DE69130961T2

DE69130961T2 - Myo-Inositoldehydrogenase

Info

Publication number: DE69130961T2
Application number: DE69130961T
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Tagata-Gun Shizuoka Imamura; Kazuo Tagata-Gun Shizuoka Matsuura; Hideo Tagata-Gun Shizuoka Misaki; Mamoru Sunto-Gun Shizuoka Takahashi; Shigeru Tagata-Gun Shizuoka Ueda
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd; Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-09-18
Filing date: 1991-09-18
Publication date: 1999-08-12
Anticipated expiration: 2011-09-19
Also published as: DE69120489T2; EP0682119A1; EP0477001B1; EP0477001A3; DE69130961D1; ATE139801T1; EP0682119B1; US5356790A; EP0477001A2; ATE177153T1; DE69120489D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Myoinositoldehydrogenase, auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung, auf einen Bacillus, der fähig ist, sie zu produzieren, und auf eine Kultur des Bacillus.
Myoinositol ist eines der neun Isomeren von Inositol und ist ein stabiler cyclischer Alkohol. Bei Menschen wird Myoinositol in einer Menge von etwa 1 g pro Tag durch die täglichen Mahlzeiten und etwa 2 g durch Nieren-Biosynthese zugeführt.
Die Blutkonzentration an Myoinositol wird durch ein Gleichgewicht zwischen Aufnahme in Zellen und Nierenausscheidung, Rückresorption und Oxidation auf eine konstante Konzentration reguliert.
Die Plasmakonzentration an Myoinositol wird durch eine Nierenfunktionsstörung erhöht [Clinical Chem., 24(11); 1448-1455 (1988)]. Die Nierenfunktion kann durch Meßung der Myoinositol-Konzentration im Blut überwacht werden.
Bisher wurde die Myoinositol-Menge in einer Probe durch Gaschromatographie und Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gemessen. Die Meßverfahren haben eine Reihe von Nachteilen, z. B. muß die Probe vorher behandelt werden und der Vorgang erfordert eine komplizierte Behandlung. Daher waren große Untersuchungsreihen für die klinische Chemie unmöglich.
Die normale Standard-Konzentration an Myoinositol im Blutplasma ist ziemlich niedrig, z. B. etwa 30 umol/l [Proceedings of Japan Clinical Chemistry Annual Meeting Nr. 28 (1988)]. Es wird ein einfaches und hochempfindliches Analyseverfahren gefordert.
Bekannt ist ein enzymatisches Cycling-Verfahren zur Analyse von Spurenmengen an Substraten oder der Enzymaktivität, in dem zwei Enzym-Typen zur Verstärkung der Empfindlichkeit verwendet werden. Darunter sind NAD-Cycling, CoA-Cycling und ATP-Cycling bekannt, werden aber wegen der komplizierten Arbeitsweise fast nie auf Routine-Analysenverfahren in der klinischen Chemie angewendet.
Myoinositoldehydrogenasen werden von den folgenden Mikroorganismen produziert (beschrieben im Enzyme Handbook (Asakura Publishing Co., Tokio)):
Aerobacter aerogenes [J. Biol. Chem., 241, 800-806 (1966)]; Klebstella pneumoniae, Serratia marcescens, Cryptococcus melibiosum [Biochim, Biophys, Acta., 293, 295-303 (1973)]; und Rindergehirn [Biochem., Biophys. Res. Comm., 68, 1133-1138 (1976)]; Bacillus sp. Nr. 3 (Produkt von Toyo Jozo Co.).
Von diesen sind Aerobacter aerogenes, Klebstella pneumoniae und Serratia marcescens als ätiologische Mikroorganismen für Pneumonie und opportunistische Infektionen (Standard Microbiology., S. 209-212, Igaku Shoin Publ., Tokyo) mit einer härtnäckigen Infektion, die gegenüber Chemotherapeutika und Antibiotika resistent ist, bekannt. Ein Kultivieren dieser Mikroorganismen im industriellen Maßstab ist praktisch unmöglich. Der Km-Wert von Myoinositoldehydrogenase, die durch die Hefe Cryptococcus melibiosum produziert wird, ist für Myoinositol etwa 11,0 mM und etwa 0,07 mM für NAD. Diese Km-Werte sind zu hoch, um eine ausreichende Reaktionsgeschwindigkeit in einer enzymatischen Cycling-Analyse zu erreichen (Enzyme Handbook, S. 6).
Ramaley et al. (J. Biol. Chem., 254, 7684-7690) offenbaren die Reinigung und Eigenschaften von Bacillus subtilis- Inositoldehydrogenase. Das Enzym hat ein scheinbares Molekulargewicht von 155 000 bis 160 000, das durch Saccharose- Dichtegradientenzentrifugation bestimmt wird, und besteht aus vier Untereinheiten, die jeweils ein Molekulargewicht von 39 000 haben, das durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese bestimmt wird. Der isoelektrische Punkt des Enzyms ist 4, 4, bestimmt durch isoelektrische Fokussierung an einer Säule. Das Enzym zeigt mit Myoinositol als Substrat den höchsten Vmax-Wert und niedrigsten Km Wert, reagiert aber nicht mit Scylloinositol; es reagiert auch mit dem α-Anomer (nicht aber mit dem β-Anomer) von D-Glucose und mit D-Xylose.
Wir haben eine neue Myoinositoldehydrogenase (EC.1.1.1.18) gefunden, die in einer Cycling-Reaktion mit Coenzymen der Thio-NADP-Gruppe verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Myoinositoldehydrogenase, die die folgenden Eigenschaften aufweist:
(1) Sie weist Substratspezifität für Myoinositol auf und katalysiert die Reaktion:
Myoinositol + NAD Myoinosose + reduziertes NADH.
(2) Molekulargewicht: 130 000 ± 15 000 (Gelfiltrationsverfahren mit TSK-Gel G 3000 SW).
(3) isoelektrischer Punkt: pH 4,5 ± 0,5
(4) Km-Wert:
Km-Wert für Myoinositol: 0,64 mM
Km-Wert für NAD: 0,004 mM
(5) optimalter pH: etwa 9,5
(6) pH-Stabilität: mehr als 80% Restaktivität bei einem pH von 6,5 bis 9,0.
(7) Hitzestabilität: mehr als 95% Restaktivität bei Temperaturen von bis zu 60ºC.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer Myoinositoldehydrogenase der Erfindung bereit, das das Züchten eines Myoinositoldehydrogenase-produzierenden Mikroorganismus, der Bacillus sp. Nr. 3 (FERM BP-3013) oder eine Mutante davon ist, und Isolieren der Myoinositoldehydrogenase aus der Kulturmasse umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Bacillus sp. Nr. 3 (FERM BP-3013) oder eine Mutante davon bereit, der (die) fähig ist, erfindungsgemäße Myoinositoldehydrogenase zu produzieren.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich eine Kultur von Bacillus sp. Nr. 3 (FERM BP-3013) oder einer Mutante davon bereit, die eine Myoinositoldehydrogenase gemäß der Erfindung in einem Kulturmedium produzieren kann, das eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff, eine Quelle von assimilierbarem Stickstoff und Mineralsalze enthält und das frei von anderen Mikroorganismen ist.
Die Myoinositoldehydrogenase der Erfindung kann in einem Verfahren zur Untersuchung einer Probe auf Myoinositol verwendet werden, umfassend Umsetzen der Probe mit:
a) der Myoinositoldehydrogenase unter Verwendung einer der Gruppen, der Thionicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat- Gruppe (Thio-NDAP-Gruppe) oder der Thionicotinamid-Adenin- Dinukleotid-Gruppe (Thio-NAD-Gruppe), und einer der Gruppen, der Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Gruppe (NADP- Gruppe) oder der Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Gruppe (NAD- Gruppe) als Coenzyme,
b) A&sub1;, und
c) B&sub1;;
unter Durchführung der Cycling-Reaktion:
worin
A&sub1; eine Verbindung mit der Thio-NADP-, Thio-NAD-, NADP- oder NAD-Gruppe ist,
A&sub2; eine reduzierte Form von A&sub1; ist,
B&sub1; eine Verbindung mit der reduzierten NADP oder der reduzierten NADP-Gruppe ist, wenn A&sub1; Thio-NADP oder eine Verbindung mit Thio-NAD-Gruppe ist, oder B&sub1; eine Verbindung mit reduzierter Thio-NADP- oder mit reduzierter Thio-NAD- Gruppe ist, wenn A&sub1; eine Verbindung mit NADP- oder mit NAD- Gruppe ist, und
B&sub2; eine oxidierte Form B&sub1; ist; und
Messen der Menge an A&sub2; oder B&sub1;, die in der Cycling-Reaktion erzeugt oder verbraucht wird.
Diese Analysenverfahren hängt von der Differenz der maximalen Absorption einer reduzierten Thio-NAD(P)-Gruppe, die ein Analogon von NAD(P) ist, bei etwa 40 nm und der einer reduzierten NAD(P)-Gruppe bei etwa 340 nm ab. In der enzymatischen Cycling-Reaktion unter Verwendung von Myoinositoldehydrogenase wird eine Thio-NAD(P)-Gruppe als eines der zwei Coenzyme verwendet, und die Änderung in der Menge eines der Coenzyme wird gemessen, beispielsweise durch die Differenz der maximalen Absorptionen beider reduzierter Coenzyme. Auf diese Weise kann die Menge an Myoinositol in einer Probe am genausten gemessen werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1: Hitzestabilität der neuen Myoinositoldehydrogenase.
Fig. 2: optimale Temperatur der Myoinositoldehydrogenase.
Fig. 3: pH-Stabilität der Myoinositoldehydrogenase.
Fig. 4: optimaler pH der Myoinositoldehydrogenase.
Fig. 5 bis 8: Bestimmungskurve für Myoinositol.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wir haben Reihenuntersuchungen nach nicht-infektiösen Mikroorganismen durchgeführt, die eine Myoinositoldehydrogenase produzieren können, welche auf Substrat aus Myoinositol und NAD höhere Aktivität und einen niedrigen Km-Wert hat, stabil ist und einfach gereinigt wird. Wir haben einen Mikroorganismus aus einer Bodenprobe einer Fläche mit heißem Frühling, Atagawa, Higashi-Izu-cho, Kamo-gun, Shizuoka-ken, Japan, isoliert, der Bacillus sp. Nr. 3 genannt wird.
Myoinositoldehydrogenase, die von Bacillus sp. Nr. 3 produziert wird, hat für Myoinositol und NAD bei pH 8,5 niedrige Km-Werte von etwa 0,6 mM bzw. 0,04 mM bei hoher Reaktivität. Darüber hinaus ist die Restaktivität nach 15-minütiger Behandlung bei 60ºC in Pufferlösung über etwa 95%. Die Myoinositoldehydrogenase ist ein neues Enzym, das mit einer Coenzym-NAD(P)-Gruppe oder einer Thio-NAD(P)-Gruppe wirken kann.
Die neue Myoinositoldehydrogenase kann auch hergestellt werden, indem das Enzym aus anderen Myoinositoldehydrogenase produzierenden Mikroorganismen isoliert wird, die zur Gattung Bacillus gehören.
Der vorliegende Myoinositoldehydrogenase-produzierende Mikroorganismus, Bacillus sp. Nr. 3 gehört zu der Gattung Bacillus und ist ein bevorzugter Mikroorganismus.
Die taxonomischen Eigenschaften dieses Stamms sind wie folgt:
(a) Morphologische Eigenschaften:
Runde Ecken bei geradem oder leicht gebogenem Bacillus. Die Größen sind 0,5 bis 0,7 · 1,5 bis 3,5 um. Peritrikale Bewegung. Sporenbildungen in einer Ecke oder Unterecke mit Größen von 0,8 · 1,0 bis 2,0 um der elliptischen bis ovalen Sporen werden beobachtet. Mikrobielle Zellen sind durch Sporen aufgequollen. Kein Polymorphismus.
(b) Wachstum auf verschiedenen Medien:
Beobachtungen bei verschiedenen Medien nach 1- bis 2-tätiger Kultur bei 50 bis 52ºC sind wie folgt:
1. Nährmedium auf Agarplatte: runde und konvexe Kolonien. Glatte feuchte Oberfläche mit runden Ecken. Ockerfarben oder schwach ockerfarben. Keine Bildung von löslichem Pigment.
2. Nährmedium auf Agar-Schrägkultur: gutes Wachstum mit Filiformen. Ockerfarben bis schwach ockerfarben. Keine Bildung von löslichem Pigment.
3. Flüssiges Medium (wäßrige Pepton): gutes Wachstum mit einheitlicher Trübung.
4. Lackmus-Milchmedium: nach 4 bis 5 Tagen schwach sauer. GC Mol-% in DNA: 41,9 Mol-% (HPLC-Verfahren).
Hauptsächlich isoprenoides Chinon: MK -7.
(c) Physiologische Eigenschaften: (+ = positiv; (+) = schwach positiv, - = negativ, NT = nicht untersucht)
Gram-Farbstoff +
KOH-Reaktion -
Kapselbildung -
Säurebeständigkeit des Farbstoffs -
OF-Test (High Leifson) NT
OF-Test (Stickstoffquelle: NH&sub4;H&sub2;PO&sub4;) F
Aerobes Wachstum +
Anaerobes Wachstum +
Wachstumstemperatur 70ºC - 60ºC + 37ºC + 30ºC -

Halotolerante NaCl-Konz. %

0% +
3% +
5% -

Wachstums-pH

pH 5,6 -
pH 6,2 +
pH 9,0 +
Gelatinehydrolyse -
Stärkehydrolyse (+)
Caseinhydrolyse -
Äsculinhydrolyse +
Cellulosehydrolyse -
Tyrosinhydrolyse -
Argininhydrolyse -
Katalase-Produktion +
Oxidase-Produktion +
Lecithase-Produktion -
Urease-Produktion (SSR) -
Urease-Produkt (Chris) -
Indol-Produktion -
H&sub2;S-Produkt (Nachweis: Bleiacetat-Papier) -
Acetoin-Produktion (K&sub2;HPO&sub4;) -
Acetoin-Produktion (NaCl) -
MR-Test -

Nitrat-Reduktion

Gasnachweis -
NO&sub2;&supmin; -
NO&sub3;&supmin; +

Verwendung von Simmons-Medium

Citrat -
Malat -
Maleat -
Malonat -
Propionat -
Gluconat -
Suczinat -

Verwendung von Christenssen-Medium

Citrat +
Malat -
Maleat -
Malonat -
Propionat +
Gluconat -
Suczinat -
Gasproduktion aus Glucose -

Säurebildung aus Zucker

Adonit -
L-(+)-Arabinose -
Cellobiose +
Dulcit -
Meso-Erythrit -
Fructose +
Fucose +
Galactose +
Glucose +
Glycerin +
Inositol +
Inulin +
Lactose +
Maltose +
Mannit +
Mannose +
Melezitose -
Melibiose +
Raffinose -
Rhamose +
D-Ribose +
Salizin +
L-Sorbose -
Sorbit -
Stärke +
Saccharose +
Xylose -
Trehalose +
Nach den obigen taxonomischen Eigenschaften zeigt der Mikroorganismus die spezifischen Merkmale von Gram-positivem Bacillus, denn er hat eine Größe von 0,5 bis 0,7 · 1,5 bis 3,3 um, hat eine peritrichale Bewegung, hat Sporenbildung ohne Polymorphismus, begünstigt fermentative Zersetzung von Glucose und Säurebildung, ist Katalase-positiv und Oxidasepositiv und ist thermophil und ist ein fakultativer Anaerobier.
Ein Gram-positiver Bacillus, der die spezifischen Eigenschaften der Sporenbildung und des aeroben Wachstums zeigt, ist ein Stamm, der zu der Gattung Bacillus gehört.
In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 2, werden die folgenden neun Arten von Bacillus mit Wachstum bei hoher Temperatur (50ºC) erläutert:
Bacillus acidocaldarius, B. subtilis, B. badius, B. brevis, B. coagulans, B. licheniformis, B. pantothenticus, B. schegelli und B. stearothermophilus.
Unter diesen sind B. coagulance und B. licheniformis Mikroorganismen, die unter anaeroben Bedingungen wachsen.
Die taxonomischen Eigenschaften von Bacillus werden nachfolgend im Vergleich mit denen des vorliegenden Stammes in Übereinstimmung mit Bergey's Mannual erläutert, indem sie mit Bacillus coagulans (im folgenden C genannt) und Bacillus licheniformis (nachfolgend L genannt) verglichen werden:
+ = positiv
(+) = schwach positiv
- = negativ
d = nicht identifiziert als + oder -
ND = keine Daten
Nach dem obigen Vergleich hat der vorliegende Stamm Nr. 3 mit Bacillus coagulans viele identische Eigenschaften, hat aber spezifische Differenzen hinsichtlich der Acetoin-Produktion und GC-Mol-% in DNA. Außerdem sind die Beobachtungen bei Lackmus-Milchmedium unterschiedlich (im obigen Vergleich nicht erwähnt).
Dementsprechend wurde der vorliegende Stamm Bacillus sp. Nr. 3 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute hinterlegt; ihm wurde die Hinterlegungs-Nr. FERM BP-3013 zugeteilt.
Erfindungsgemäß wird die Herstellung des Enzyms Myoinositoldehydrogenase durch Kultivieren eines Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus gehört, in einem geeigneten Medium erreicht.
Ein bevorzugtes Beispiel für den obigen Myoinositoldehydrogenase-produzierenden Mikroorganismus ist Bacillus sp. Nr. 3. Da toxonomische Eigenschaften von Bakterien im allgemeinen einfach verändert werden, können in der vorliegenden Erfindung natürliche Varianten oder künstliche Mutanten, die durch herkömmliche künstliche Mutationsbehandlung beispielsweise Ultraviolettbestrahlung, Bestrahlung oder ein Mutagen wie z. B. N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin und Ethylmethansulfonat hergestellt werden und die zu der Gattung Bacillus gehören, die eine Myoinositoldehydrogenase gemäß der vorliegenden Erfindung produzieren, eingesetzt werden.
Der obige Mikroorganismus kann bei herkömmlichen Kultubedingungen für Bakterien kultiviert werden. Da Myoinositoldehydrogenase durch Myoinositol induzierbar ist, wird im Fall der Enzymherstellung aus Bacillus sp. Nr. 3 die Kultur vorzugsweise in einem Medium durchgeführt, das 0,5 bis 5% Myoinositol enthält, was bewirkt, daß 10- bis 300-mal mehr Myoinositoldehydrogenase produziert wird.
Als Beispiele für ein anderes Medium als Myoinositol kann ein Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoff-Quelle, eine verdaubare Stickstoff-Quelle und, falls erforderlich, anorganische Salze enthält, verwendet werden.
Beispiele für die Kohlenstoff-Quellen sind Glucose, Fructose oder Saccharose, die in Kombination oder einzeln verwendet werden können. Beispiele für verdaubare Stickstoff-Quellen sind Pepton, Fleischextrakt oder Hefeextrakt, die in Kombination oder einzeln verwendet werden können. Außerdem können nach Bedarf Phosphat, Magnesiumsalz, Calciumsalz, Kaliumsalz, Natriumsalz oder verschiedene Schwermetallsalze wie Eisen(III)-salz oder Mangansalz zugesetzt werden. Es können auch andere bekannte assimilierbare Kohlenstoff-Quellen und verdaubare Stickstoffsalze verwendet werden.
Ein Kultivieren kann durch Schüttelkultur oder Belüftungskultur unter Rühren erfolgen, zur industriellen Produktion ist eine Tieftankkultur unter Rühren vorteilhaft. Die Kulturtemperatur kann innerhalb des Bereichs, in dem das Enzym produziert wird, verändert werden, und liegt im allgemeinen zwischen 40 und 60ºC, vorzugsweise bei etwa 50ºC.
Die Kulturzeit hängt von den Bedingungen der Kultur ab und kann für eine maximale Produktion des Enzyms eingestellt werden; sie liegt im allgemeinen bei 1 bis 2 Tagen.
Die Zusammensetzung des Mediums, die Bedingungen des Mediums, die Kulturtemperatur, die Rührgeschwindigkeit und die Luftströmungsgeschwindigkeit sollten natürlich so eingestellt werden, daß sie vorteilhafte Bedingungen für eine Enzym- Produktion darstellen. Wenn erforderlich, können auch Antischaummittel, z. B. Siliconöl und planzliches Öl zugesetzt werden.
Da die auf diese Weise produzierte Myoinositoldehydrogenase als Enzym innerhalb der Bakterienzellen vorliegt, werden kultivierte Zellen mit Hilfe von Filtration oder Zentrifugation gesammelt, dann werden die Bakterienzellen durch mechanische Zerstörung wie z. B. Ultraschall, französische Druckbehandlung, Behandlung mit Glasperlen oder Gefrieren- Auftauen, oder durch enzymatische Verdauung, z. B. Lysozym- Behandlung unter Erhalt eines Rohextraktes gebrochen.
Ferner kann gereinigte Myoinositoldehydrogenase nach bekannten herkömmlichen Reinigungsverfahren der Isolierung von Protein oder Enzym erhalten werden. Das Enzym kann z. B. durch ein Aussalzungsverfahren durch Zusetzen von Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat zu dem Rohextrakt ausgefällt werden. Das ausgefällte Enzym kann durch eine Kombination von chromato graphischen Techniken unter Verwendung von Molekularsieben und Harz-Elektrophorese oder Ultrazentrifugation weiter gereinigt werden.
Die Reinigung kann unter Berücksichtigung der Natur der Myoinositoldehydrogenase unterstützt werden. So kann der obige Niederschlag, der in Wasser oder Pufferlösung aufgelöst ist, bei Bedarf dialysiert werden, wobei eine semipermeable Membran verwendet wird, und einer Chromatographie unterworfen werden, wobei Ionenaustauscherharze, z. B. DEAE-Cellulose*, DEAE-Sephacel*, DEAE-Sepharose*, DEAE-Sephädex*, Q-Sepharose* (Pharmacia Corp., Handelsbezeichnung), DEAE-Toyoperal* (Toso Corp.), oder Hydroxyapatit, hydrophobes Chromatographie-Harz wie z. B. Octyl-Sepharose oder Phenyl-Sepharose (Pharmacia Corp.) und andere Affinitäts-Chromatographie-Harze verwendet werden. Außerdem kann eine Molekularsieb-Chromatographie unter Verwendung eines Gelfiltrationsagenzes wie Sephadex G-100* oder Sephacryl S-200* durchgeführt werden. Wenn erforderlich kann auch eine Entsalzung mit Hilfe einer semipermeablen Membran durchgeführt werden. Eine Pulverpräparation aus gereinigter Myoinositoldehydrogenase kann durch Gefriertrocknung unter Zusatz von 0,05 bis 10% Stabilisierungsmittel, z. B. Zucker wie Mannit, Saccharose oder Sorbit, Aminosäuren wie z. B. Glutamat oder Glycin und Peptid wie z. B. Rinderalbumin hergestellt werden.
Typischerweise hat eine Myoinositoldehydrogenase der vorliegenden Erfindung die folgenden Eigenschaften.
*: Es wird angenommen, daß es sich um ein eingetragenes Warenzeichen in einem oder mehreren angegebenen Staaten handelt.

1. Substratspezifität:

Myoinositol 100%
Glucose 0
Fructose 0
Galactose 0
Sorbit 0
Mannose 0
Maltose 0
Saccharose 0
Lactose 0

2. Enzym-Wirkung:

Das Enzym katalysiert im wesentlichen eine Reaktion von Myoinositol und NAD unter Bildung von Myoinosose und reduziertem NADH, wie sie unten dargestellt ist:
Myoinositol + NAD Myoinosose * + reduziertes NADH *(2, 4, 6/3, 5-Pentahydroxycyclohexanon)

3. Molekulargewicht:

130 000 ± 15 000
Gemessen mit TSK-Gel G 3000 SW 8 (Toso Co., 0,75 · 60 cm).
Elution: 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,2 M NaCl enthält.
Standard: Es werden die folgenden Molekülmarker (Oriental Yeast Co.) verwendet:
Molekulargewicht: 12 400 Cytochrom C
Molekulargewicht: 32 000 Adenylatkinase
Molekulargewicht: 67 000 Rinderalbumin
Molekulargewicht: 142 000 Lactatdehydrogenase
Molekulargewicht: 290 000 Glutamatdehydrogenase

4. Isoelektrischer Punkt:

pH 4,5 ± 0,5
Gemessen durch Elektrofokussierung unter Verwendung eines Ampholit-Trägers bei 4ºC, 700 V, über 40 h. Die Aktivität einer Fraktion jedes Enzyms wird gemessen.
5. Km-Wert: 0,64 mM (Myoinositol), 0,004 mM (NAD)
Der Km-Wert für Myoinositol wird bei verschiedenen Myoinositol-Konzentrationen in einem Reaktionsgemisch aus:
100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5)
5 U Diaphorase (Toyo Jozo C.)
1 mM NAD (Oriental Yeast Co.)
0,025% NBT (Wako Pure Chem. Co.) gemessen.
In dem Reaktionsgemisch wird NAD durch 15 mM Myoinositol ersetzt und die Konzentration an NAD zur Messung des Km- Wertes für NAD verändert.
Die Resultate sind wie oben angegeben.
Außerdem wird in dem Reaktionsgemisch 1 mM NAD durch 1 mM Thio-NAD (Sigma Co.) ersetzt und dann der Km-Wert für Myoinositol gemessen). Das Resultat ist, wie es unten angegeben ist.
Km-Wert: 10,0 mM (Myoinositol)
Im Reaktionsgemisch wird 1 mM Thio-NAD durch 150 mM Myoinositol ersetzt und dann wird der Km-Wert für Thio-NAD gemessen.
Km-Wert: 0,17 mM (Thio-NAD).
Der Km-Wert in der Reaktion von NADP und Myoinositol wird gemessen. Die Resultate sind wie folgt:
Km-Wert: 0,19 mM (NADP)
Km-Wert: 30,91 mM (Myoinositol)
Die Km-Werte in der Reaktion des Thio-NADP und Myoinositol sind wie folgt.
Km-Wert: 2,54 mM (Thio-NADP)
Km-Wert: 179,62 mM (Myoinositol)
Wie oben ganz klar dargelegt wurde, kann das vorliegende Enzym unter Verwendung von NAD(P) und Thio-NAD(P) als Coenzyme umgesetzt werden.
6. Optimaler pH:
In einem Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität, wie es nachfolgend erläutert wird, werden 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) im Reaktionsgemisch durch 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,5-8,0, -O-), 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,9-9,0, - -) und 100 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0 bis 10,0, - -) ersetzt und inkubiert. Die Resultate sind in Fig. 4 dargestellt.
Eine maximale Aktivität wird bei etwa pH 9,5 beobachtet.

pH-Stabilität:

Die Restaktivität des Enzyms (1 U/ml, 40 mM-Pufferlösung) wird in verschiedenen Pufferlösungen, d. h. Acetat-Puffer (pH 4, 5 bis 6,0 - -); Phosphatpuffer (pH 6,0 bis 8,0, -O-); Tris-HCl-Puffer (pH 8,0 bis 9,5, - -) und Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0 bis 10, - -) nach 15-minütigem Erwärmen auf 50ºC gemessen. Das Enzym ist bei pH 6,5 bis 9,0 bei einer Restakti vität von über 80% stabil, wie es in Fig. 3 dargestellt ist.

8. Hitzestabilität:

Das Enzym, das unter Herstellung einer 1 U/ml-Lösung in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) aufgelöst ist, wird bei verschiedenen Temperaturen 15 min inkubiert, dann wird die Restaktivität gemessen.
Die Resultate sind die, wie sie in Fig. 1 dargestellt sind. Das Enzym ist bis zu 60ºC, vorzugsweise bis zu 65ºC stabil, wobei eine Restaktivität von über 95% aufrecht erhalten wird.

9. Optimale Temperatur:

Die Enzym-Aktivität wird nach dem Untersuchungsverfahren, das nachfolgend erläutert wird, bei 35, 40, 50, 55, 60 bzw. 65ºC in 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) gemessen. Die Reaktion wurde in jedem Fall nach 10-minütiger Inkubation durch Zusatz von 0,1 N HCl (2 ml) gestoppt, woraufhin die optische Absorption bei 550 nm gemessen wurde. Das Enzym zeigt bei 60ºC eine maximale Aktivität, was in Fig. 2 dargestellt ist.

10. Bestimmungsverfahren für Myoinositoldehydrogenase

(1) Reaktionsgemisch:

100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5)
15 mM Myoinositol (Wako Pure Chem. Co.)
1 mM NAD (Oriental Yeast Co.)
5 U Diaphorase (Toyo Jozo Co.)
0,025% NBT (Wako Pure Chem. Co.)

(2) Enzym-Analyse:

Das obige Reaktionsgemisch (1 ml) wird in einem kleinen Testrohr bei 37ºC 5 min lang inkubiert. Es wird eine verdünnte Enzym-Lösung (0,02 ml) zugesetzt und gerührt, um die Reaktion zu initiieren. Nach genau 10 min wird 0,1 N HCl (2,0 ml) zugesetzt und gerührt, um die Reaktion zu beenden. Unter Erhalt der Absorption A&sub1; wird die Absorption bei 550 nm (A&sub5;&sub5;&sub0; nm) gemessen. Der Versuch wurde wiederholt, wobei das obige Reaktionsgemisch verwendet wurde, außer daß Myoinositol nicht enthalten war. Das Gemisch wird in der gleichen Weise, wie es oben beschrieben ist, behandelt und seine Absorption A&sub0; gemessen.

(3) Berechnung der Enzym-Aktivität:

U/ml = (A&sub1; -A&sub0;)/18,3 · 1/10 3,02/0,2 · Z
worin:
18,3: molekularer Absorptionskoeffizienz (cm²/umol)
Z: Verdünnungsfaktor.
In der vorstehend erläuterten enzymatischen Reaktion gehört A&sub1; oder B&sub2; zu der Thio-NADP-Gruppe, Thio-NAD-Gruppe, NADP- Gruppe oder NAD-Gruppe eines Coenzyms. Beispiele für die Thio-NADP-Gruppe oder die Thio-NAD-Gruppe sind Thionicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (Thio-NAD) und Thionicotinamid-Hypoxanthin-Dinukleotid-Phosphat oder Thionicotinamid- Adenin-Dinukleotid (Thio-NAD) und Thionicotinamid- Hypoxanthin-Dinukleotid. Beispiele für NADP-Gruppe oder die NAD-Gruppe sind Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADP), Acetylpyridin-Adenin-Dinukleotid-Phosphat Acetyl- NADP) oder Nicotinamid-Hypoxanthin-Dinukleotid-Phosphat (Deamino-NADP) und Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD), Acetylpyridin-Adenin-Dinukleotid (Acetyl-NAD) und Nicotinamid-Hypoxantin-Dinukleotid (Deamin-NAD).
Wenn A&sub1; die Thio-NAD(P)-Gruppe ist, ist B&sub1; die NAD(P)H- Gruppe, und wenn A&sub1; die NAD(P)-Gruppe ist, ist B&sub1; die Thio-NAD(P)H-Gruppe. Daher wird mindestens eins ein Coenzyms des Thio-Typs sein.
Wenn Verbindungen mit einer Thio-NAD-Gruppe und einer NAD- Gruppe als Coenzyme der Myoinositoldehydrogenase verwendet werden, kann eine beliebige der oben erläuterten Thio-NAD- Gruppen und NAD-Gruppen ausgewählt werden. Wenn darüber hinaus Verbindungen mit einer Thio-NAD(P)-Gruppe und einer NAD(P)-Gruppe als Coenzyme des Enzym eingesetzt werden, kann eine beliebige Thio-NAD-Gruppe oder Thio-NADP-Gruppe und eine NAD-Gruppe oder NADP-Gruppe ausgewählt werden.
In einer Zusammensetzung für eine Myoinositol-Bestimmung ist die Konzentration an A&sub1; und B&sub1; 0,02 bis 100 mM, vorzugsweise 0,05 bis 20 mM und die Konzentration an Myoinositoldehydrogenase 5 bis 1000 U/ml, vorzugsweise 2 bis 500 U/ml. Eine Menge, die den obigen Bereich übersteigt, ist akzeptabel.
A&sub1; und B&sub1; werden bezüglich Myoinositol im Überschuß verwendet und sind verglichen mit dem Km-Wert (mM) von Myoinositoldehydrogenase A&sub1; und B&sub1; im Überschuß. Ein 20 bis 10 000- facher molarer Überschuß bezüglich Myoinositol ist bevorzugt.
In einer Cycling-Analyse kann eine zweite Dehydrogenase, die nicht auf Myoinositol wirkt, und eine Reaktion von B&sub2; zu B&sub1; liefert, als vierte Komponente (4) eingesetzt werden. Die zweite Dehydrogenase und Substrat für diese zweite Dehydrogenase werden zur Durchführung einer Cycling-Reaktion gemäß der Formel (II) kombiniert. In dieser Formel werden die Reaktion B&sub1;→B&sub2; und die gebildete Menge an A&sub2; gemessen.
worin A&sub1; eine Thio-NADP-Gruppe, eine Thio-NAD-Gruppe, eine NADP-Gruppe oder eine NAD-Gruppe ist, A&sub2; eine reduzierte Form von A&sub1; ist, wenn A&sub1; eine Thio-NADP-Gruppe oder eine Thio-NAD- Gruppe ist, B&sub1; ein reduzierte NADP-Gruppe oder reduzierte NAD-Gruppe ist, und wenn A&sub1; eine NADP-Gruppe oder eine NAD- Gruppe ist, B&sub1; eine reduzierte Thio-NADP-Gruppe oder reduzierte Thio-NAD-Gruppe ist, und worin B&sub2; eine oxidierte Form von B&sub1; ist, und die Reaktion von B&sub2; zu B&sub1; eine enzymatische Reaktion ist, welche B&sub1; durch Wirkung der zweiten Dehydrogenase mit Coenzym aus B&sub2; regeneriert. Die zweite Dehydrogenase wird als Ergänzung zum Regenerieren von B&sub1; zugesetzt. Somit kann die Menge an B&sub1; reduziert oder durch B&sub2; oder ein Gemisch aus B&sub1; und B&sub2; ersetzt werden. In diesem Fall ist die Menge an B&sub1; oder/und B&sub2; nicht begrenzt, liegt im allgemeinen aber unter 1/10 mol, bezogen auf A&sub1;, vorzugsweise 1/50 bis 1/1000 mol oder weniger.
In einer Zusammensetzung zur Bestimmung von Myoinositol unter Verwendung der Komponente (4) ist die Konzentration an A&sub1; 0,02 bis 100 mM, vorzugsweise 0,05 bis 20 mM, die Konzentration an B&sub2; oder/und B&sub1; 0,05 bis 5000 uM, vorzugsweise 5 bis 500 uM, und ist die Konzentration an Myoinositoldehydrogenase 5 bis 1000 U/ml, vorzugsweise 20 bis 500 U/ml. Die Konzentration der zweiten Dehydrogenase ist, verglichen mit dem Km- Wert der zweiten Myoinositoldehydrogenase für B&sub2; auf das 20- fache (U/ml) oder mehr festgelegt, z. B. vorzugsweise 1 bis 100 U/ml. Das Substrat für die zweite Dehydrogenase wird im Überschuß verwendet, vorzugsweise 0,05 bis 20 mM oder mehr. Beispiele für die zweite Dehydrogenase und ein Substrat für die zweite Dehydrogenase sind wie folgt.

B&sub2;: NAD-Gruppe oder Thio-NAD-Gruppe;

Alkoholdehydrogenase (EC.1.1.1.1) und Ethanol,
Glyerindehydrogenase (EC.1.1.1.6) (E. coli) und Glycerin
Glycerin-3-phosphatdehydrogenase (EC.1.1.1.8)
(Hasenmuskel) und (L-Glycerin-3-phosphat),
Maleinsäuredehydrogenase (EC.1.1.1.37) (Schweineherzmuskel, Rinderherzmuskel) und L-Malat, und
Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase (EC.1.2.1.12)
(Hasenmuskel, Leber, Hefe, E. coli) und D- Glycerinaldehydphosphat und Phosphat.

B&sub2;: NADP-Gruppe oder Thio-NADP-Gruppe:

Glucose-6-phosphatdehydrogenase (EC.1.1.1.49) (Hefe) und Glucose-6-phosphat,
Isocitratdehydrogenase (EC.1.1.1.42) (Hefe, Schweineherzmuskel) und Isocitrat,
Glyoxylatdehydrogenase (EC.1.2.1.17) (Pseudomonas oxalaticus) und CoA und Glyoxylat,
Phosphogluconatdehydrogenase (EC.1.1.1.44) (Rattenleber, Bierhefe, E. coli) und 6-Phosphogluconat,
Glycerinaldehyddehydrogenase (EC.1.2.1.13) (Chlorophyll) und D-Glycerinaldehyd-3-phosphat und Phosphat und
Benzaldehyddehydrogenase (EC.1.2.1.7) (Pseudomonas fluorescens) und Benzaldehyd.
Eine dritte Dehydrogenase, die nicht auf Myoinositol wirkt und die eine Reaktion von A&sub2; zu A&sub1; liefert, kann in einer Cycling-Analyse als fünfte Komponente (5) eingesetzt werden. Die dritte Dehydrogenase und ein Substrat für die dritte Dehydrogenase werden zur Durchführung einer Reaktion mit Kreislaufführung gemäß der Formel (III) kombiniert. In dieser Formel wird eine Reaktion zur Regeneration von A&sub1; zu der Reaktion A&sub1;→A&sub2; hinzugefügt, und die Menge an B&sub1;, die reduziert ist, wird gemessen.
worin A&sub1; eine Thio-NADP-Gruppe, Thio-NAD-Gruppe, NADP-Gruppe oder NAD-Gruppe ist, A&sub2; eine reduzierte Form von A&sub1; ist, wenn A&sub1; eine Thio-NADP-Gruppe oder Thio-NAD-Gruppe ist, ist B&sub1; eine reduzierte NADP-Gruppe oder reduzierte NAD-Gruppe, und wenn A&sub1; eine NADP-Gruppe oder NAD-Gruppe ist, ist B&sub1; eine reduzierte Thio-NADP-Gruppe oder eine reduzierte Thio-NAD- Gruppe, und worin B&sub2; eine oxidierte Form von B&sub1; ist, und die Reaktion von A&sub2; zu A&sub1; eine enzymatische Reaktion ist, die A&sub1; durch Wirkung der dritten Dehydrogenase mit Coenzym aus A&sub2; regeneriert. Die dritte Dehydrogenase wird als Ergänzung zum Regenerieren von A&sub1; zugesetzt. Die Menge an A&sub1; kann reduziert werden, oder A&sub1; kann durch A&sub2; oder ein Gemisch aus A&sub1; und A&sub2; ersetzt werden. In diesem Fall ist die Menge an A&sub1; oder/und A&sub2; nicht beschränkt, liegt im allgemeinen aber unter 1/10 mol, bezogen auf B&sub1;, und ist vorzugsweise 1/50 bis 1/1000 mol oder weniger.
In einer Zusammensetzung für eine Bestimmung von Myoinositol unter Verwendung der Komponente (5) ist die Konzentration an B&sub1; 0,02 bis 100 mM, vorzugsweise 0,05 bis 20 mM, die Konzentration an A&sub2; oder/und A&sub1; 0,05 bis 5000 uM, vorzugsweise 5 bis 500 uM und die Konzentration an Myoinositoldehydrogenase 5 bis 1000 U/ml, vorzugsweise 20 bis 500 U/ml. Die Konzentration der dritten Dehydrogenase wird im Vergleich zu dem Km- Wert der dritten Myoinositoldehydrogenase für A&sub2; auf das 20- fache (U/ml) oder mehr eingestellt, z. B. vorzugsweise 1 bis 100 U/ml. Das Substrat für die dritte Dehydrogenase wird im Überschuß verwendet, vorzugsweise 0,05 bis 20 mM oder mehr.
Beispiele für die dritte Dehydrogenase und ein Substrat für die dritte Dehydrogenase sind wie folgt.

A&sub1;: NAD-Gruppe oder Thio-NAD-Gruppe;

Alkoholdehydrogenase (EC.1.1.1.1) und Acetaldehyd,
Glyerindehydrogenase (EC.1.1.1.6) (E. coli) und Dihydroxyacetaon,
Glycerin-3-phosphatdehydrogenase (EC.1.1.1.8)
(Hasenmuskel) und (Dihydroxyacetonphosphat),
Maleinsäuredehydrogenase (EC.1.1.1.37) (Schweineherzmuskel, Rinderherzmuskel) und Oxalacetat, und
Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase (EC.1.2.1.12)
(Hasenmuskel, Leber, Hefe, E. coli) und 1,3-Diphospho-Dglycerat.

A&sub1;: NADP-Gruppe oder Thio-NADP-Gruppe:

Glucose-6-phosphatdehydrogenase (EC.1.1.1.49) (Hefe) und Gluconolacton-6-phosphat, und
Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase (EC.1.2.1.13) (Chlorophyll) und 1, 3-Diphospho-Dglycerat.
In der Reaktionsmediumzusammensetzung für die Cycling-Bestimmung werden zwei Coenzyme unter Berücksichtigung ihrer relativen Aktivität zu Myoinositoldehydrogenase ausgewählt. Danach wird der pH unter Berücksichtigung des optimalen pHs für die Hinreaktion und die Rückreaktion so eingestellt, daß das Verhältnis der Hinreaktionsgeschwindigkeit zu der Rückreaktionsgeschwindigkeit sich 1 : 1 nähert.
Myoinositoldehydrogenase, die durch Bacillus sp. Nr. 3 (Produkt von Toyo Jozo Co.) produziert wird, hat eine relative Aktivität von etwa 10 bis 15%, wenn das Coenzym Thio-NAD verwendet wird, im Vergleich zu einer Verwendung von NAD. Der optimale pH für die Hinreaktion ist etwa 9,5 und für die Rückreaktion etwa 7 bis 7,5. Das Enzym kann beide, die NAD- Gruppe wie auch die NADP-Gruppe als Coenzym verwenden.
Myoinositol kann in einer Probe bestimmt werden, indem 0,001 bis 0,5 ml einer Probe zu der Analysenzusammensetzung, die die obigen Komponenten (1) bis (3), Komponenten (1) bis (4) oder die Komponenten (1) bis (3) und (5) enthält, gegeben wird, bei etwa 37ºC umgesetzt wird und dann die Menge an gebildeten A&sub2; oder verbrauchten B&sub1; über einen Zeitraum zwischen zwei Zeitpunkten nach Beginn der Reaktion gemessen wird, z. B. eine Minute zwischen 3 min und 4 min nach Beginn oder 5 min lang zwischen 3 min und 8 min nach Beginn der Reaktion. Eine Messung erfolgt durch Bestimmen der Absorptionsveränderungen bei jeder optischen Absorption. Wenn z. B. A&sub2; Thio-NADH ist und B&sub1; NADH ist, wird das gebildete A&sub2; durch Anstieg der Absorption bei 400 nm gemessen oder aber ver brauchtes B&sub1; wird durch Abnahme der Absorption bei 340 nm gemessen und der auf diese Weise erhaltene Wert wird mit dem Wert einer bekannten Konzentration von Referenz-Myoinositol verglichen. Auf diese Weise kann die Konzentration an Myoinositol in einer Probe in reeller Zeit gemessen werden. Nach dem Bestimmungsverfahren, in dem Myoinositol, das selbst in einer Probe vorliegt, in die enzymatische Kreislaufreaktion eingeführt wird, beeinträchtigen beliebige in der Probe vorliegende Substanzen das Resultat nicht. Daher ist die Messung eines Blindwertes der Probe nicht erforderlich. So kann ein einfaches Bestimmungssystem unter Anwendung einer Geschwindigkeitsanalyse erzielt werden.
Die Messung eines Wertes für A&sub2; oder B&sub1; kann durch das Absorptionsvermögen oder alternativ durch andere bekannte analytische Verfahren erfolgen.
Wie oben erläutert wurde, kann aufgrund der Verwendung von Coenzymen, die jeweils in ihrer reduzierten Form eine unterschiedliche Absorption haben, kein Meßfehler auftreten. Die Mengen an Myoinositol können bei Durchführung der enzymatischen Kreislaufreaktion selbst mit einer geringen Probenmenge genau und schnell analysiert werden.

Beispiele

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung.

Beispiel 1

Reagenzien:
40 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH, 10,0)
2 mM Thio-NAD (Sankyo Co.)
0,2 mM reduziertes NAD (Oriental YeaSt Co.)
150 U/ml Myoinositoldehydrogenase (Toyo Jozo Co. Bacillus sp. Nr. 3)

Arbeitsweise:

Das obige Reagenziengemisch (1 ml) wurde in eine Küvette gegeben und 20 ul jeder Myoinositol-Lösung aus einem Konzentrationsbereich (0, 10, 20, 30, 40 bzw. 50 uM) wurden bei der Reaktionstemperatur von 37ºC zugesetzt. Nachdem die Inkubation begonnen hatte, wurde nach 2 min und nach 7 min die Extinktionsdifferenz gemessen. Die Resultate sind in Fig. 5 dargestellt, woraus zu ersehen ist, daß eine lineare Beziehung zwischen der Myoinositol-Menge und der Veränderung bei der Absorption beobachtet wurde.

Beispiel 2

Reagenzien:

40 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH, 9,5)
2 mM Thio-NAD (Sankyo Co.)
0,1 mM reduziertes Deamino-NAD (Sigma Co.)
200 U/ml Myoinositoldehydrogenase (Toyo Jozo Co. Bacillus sp. Nr. 3)

Arbeitsweise:

Das obige Reagenziengemisch (1 ml) wurde in eine Küvette gegeben und 50 ul jeder Myoinositol-Lösung aus einem Bereich von Konzentrationen (0, 2, 4, 6, 8 bzw. 10 uM) zugegeben, dann wurde das Gemisch 60 min bei 37ºC inkubiert. Danach wurde die Reaktion durch Zusatz von 0,5% Natriumdodecylsulfat (1 ml) gestoppt. Es wurde die Extinktion bei 400 nm gemessen. Die Resultate sind in Fig. 6 angegeben, aus denen eine gute lineare quantitative Kurve zu erkennen ist.

Beispiel 3

Reagenzien:

50 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH, 10,0)
0,2 mM reduziertes NAD (Oriental Yeast Co.)
4 mM Thio-NAD (Sankyo Co.)
250 U/ml Myoinositoldehydrogenase (Toyo Jozo Co. Bacillus sp. Nr. 3)
0,2% Triton X-200

Arbeitsweise:

Das obige Reagenziengemisch (1 ml) wurde in eine Küvette gegeben und 20 ul jedes von drei verschiedenen Seren wurde bei der Reaktionstemperatur von 37ºC zugesetzt. Nachdem die Inkubation begonnen hatte, wurde bei 5 min und 6 min die Extinktionsdifferenz bei 400 nm gemessen.
50 uM Myoinositol-Lösung (Standardlösung) und destilliertes Wasser (reines Reagens) wurden in der gleichen Weise wie oben behandelt und die Myoinositol-Menge in den Serumproben wurde aus der Differenz der Extinktion zwischen der Standardlösung und Proben errechnet.
In der folgenden Tabelle sind die Resultate, die von den drei verschiedenen Seren erhalten wurden, dargestellt.

Beispiel 4

Reagenzien:

40 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,0)
15 mM NADP (Oriental Yeast Co.)
50 uM Thio-NAD (Sankyo Co.)
0,4 M Ethanol
30 U/ml Alkoholdehydrogenase (Oriental Yeast Co.)
250 U/ml Myoinositoldehydrogenase (Toyo Jozo Co., Bacillus sp. Nr. 3)

Arbeitsweise:

Das obige Reagenziengemisch (1 ml) wurde in Küvetten gegeben und 50 ul jeder der Konzentrationen der Myoinositol-Lösung (0, 20, 40, 60, 80 bzw. 100 pH) bei der Reaktionstemperatur von 37ºC zugesetzt. Nachdem die Inkubation begonnen hatte, wurde bei 3 min und 8 min die Extinktionsdifferenz bei 340 nm gemessen. Die Resultate sind in Fig. 7 dargestellt.

Beispiel 5

50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0)
0,25 mM reduziertes NADP (Oriental Yeast Co.)
50 uM Thio-NAD (Sankyo Co.)
5 mM Dihydroxyacetonphosphat
10 U/ml Glycerin-3-phosphatdehydrogenase (Boehringer Mannheim, Hasenmuskel)
250 U/ml Myoinositoldehydrogenase (Toyo Jozo Co., Bacillus sp. Nr. 3)

Arbeitsweise:

Das obige Reagenziengemisch (1 ml) wurde in Küvetten gegeben und es wurden jeweils 50 ul Myoinositol-Lösung verschiedener Konzentration (0, 50, 100, 150, 200 bzw. 250 uM) bei der Reaktionstemperatur von 37ºC zugesetzt. Nachdem die Inkubation begonnen hatte, wurde nach 3 min und nach 8 min die Extinktionsdifferenz gemessen. Die Resultate sind in Fig. 8 dargestellt.

Beispiel 6

Kultur Bacillus sp. Nr. 3:
Hefeextrakt (Kyokuto Seiyaku Co.) 2%
Pepton (Kyokuto Seiyaku Co.) 2%
K&sub2;HPO&sub4; (Wako Pure Chem. Co.) 0,2%
CaCl&sub2; (Wako Pure Chem. Co.) 0,02%
MgSO&sub4; 7H&sub2;O (Wako Pure Chem. Co.) 0,05%
Myoinositol (Wako Pure Chem. Co.) 2%
pH 7,3
100 ml eines flüssigen Mediums, das die obige Zusammensetzung umfaßte, wurde in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben 20 min bei 120ºC sterilisiert. Das Medium wurde mit einer Schleife Bacillus sp. Nr. 3 beimpft, dann wurde das Medium unter Rühren mit 120 Upm 30 h lang bei 50ºC kultiviert, wobei die Kulturmasse (85 ml) (Enzymaktivität 1, 2 U/ml) erhalten wurde. 20 l eines Flüssigkeitsmediums, das die obige Zusammensetzung umfaßte und mit 0,1% Disform CB 442 (Nihon Yushi Co.) versetzt war wurden in einem 30 l Glaskolben-Fermenter durch Erhitzen sterilisiert. 85 ml der im Schritt oben erhaltenen vorkultivierten Impfkultur wurden eingeimpft, dann wurde das Gemisch bei 50ºC mit einer Belüftung von 20 l/ml, einem Innendruck von 0,4 kg/cm² und Rühren bei 150 Upm 24 h unter Erhalt der Kulturmasse (18,0 l) (Enzymaktivität 1,8 U/ml) kultiviert.

Beispiel 7

Enzym-Reinigung

Bakterienzellen, die durch Zentrifugation aus der in Beispiel 6 erhaltenen Kulturbrühe gesammelt worden waren, wurden in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5, 5 l), der 0,1% Lysozym (Eizai Co.) enthielt, suspendiert und 1 h bei 37ºC solubilisiert; danach wurde das Gemisch zur Entfernung von Niederschlag und unter Erhalt einer überstehenden Lösung (4500 ml) (Aktivität: 6 U/ml) zentrifugiert. Zu der überstehenden Lösung wurde zur Abtrennung des Niederschlags aceton (1,8 l) gegeben, wobei der Niederschlag dann in 20 mM Phosphatpuffer unter Erhalt eines Rohextraktes (1 l, 24,2 U/ml) gelöst wurde.
Zu der Lösung wurde Ammoniumsulfat (200 g) gegeben, das Ganze unter Rühren gut vermischt und zur Abtrennung des Niederschlags dann zentrifugiert. Der überstehenden Lösungsmittel wurden zusätzliche 250 g Ammoniumsulfat zugegeben und die Lösung danach unter Erhalt eines neuen Niederschlags zentrifugiert. Der neue Niederschlag wurde unter Erhalt einer Enzym-Lösung (500 ml, spezifische Aktivität 36,3 U/ml) in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst, dann wurde die resultierende Lösung über Nacht gegen 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5, 20 l) dialysiert. Die dialysierte Enzym-Lösung wurde auf eine Lösung aus DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia Co.) (250 ml), das mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) gepuffert war, gegeben, mit 20 mM Phosphatpuffer, der 0,1 M KCl enthielt, (pH 7,5, 1 l) gewaschen und mit 20 mM Phosphatpuffer, der 0,3 M KCl enthielt (pH 7,5) unter Erhalt einer Enzym- Lösung (350 ml), Aktivität 35,2 U/ml) eluiert. Die Enzym- Lösung wurde über Nacht gegen 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0, 20 l) dialysiert. Rinderserumalbumin (Sigma Co., 0,2 g) wurde in der auf diese Weise erhaltenen Enzym-Lösung aufgelöst, dann wurde die Lösung unter Erhalt des gefriergetrockneten Enzyms (1,1 g, 10,6 U/mg) lyophilisiert.

Claims

1. Myoinositoldehydrogenase, die die folgenden Eigenschaften aufweist:

(1) Sie weist eine Substrat Spezifität für Myoinositol auf und katalysiert die Reaktion:

Myoinositol + NAD Myoinosose + reduziertes NADH

(2) Molekulargewicht: 130.000 ± 15.000 (Gelfiltrationsverfahren mit TSK Gel G 3000 SW)

(3) Isoelektrischer Punkt: pH 4, 5 ± 0,5

(4) Km-Wert:

Km-Wert für Myoinositol: 0,64 mM

Km-Wert für NAD: 0,004 mM

(5) Optimaler pH: etwa pH 9,5

(6) pH-Stabilitat: mehr als 80% Restaktivität bei einem pH von 6,5 bis 9,0.

(7) Hitzestabilität: mehr als 95% Restaktivität bei Temperaturen von bis zu 60ºCelsius.

2. Verfahren zur Herstellung einer Myoinositoldehydrogenase nach Anspruch 1, das das Züchten eines Myoinositoldehydrogenase produzierenden Mikroorganismus, welcher der Bacillus sp. Nr. 3 (FERM BP-3013) oder eine Mutante davon ist, und Isolieren der Myoinositoldehydrogenase aus der Kulturmasse umfaßt.

3. Bacillus sp. Nr. 3 (FERM BP-3013) oder eine Mutante davon, die eine Myoinositoldehydrogenase nach Anspruch 1 produzieren kann.

4. Kultur von Bacillus sp. Nr. 3 (FERM BP-3013) oder einer Mutante davon, die eine Myoinositoldehyrogenase nach Anspruch 1 produzieren kann, in einem Kulturmedium, das eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff, eine Quelle von assimilierbarem Stickstoff und Mineralsalze enthält und das frei von anderen Mirkoorganismen ist.