糖類より酸の産生 アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース − セロビオース ＋ ヅルシトール − メソ・エリスリトール − フラクトース ＋ フコース ＋ ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール ＋ イヌリン ＋ ラクトース ＋ マルトース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ メレジトース − メリビオース ＋ ラフィノース − ラムノース ＋ Ｄ−リボース ＋ サリシン ＋ Ｌ−ソルボース − ソルビトール − 澱粉 ＋ サッカロース ＋ トレハロース ＋ キシロース − 以上の通り、本菌株の主性状は、グラム陽性の桿状細
菌で、大きさは0.5〜0.7×1.5〜3.5μｍ、周毛で運動、
芽胞形成、多形成なし、グルコースを醗酵的に分解し、
酸を産生する。カタラーゼ・オキシダーゼ産生。高温性
の通性嫌気性であり、これらのグラム陽性桿菌で芽胞を
形成し、好気で生育する特徴から、バチルス属に属する
と判断された。
そこで、本菌株がバチルス属のどの種に属するか否か
を同定した。即ち、Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology,Vol.2によれば、高温（50℃）で生育す
る菌種はバチルス アシドカルダリウス（B.acidocalda
rius）、バチルス サブチリス（B.subtilis）、バチル
ス バジウス（B.badius）、バチルス ブレビス（B.br
evis）、バチルス コアグランス（B.coagulans）、バ
チルス リケニフォルミス（B.licheniformis）、バチ
ルス パントセンチカス（B.pantothenticus）、バチル
ス シェゲリ（B.schegelli）、バチルス ステアロサ
ーモフィルス（B.stearothermophilus）の９菌種が記載
されている。その内で、嫌気下で生育する菌種はバチル
スB.coagulannsとB.lichenformisの２菌種のみである。
即ち、B.coagulanns（以下、「Ｃ」と略記することがあ
る）およびB.licheniformis（以下、「Ｌ」と略記する
ことがある）と本菌とを対比した結果は、次の通りであ
る。
を同定した。即ち、Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology,Vol.2によれば、高温（50℃）で生育す
る菌種はバチルス アシドカルダリウス（B.acidocalda
rius）、バチルス サブチリス（B.subtilis）、バチル
ス バジウス（B.badius）、バチルス ブレビス（B.br
evis）、バチルス コアグランス（B.coagulans）、バ
チルス リケニフォルミス（B.licheniformis）、バチ
ルス パントセンチカス（B.pantothenticus）、バチル
ス シェゲリ（B.schegelli）、バチルス ステアロサ
ーモフィルス（B.stearothermophilus）の９菌種が記載
されている。その内で、嫌気下で生育する菌種はバチル
スB.coagulannsとB.lichenformisの２菌種のみである。
即ち、B.coagulanns（以下、「Ｃ」と略記することがあ
る）およびB.licheniformis（以下、「Ｌ」と略記する
ことがある）と本菌とを対比した結果は、次の通りであ
る。
尚、Ｃ、Ｌおよび本菌で示される「＋」は陽性、
「（＋）」は弱陽性、「−」は陰性、「ｄ」は菌株によ
って異なる、NDはデータなしであることを示す。
「（＋）」は弱陽性、「−」は陰性、「ｄ」は菌株によ
って異なる、NDはデータなしであることを示す。
以上対比した結果によれば、本菌株No.3の諸性状はBa
cillus coagulansに近いと考えられるが、アセトイン
産生能、DNAのGCモル％、また上記対比表には載せてい
ないが、リトモスミルク培地での反応も違っている。
cillus coagulansに近いと考えられるが、アセトイン
産生能、DNAのGCモル％、また上記対比表には載せてい
ないが、リトモスミルク培地での反応も違っている。
よって、本菌株を公知のものと区別するため、バチル
ス・エスピーNo.3（Bacillus sp.No.3）と命名し、通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号微
工研条寄第3013号（FERM BP−3013）として寄託した。
ス・エスピーNo.3（Bacillus sp.No.3）と命名し、通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号微
工研条寄第3013号（FERM BP−3013）として寄託した。
本発明においては、先ずバチルス属に属するミオ・イ
ノシトールデヒドロゲナーゼ生産菌が適当な培地に培養
される。
ノシトールデヒドロゲナーゼ生産菌が適当な培地に培養
される。
上記のミオ・イノシトールデヒロゲナーゼ生産菌とし
ては、前述のバチルス・エスピーNo.3が挙げられるが、
細菌の一般的性状として菌学上の性質は変異し得るもの
であるから、自然的にあるいは通常行われる紫外線照
射、放射線照射または変異誘導剤、例えばＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタン
スルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異し
得る人工変異株は勿論、自然変異株も含め、バチルス属
に属し、ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを生産す
る能力を有する菌株は、すべて本発明に使用することが
できる。
ては、前述のバチルス・エスピーNo.3が挙げられるが、
細菌の一般的性状として菌学上の性質は変異し得るもの
であるから、自然的にあるいは通常行われる紫外線照
射、放射線照射または変異誘導剤、例えばＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタン
スルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異し
得る人工変異株は勿論、自然変異株も含め、バチルス属
に属し、ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを生産す
る能力を有する菌株は、すべて本発明に使用することが
できる。
上記の培養は、細菌の培養に一般に用いられる条件に
よって行うことができるが、本菌株の培養にあたって
は、ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼがミオ・イノ
シトールによって誘導的に生成される誘導酵素であるこ
とから、例えばミオ・イノシトールを0.5〜５％含む培
地で培養することがミオ・イノシトールデヒドロゲナー
ゼの生産性を100〜300倍程度良好とするので好ましい。
よって行うことができるが、本菌株の培養にあたって
は、ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼがミオ・イノ
シトールによって誘導的に生成される誘導酵素であるこ
とから、例えばミオ・イノシトールを0.5〜５％含む培
地で培養することがミオ・イノシトールデヒドロゲナー
ゼの生産性を100〜300倍程度良好とするので好ましい。
培地としては、ミオ・イノシトールを添加する以外に
微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに
は必要に応じ、無機塩などを含有させた栄養培地が使用
される。
微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに
は必要に応じ、無機塩などを含有させた栄養培地が使用
される。
同化し得る炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、サッカロースなどが単独または組み合わせて用いら
れる。消化し得る窒素源としては、例えばペプトン、肉
エキス、酵母エキスなどが単独または組み合わせて用い
られる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、その
他、鉄、マンガンなどの種々の重金属塩などが使用され
る。上記以外に公知の同化し得る炭素源、消化し得る窒
素源が使用できることはいうまでもない。
ス、サッカロースなどが単独または組み合わせて用いら
れる。消化し得る窒素源としては、例えばペプトン、肉
エキス、酵母エキスなどが単独または組み合わせて用い
られる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、その
他、鉄、マンガンなどの種々の重金属塩などが使用され
る。上記以外に公知の同化し得る炭素源、消化し得る窒
素源が使用できることはいうまでもない。
培養は、通常振とうまたは通気撹拌撹拌培養などの好
気的条件下で行うのがよく、工業的には深部通気撹拌培
養が好ましい。培養温度はミオ・イノシトールデヒドロ
ゲナーゼ生産菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適
宜変更し得るが、通常は40〜60℃、特に50℃付近が好ま
しい。培養時間は培養条件によって異なるが、本酵素が
最高力価に達する時期を見計らって適当な時期に培養す
ればよいが、通常は１〜２日間程度である。
気的条件下で行うのがよく、工業的には深部通気撹拌培
養が好ましい。培養温度はミオ・イノシトールデヒドロ
ゲナーゼ生産菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適
宜変更し得るが、通常は40〜60℃、特に50℃付近が好ま
しい。培養時間は培養条件によって異なるが、本酵素が
最高力価に達する時期を見計らって適当な時期に培養す
ればよいが、通常は１〜２日間程度である。
これらの培地組成、培地の液性、培養温度、撹拌速
度、通気性などの培養条件は使用する菌株の種類や外部
の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜
調節、選択されることは言うまでもない。液体培養にお
いて発泡があるときは、シリコン油、植物油などの消泡
剤が適宜使用される。
度、通気性などの培養条件は使用する菌株の種類や外部
の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜
調節、選択されることは言うまでもない。液体培養にお
いて発泡があるときは、シリコン油、植物油などの消泡
剤が適宜使用される。
このようにして得られたミオ・イノシトールデヒドロ
ゲナーゼは、主として菌体内に含有されるので、得られ
た培養物から濾過または遠心分離等の手段により集菌
し、この菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラ
スビーズ処理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やリゾ
チーム等の酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適
宜組み合わせて、粗製のミオ・イノシトールデヒドロゲ
ナーゼ含有液が得られる。
ゲナーゼは、主として菌体内に含有されるので、得られ
た培養物から濾過または遠心分離等の手段により集菌
し、この菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラ
スビーズ処理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やリゾ
チーム等の酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適
宜組み合わせて、粗製のミオ・イノシトールデヒドロゲ
ナーゼ含有液が得られる。
次いで、この粗製のミオ・イノシトールデヒドロゲナ
ーゼ含有液から公知の蛋白質、酵素等の単離、精製手段
を用いることによりさらに精製されたミオ・イノシトー
ルデヒドロゲナーゼを得ることができる。例えば粗製の
ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ含有液に、硫安、
硫酸ナトリウム等を添加する塩折沈澱法により本酵素を
回収すればよい。さらにこの沈澱物は、分子篩、各種の
樹脂を用いたクロマトグラフイー法、電気泳動法あるい
は超遠心分析法を適宜組み合わせ用いて、必要に応じて
精製すればよく、その精製手段としては、目的とするミ
オ・イノシトールデヒドロゲナーゼの性質を利用した手
段を用いればよく、例えば上記の沈澱物を水または緩衝
液に溶解した後、必要に応じて半透膜にて透析し、さら
にDEAE−セルロース、DEAE−セファセル、DEAE−セファ
ロース、DEAE−セファデックス、Ｑ−セファロース（フ
ァルマシア製）、DEAE−トヨパール（東洋曹達社製）ハ
イドロキシルアパタイト等のイオン交換樹脂や、オクチ
ルセファロース、フェニル−セファロース（ファルマシ
ア社製）等の疎水クロマト樹脂や、その他のアフィニテ
ィークロマト樹脂が使用される。また、セファデックス
Ｇ−100、セファアクリルＳ−200等のゲル濾過剤による
分子篩クロマトや、さらに必要に応じて透析膜を用いて
脱塩すればよい。その後、必要に応じて糖類、例えばマ
ンニトール、サッカロース、ソルビトール等、アミノ
酸、例えばグルタミン酸、グリシン等、ペプタイドまた
は蛋白質として牛血清アルブミン等の安定剤の0.05〜10
％程度を添加し、凍結乾燥等の処理により精製されたミ
オ・イノシトールデヒドロゲナーゼの粉体を得ることが
できる。
ーゼ含有液から公知の蛋白質、酵素等の単離、精製手段
を用いることによりさらに精製されたミオ・イノシトー
ルデヒドロゲナーゼを得ることができる。例えば粗製の
ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ含有液に、硫安、
硫酸ナトリウム等を添加する塩折沈澱法により本酵素を
回収すればよい。さらにこの沈澱物は、分子篩、各種の
樹脂を用いたクロマトグラフイー法、電気泳動法あるい
は超遠心分析法を適宜組み合わせ用いて、必要に応じて
精製すればよく、その精製手段としては、目的とするミ
オ・イノシトールデヒドロゲナーゼの性質を利用した手
段を用いればよく、例えば上記の沈澱物を水または緩衝
液に溶解した後、必要に応じて半透膜にて透析し、さら
にDEAE−セルロース、DEAE−セファセル、DEAE−セファ
ロース、DEAE−セファデックス、Ｑ−セファロース（フ
ァルマシア製）、DEAE−トヨパール（東洋曹達社製）ハ
イドロキシルアパタイト等のイオン交換樹脂や、オクチ
ルセファロース、フェニル−セファロース（ファルマシ
ア社製）等の疎水クロマト樹脂や、その他のアフィニテ
ィークロマト樹脂が使用される。また、セファデックス
Ｇ−100、セファアクリルＳ−200等のゲル濾過剤による
分子篩クロマトや、さらに必要に応じて透析膜を用いて
脱塩すればよい。その後、必要に応じて糖類、例えばマ
ンニトール、サッカロース、ソルビトール等、アミノ
酸、例えばグルタミン酸、グリシン等、ペプタイドまた
は蛋白質として牛血清アルブミン等の安定剤の0.05〜10
％程度を添加し、凍結乾燥等の処理により精製されたミ
オ・イノシトールデヒドロゲナーゼの粉体を得ることが
できる。
以上の如くして得られたミオ・イノシトールデヒドロ
ゲナーゼの性状は以下の通りである。
ゲナーゼの性状は以下の通りである。
（１）基質特異性 ミオ・イノシトール 100％ グルコース ０ フルクトース ０ ガラクトース ０ ソルビトール ０ マンノース ０ マルトース ０ サッカロース ０ ラクトース ０ （２）酵素作用 下記式に示すように、少なくともミオ・イノシトール
およびNAD+よりミオ・イノソースおよびNADHを生成する
反応を触媒する。
およびNAD+よりミオ・イノソースおよびNADHを生成する
反応を触媒する。
ミオ・イノシトール＋NAD+ ミオ・イノソース＊＋NADH＋H+ ＊（2,4,6/3,5−ペンタヒドロキシシクロヘキサノン） （３）分子量 130,000±15,000 トーソー社製TSKゲルG3000SW（0.75×60cm）による
値、溶出液;0.2M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）、標準品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マー
カーを使用。
値、溶出液;0.2M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）、標準品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マー
カーを使用。
（４）等電点 pH4.5±0.5 キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法によ
り４℃、700Vの定電圧で40時間通電した後、分画し、各
画分の酵素活性を測定した。
り４℃、700Vの定電圧で40時間通電した後、分画し、各
画分の酵素活性を測定した。
（５）Km値 100mM トリス塩酸緩衝液（pH8.5）、 5U ジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、 1mM NAD＋ （オリエンタル酵母社製）、 0.025％ NTB（和光純薬工業社製）0.1％牛血清アル
ブミン（シグマ社製） を含む反応液中でミオ・イノシトールの濃度を変化させ
て、ミオ・イノシトールに対するKm値を測定した結果
は、0.64mMの値を示した。
ブミン（シグマ社製） を含む反応液中でミオ・イノシトールの濃度を変化させ
て、ミオ・イノシトールに対するKm値を測定した結果
は、0.64mMの値を示した。
一方、前記反応液中でNAD+の代わりに15mMのミオ・イ
ノシトールを添加し、NAD+の濃度を変化させてNAD+に対
するKm値を測定した結果は、0.004mMの値を示した。
ノシトールを添加し、NAD+の濃度を変化させてNAD+に対
するKm値を測定した結果は、0.004mMの値を示した。
（６）至適pH 後記の酵素活性測定法に従い、反応液中の100mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH8.5）に代えて100mMのリン酸緩衝液
（pH6.5〜8.0、−○−）、トリス塩酸緩衝液（pH8.0〜
9.0、−□−）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH9.0〜10.0、−■−）の各緩衝液を用いて測定し
た活性の相対値の結果は第４図に示す通りであって、pH
9.5付近で最大の活性を示す。
ス塩酸緩衝液（pH8.5）に代えて100mMのリン酸緩衝液
（pH6.5〜8.0、−○−）、トリス塩酸緩衝液（pH8.0〜
9.0、−□−）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH9.0〜10.0、−■−）の各緩衝液を用いて測定し
た活性の相対値の結果は第４図に示す通りであって、pH
9.5付近で最大の活性を示す。
（７）pH安定性 本酵素（1u/m）を40mMの酢酸緩衝液（pH4.5〜6.0、
−▲−）、リン酸緩衝液（pH6.0〜8.0、−○−）、トリ
ス塩酸緩衝液（pH8.0〜9.5、−□−）およびグリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0〜10.0、−■−）の各
緩衝液で調製し、50℃で15分間加熱処理した後、その残
存活性を後記の酵素活性測定法に従って測定した結果
は、第３図に示す通りであって、pH6.5〜9.0の範囲で80
％以上の活性を保持している。
−▲−）、リン酸緩衝液（pH6.0〜8.0、−○−）、トリ
ス塩酸緩衝液（pH8.0〜9.5、−□−）およびグリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0〜10.0、−■−）の各
緩衝液で調製し、50℃で15分間加熱処理した後、その残
存活性を後記の酵素活性測定法に従って測定した結果
は、第３図に示す通りであって、pH6.5〜9.0の範囲で80
％以上の活性を保持している。
（８）熱安定性 本酵素液（1u/m）を20mMリン酸緩衝液（pH7）で調
製し、15分間加熱処理後、その残存活性を後記の酵素活
性測定法に従って測定した結果は、第１図に示される通
りであって、60℃までは残存活性として95％以上を有す
る安定なものであつた。
製し、15分間加熱処理後、その残存活性を後記の酵素活
性測定法に従って測定した結果は、第１図に示される通
りであって、60℃までは残存活性として95％以上を有す
る安定なものであつた。
（９）至適温度 100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.5）を用い、後記の酵素
活性測定法に従い、35、40、45、50、55、60および65℃
の各温度で10分間反応後、0.1N塩酸ｍで反応を停止
し、波長550nmで吸光度を測定した相対値の結果は、第
２図に示す通りであって、60℃付近で最大の活性を有し
ている。
活性測定法に従い、35、40、45、50、55、60および65℃
の各温度で10分間反応後、0.1N塩酸ｍで反応を停止
し、波長550nmで吸光度を測定した相対値の結果は、第
２図に示す通りであって、60℃付近で最大の活性を有し
ている。
（10）ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ活性測定法 反応液組成 100mM トリス塩酸緩衝液（pH8.5）、 15mM ミオイノシトール（和光純薬社製） 1mM NAD+（オリエンタル酵母社製） 5U ジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、 0.025％NBT（和光純薬工業社製品）、 0.1％牛血清アルブミン（シグマ社製） 酵素活性測定 上記の反応液1mを小試験管に入れ、37℃で５分間イ
ンキュベートした後に、適当に希釈した酵素液0.02m
を添加して撹拌し、反応を開始する。正確に10分間反応
の後に、0.1N塩酸2.0mを添加して撹拌し、反応を停止
して、A550nmを測定して吸光度A1を求める。上記反応液
よりミオ・イノシトールを除いた反応液を用いて同様の
測定を行い、その吸光度Aoを求める。
ンキュベートした後に、適当に希釈した酵素液0.02m
を添加して撹拌し、反応を開始する。正確に10分間反応
の後に、0.1N塩酸2.0mを添加して撹拌し、反応を停止
して、A550nmを測定して吸光度A1を求める。上記反応液
よりミオ・イノシトールを除いた反応液を用いて同様の
測定を行い、その吸光度Aoを求める。
〔発明の効果〕 本発明のバチルス属に属するバチルス・エスピーNo.3
由来の新規な性状を有するミオ・イノシトールデヒドロ
ゲナーゼは60℃で残存活性として95％以上有する熱安定
性に優れている新規な酵素であり、かつ、基質のミオ・
イノシトールおよび補酵素のNAD+に対するKm値が非常に
低いために優れた反応性を有していることから、本酵素
を利用した極めて優れたミオ・イノシトール測定用試薬
を提供できる。また本発明の酵素は分離、精製中におけ
る失活も少なく、精製も容易であるので、ミオ・イノシ
トールデヒドロゲナーゼの製法として有利な製造法を提
供できる。
由来の新規な性状を有するミオ・イノシトールデヒドロ
ゲナーゼは60℃で残存活性として95％以上有する熱安定
性に優れている新規な酵素であり、かつ、基質のミオ・
イノシトールおよび補酵素のNAD+に対するKm値が非常に
低いために優れた反応性を有していることから、本酵素
を利用した極めて優れたミオ・イノシトール測定用試薬
を提供できる。また本発明の酵素は分離、精製中におけ
る失活も少なく、精製も容易であるので、ミオ・イノシ
トールデヒドロゲナーゼの製法として有利な製造法を提
供できる。
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、
これにより本発明を限定するものではない。
これにより本発明を限定するものではない。
実施例 １ バチルス・エスビーNo.3の培養 酵母エキス（極東製薬社製）２％、ペプトン（極東製
薬社製）２％、リン酸２カリウム（和光純薬社製）0.2
％、塩化カルシウム（和光純薬社製）0.02％、硫酸マグ
ネシウム（和光純薬社製）0.05％、ミオ・イノシトール
（和光純薬社製）２％、pH7.3を含む液体培地100mを5
00m容三角フラスコに分注し、120℃で20分間加熱滅菌
した後、これにバチルス・エスピーNo.3の１白金耳を接
種し、50℃で120r.p.m.の振とう培養器で30時間培養し
て種母85mｌ（酵素活性1.2u/m）を得た。
薬社製）２％、リン酸２カリウム（和光純薬社製）0.2
％、塩化カルシウム（和光純薬社製）0.02％、硫酸マグ
ネシウム（和光純薬社製）0.05％、ミオ・イノシトール
（和光純薬社製）２％、pH7.3を含む液体培地100mを5
00m容三角フラスコに分注し、120℃で20分間加熱滅菌
した後、これにバチルス・エスピーNo.3の１白金耳を接
種し、50℃で120r.p.m.の振とう培養器で30時間培養し
て種母85mｌ（酵素活性1.2u/m）を得た。
一方、上記と同様の培地組成にて消泡剤としてディス
フォーム442（日本油脂）を0.1％添加した液体培地20L
を30L容ジャーファメンターに仕込み、加熱滅菌した後
に上記の種母85mを移植し、培養温度50℃、通気量20L
/分、内圧0.4kg/cm2、撹拌速度150r.p.m.で24時間通気
培養し、培養物18.0L（酵素活性0.8u/m）を得た。
フォーム442（日本油脂）を0.1％添加した液体培地20L
を30L容ジャーファメンターに仕込み、加熱滅菌した後
に上記の種母85mを移植し、培養温度50℃、通気量20L
/分、内圧0.4kg/cm2、撹拌速度150r.p.m.で24時間通気
培養し、培養物18.0L（酵素活性0.8u/m）を得た。
実施例 ２ 実施例１で得た培養物を遠心分離で集菌し、これに0.
1％リゾチーム（エーザイ社製）を含む20mMリン酸緩衝
液（pH7.5）5Lを加え、37℃で１時間インキュベイトし
た後、遠心分離して沈澱物を除去し、上清4.5L（6u/m
）を得た。この上清にアセトンを1.8L添加撹拌し、生
じた沈澱物を遠心分離して集め、これを20mMリン酸緩衝
液で溶解し1Lの粗酵素液（24.2u/m）を得た。この溶
液に固形硫安を200g溶解し、生じた沈澱物を遠心分離し
て除去し、得られた上清に再び固形硫安を250g溶解し
た。この処理液を遠心分離して得られた沈澱物を20mMリ
ン酸緩衝液（pH7.5）で溶解し、500mの酵素液（36.3u
/m）を得た。この酵素液を透析膜（三光純薬社製）を
用いて20Lの20mMリン酸緩衝液（pH7.5）に対して一晩透
析し、得られた酵素液を20mMリン酸緩衝液（pH7.5）で
緩衝化したDEAE−セファロースCL−6B（ファルマシア）
250mのカラムに通し、0.1M KClを含む20mMリン酸緩
衝液（pH7.5）1Lを流した後、次いで0.3M KClを含む20
mMリン酸緩衝液（pH7.5）で溶出し、酵素液350m（35.
2u/m）を得た。得られた酵素液を10mMリン酸緩衝液
（H7.0）20Lに対して一晩透析した。こうして得られた
酵素液に牛血清アルブミン（シグマ社製）を0.2g溶解し
た後に凍結乾燥して、凍結乾燥標品1.1g（10.6u/mg）を
得た。
1％リゾチーム（エーザイ社製）を含む20mMリン酸緩衝
液（pH7.5）5Lを加え、37℃で１時間インキュベイトし
た後、遠心分離して沈澱物を除去し、上清4.5L（6u/m
）を得た。この上清にアセトンを1.8L添加撹拌し、生
じた沈澱物を遠心分離して集め、これを20mMリン酸緩衝
液で溶解し1Lの粗酵素液（24.2u/m）を得た。この溶
液に固形硫安を200g溶解し、生じた沈澱物を遠心分離し
て除去し、得られた上清に再び固形硫安を250g溶解し
た。この処理液を遠心分離して得られた沈澱物を20mMリ
ン酸緩衝液（pH7.5）で溶解し、500mの酵素液（36.3u
/m）を得た。この酵素液を透析膜（三光純薬社製）を
用いて20Lの20mMリン酸緩衝液（pH7.5）に対して一晩透
析し、得られた酵素液を20mMリン酸緩衝液（pH7.5）で
緩衝化したDEAE−セファロースCL−6B（ファルマシア）
250mのカラムに通し、0.1M KClを含む20mMリン酸緩
衝液（pH7.5）1Lを流した後、次いで0.3M KClを含む20
mMリン酸緩衝液（pH7.5）で溶出し、酵素液350m（35.
2u/m）を得た。得られた酵素液を10mMリン酸緩衝液
（H7.0）20Lに対して一晩透析した。こうして得られた
酵素液に牛血清アルブミン（シグマ社製）を0.2g溶解し
た後に凍結乾燥して、凍結乾燥標品1.1g（10.6u/mg）を
得た。
参考例 １ 公知の生産菌によるミオ・イノシトールデヒドロゲナ
ーゼの製造および性質の比較： Klebsiella pneumoniae IFO12019、Aerobacter aer
ogenes IFO12979およびSerratia marcescens ATCC1388
0の培養：ペプトン（極東製薬社製）;5g/、肉エキス
（Difco.）;5g/、塩化ナトリウム（和光純薬社製）;5
g/、ミオ・イノシトール（和光純薬社製）;10g/;pH
7.0を含む液体培地100mを500m容三角フラスコに分
注し、120℃、20分間加熱滅菌した後に、上記３株をそ
れぞれ１白金耳接種し、37℃、100r.p.m.の振とう培養
器で48時間培養した後に、遠心分離で集菌し、20mMリン
酸カリウム緩衝液pH7.0に懸濁し超音波破砕器（久保田
製作所製）を用いて180W、10分間ソニケィションした後
に15000r.p.m.、15分間遠心分離して上清を得た。それ
ぞれの上清の活性を前記（10）ミオ・イノシトールデヒ
ドロゲナーゼ活性測定法で測定した。
ーゼの製造および性質の比較： Klebsiella pneumoniae IFO12019、Aerobacter aer
ogenes IFO12979およびSerratia marcescens ATCC1388
0の培養：ペプトン（極東製薬社製）;5g/、肉エキス
（Difco.）;5g/、塩化ナトリウム（和光純薬社製）;5
g/、ミオ・イノシトール（和光純薬社製）;10g/;pH
7.0を含む液体培地100mを500m容三角フラスコに分
注し、120℃、20分間加熱滅菌した後に、上記３株をそ
れぞれ１白金耳接種し、37℃、100r.p.m.の振とう培養
器で48時間培養した後に、遠心分離で集菌し、20mMリン
酸カリウム緩衝液pH7.0に懸濁し超音波破砕器（久保田
製作所製）を用いて180W、10分間ソニケィションした後
に15000r.p.m.、15分間遠心分離して上清を得た。それ
ぞれの上清の活性を前記（10）ミオ・イノシトールデヒ
ドロゲナーゼ活性測定法で測定した。
それぞれの酵素液1mを試験管に分注し、35℃、40
℃、45℃、50℃、55℃、60℃で15分間加熱処理後、その
残存活性を活性測定法にしたがって測定した結果を第５
図に示す。
℃、45℃、50℃、55℃、60℃で15分間加熱処理後、その
残存活性を活性測定法にしたがって測定した結果を第５
図に示す。
Klebsiella;−○−、 Aerobacter;−△−、 Serratia ；−□− 参考例 ２ Cryptococcus melibiosum IFO1871株を用いてBioche
m.Biophys.Acta,293,295−303（1973）記載の培養条件
で培養した。ミオ・イノシトール（和光純薬社製）;0.5
％、Bacto−peptone（Difco.）;1％、Bacto−yeast ex
tract（Difco.）;0.5％、pH6.2を含む液体培地100mを
500m容三角フラスコに分注し、120℃、20分間加熱滅
菌した後に上記菌株を１白金耳接種し、25℃、100r.p.
m.の振とう培養器で48時間培養した後に遠心分離で集菌
し、20mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁し、超音波破砕
器（久保田製作所社製）を用いて180W、10分間ソニケィ
ションの後に15000r.p.m.、15分間遠心分離して上清（1
0m、21u/m）を得た。
m.Biophys.Acta,293,295−303（1973）記載の培養条件
で培養した。ミオ・イノシトール（和光純薬社製）;0.5
％、Bacto−peptone（Difco.）;1％、Bacto−yeast ex
tract（Difco.）;0.5％、pH6.2を含む液体培地100mを
500m容三角フラスコに分注し、120℃、20分間加熱滅
菌した後に上記菌株を１白金耳接種し、25℃、100r.p.
m.の振とう培養器で48時間培養した後に遠心分離で集菌
し、20mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁し、超音波破砕
器（久保田製作所社製）を用いて180W、10分間ソニケィ
ションの後に15000r.p.m.、15分間遠心分離して上清（1
0m、21u/m）を得た。
参考例 ３ 牛の脳を用いてBiochemical and Biophysica Rese
rch Communications,68,No.4,1133−1138（1976）記載
の方法で牛の脳100gよりホモジネイト、DEAE−cellulos
e、Sephadex Ｇ−100カラムクロマトグラフイーを用い
て精製酵素液（50m）を得た。しかし、文献中にも記
載されているように牛の脳の酵素はミオ・イノソースと
NADHよりミオ・イノシトールとNAD+を生成する方向に活
性が大きく傾いており、事実本精製酵素でもミオ・イノ
ソースからミオ・イノシトールの逆方向への活性は0.04
5u/m認められたが、正方向の活性はほとんど認められ
なかった。
rch Communications,68,No.4,1133−1138（1976）記載
の方法で牛の脳100gよりホモジネイト、DEAE−cellulos
e、Sephadex Ｇ−100カラムクロマトグラフイーを用い
て精製酵素液（50m）を得た。しかし、文献中にも記
載されているように牛の脳の酵素はミオ・イノソースと
NADHよりミオ・イノシトールとNAD+を生成する方向に活
性が大きく傾いており、事実本精製酵素でもミオ・イノ
ソースからミオ・イノシトールの逆方向への活性は0.04
5u/m認められたが、正方向の活性はほとんど認められ
なかった。
ミオ・イノソースとNADHからミオ・イノシトールとNA
D+を生成する活性の活性測定法 反応液組成 100mM トリス塩酸緩衝液（pH8.5） 10mM ミオ・イノソース（シグマ社製） 0.3mM NADH 活性測定法 上記反応液1mを石英セルに分注し、37℃で２分間イ
ンキュベイトした後に酵素液（前記参考例２および３）
0.05mお添加し、NADHのA340nmにおける減少を測定す
る。
D+を生成する活性の活性測定法 反応液組成 100mM トリス塩酸緩衝液（pH8.5） 10mM ミオ・イノソース（シグマ社製） 0.3mM NADH 活性測定法 上記反応液1mを石英セルに分注し、37℃で２分間イ
ンキュベイトした後に酵素液（前記参考例２および３）
0.05mお添加し、NADHのA340nmにおける減少を測定す
る。
それぞれの酵素1mを試験管に分注し、35℃、40℃、
45℃、50℃で15分間加熱処理後、その残存活性を参考例
におけるCryptococcus由来の酵素については（10）の活
性測定法に従って測定し、牛の脳由来の酵素については
前述の活性測定法に従って測定した結果は第５図に示し
た。
45℃、50℃で15分間加熱処理後、その残存活性を参考例
におけるCryptococcus由来の酵素については（10）の活
性測定法に従って測定し、牛の脳由来の酵素については
前述の活性測定法に従って測定した結果は第５図に示し
た。
Cryptococcus melibiosum;−●− 牛の脳；−■− 参考例 ４ The Journal of Biological Chemistry,254（1
6）,p7690,1979の文献に記載されているように公知のバ
チルス サブチリス（Bacillus subtilis）由来のイノ
シトールデヒドロゲナーゼの41℃における熱安定性の実
験結果は、第６図に示される通りである。第６図におい
て、 をそれぞれ示す。この実験結果から明らかなように41℃
において、バチルス サブチリス由来の酵素はリン酸緩
衝液およびトリス−塩酸緩衝液において不安定であるこ
とが認められる。同様の実験を60℃まで熱安定性に優れ
た本発明の酵素を用いて行ったところ、前記いずれの条
件においても100％の活性を保持し、文献酵素と比べて
非常に安定な酵素、すなわち耐熱性酵素であることが認
められた。
6）,p7690,1979の文献に記載されているように公知のバ
チルス サブチリス（Bacillus subtilis）由来のイノ
シトールデヒドロゲナーゼの41℃における熱安定性の実
験結果は、第６図に示される通りである。第６図におい
て、 をそれぞれ示す。この実験結果から明らかなように41℃
において、バチルス サブチリス由来の酵素はリン酸緩
衝液およびトリス−塩酸緩衝液において不安定であるこ
とが認められる。同様の実験を60℃まで熱安定性に優れ
た本発明の酵素を用いて行ったところ、前記いずれの条
件においても100％の活性を保持し、文献酵素と比べて
非常に安定な酵素、すなわち耐熱性酵素であることが認
められた。
【図面の簡単な説明】 第１図は本発明のミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ
の熱安定性を示す曲線、第２図はその至適温度を示す曲
線、第３図はそのpH安定性を示す曲線、第４図はその至
適pHを示す曲線、第５図は本発明のミオ・イノシトール
デヒドロゲナーゼの熱安定性を示す曲線であり、第６図
は公知のバチルス サブチリス由来のイノシトールデヒ
ドロゲナーゼの41℃における熱安定性を示す曲線であ
る。
の熱安定性を示す曲線、第２図はその至適温度を示す曲
線、第３図はそのpH安定性を示す曲線、第４図はその至
適pHを示す曲線、第５図は本発明のミオ・イノシトール
デヒドロゲナーゼの熱安定性を示す曲線であり、第６図
は公知のバチルス サブチリス由来のイノシトールデヒ
ドロゲナーゼの41℃における熱安定性を示す曲線であ
る。
Claims (4)
- 【請求項１】基質特異性として少なくともミオ・イノシ
トールに基質特異性を有し、酵素作用として下記式 ミオ・イノシトール＋NAD+ミオ・イノソース＋NADH＋
H+ に示すように少なくともミオ・イノシトールおよびNAD+
からミオ・イノソースおよびNADH＋H+を生成する反応を
触媒するミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼにおい
て、 60℃における残存活性が95％以上であること、ミオ・イ
ノシトールに対するKm値が約0.64mMであること、NAD+に
対するKm値が約0.004mMであること、分子量が130,000±
15,000（TSKゲルG3000SWによる濾過法）、及び至適pHが
pH9.5付近であること、 とを有することを特徴とするミオ・イノシトールデヒド
ロゲナーゼ。 - 【請求項２】少なくとも下記の理化学的性状を有する請
求項１記載のミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ。 分子量 :130,000±15,000（TSKゲルG3000SWによる
濾過法） 等電点 :pH4.5±0.5 至適pH :pH9.5付近 pH安定性 :pH6.5〜9.0で80％以上の残存活性を有す
る。 - 【請求項３】請求項１のミオ・イノシトールデヒドロゲ
ナーゼにおいて、バチルス属に属するミオ・イノシトー
ルデヒドロゲナーゼ生産菌を培地に培養し、得られた培
養物からミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを採取す
ることを特徴とするミオ・イノシトールデヒドロゲナー
ゼの製造法。 - 【請求項４】請求項１のミオ・イノシトールデヒドロゲ
ナーゼにおいて、バチルス属に属するミオ・イノシトー
ルデヒドロゲナーゼ生産菌が、バチルス・エスピーNo.3
〔微工研条寄第3013号（FERM BP−3013）〕である請求
項３記載の製造法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24977590A JP2984043B2 (ja) | 1990-09-18 | 1990-09-18 | ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
| EP95110124A EP0682119B1 (en) | 1990-09-18 | 1991-09-18 | Myo-inositol dehydrogenase |
| DE69120489T DE69120489T2 (de) | 1990-09-18 | 1991-09-18 | Hochsensitives Testverfahren für Myo-Inositol und Komposition zur Ausführung davon |
| DE69130961T DE69130961T2 (de) | 1990-09-18 | 1991-09-18 | Myo-Inositoldehydrogenase |
| AT91308520T ATE139801T1 (de) | 1990-09-18 | 1991-09-18 | Hochsensitives testverfahren für myo-inositol und komposition zur ausführung davon |
| AT95110124T ATE177153T1 (de) | 1990-09-18 | 1991-09-18 | Myo-inositoldehydrogenase |
| EP91308520A EP0477001B1 (en) | 1990-09-18 | 1991-09-18 | Highly sensitive assay method for myo-inositol and composition for practicing same |
| US08/106,693 US5356790A (en) | 1990-09-18 | 1993-08-16 | Highly sensitive assay method for myo-inositol, composition for practicing same, novel myo-inositol dehydrogenase, and process for producing same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24977590A JP2984043B2 (ja) | 1990-09-18 | 1990-09-18 | ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04126075A JPH04126075A (ja) | 1992-04-27 |
| JP2984043B2 true JP2984043B2 (ja) | 1999-11-29 |
Family
ID=17198042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24977590A Expired - Lifetime JP2984043B2 (ja) | 1990-09-18 | 1990-09-18 | ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2984043B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US7521481B2 (en) | 2003-02-27 | 2009-04-21 | Mclaurin Joanne | Methods of preventing, treating and diagnosing disorders of protein aggregation |
| CA2542560C (en) | 2003-10-14 | 2012-07-10 | Hokko Chemical Industry Co., Ltd. | Method for producing scyllo-inositol |
| PL2148667T3 (pl) | 2007-04-12 | 2013-11-29 | Waratah Pharmaceuticals Inc | Stosowanie pochodnych cycloheksanoheksolu w leczeniu chorób oczu |
| WO2017029353A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Transition Therapeutics Ireland Limited | Treatment of behaviors in dementia patients |
-
1990
- 1990-09-18 JP JP24977590A patent/JP2984043B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04126075A (ja) | 1992-04-27 |
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