JPH04126075A - ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規かつ有用なミオ・イノシトールデヒドロ
ゲナーゼおよびその製造法に関する。さらに詳しくは、
臨床生化学検査、食品検査などにおけるミオ・イノシト
ールの測定に利用されるミオ・イノシトールデヒドロゲ
ナーゼおよびその製造法に関する。

〔従来の技術〕

ミオ・イノシトールはイノシトールの９つの異性体の１
つで、極めて安定した環状アルコールである。

人の場合、ミオ・イノシトールは食事により１日約１ｇ
、腎臓における生合成により約２ｇが供給され、細胞へ
の取り込みと腎臓における排泄・再吸収および酸化によ
り血しょうレベルがほぼ一定になるように調節されてい
る。そのため腎機能障害において血しょうミオ・イノシ
トールレベルの著明な増加が見られる〔臨床科学２４巻
、１１号、１４４８−１４５５頁、嘉門信雄〕。このよ
うにミオ・イノシトールを測定することによって腎機能
のモニタリングができる。

従来、ミオ・イノシトールはガスクロマトグラフィー、
高速液体クロマトグラフィー等で測定されており、臨床
生化学ではミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを用い
てミオ・イノシトールを測定する例は知られていなかっ
た。

公知のミオ・イノシトールに基質特異性を有し、少なく
ともミオ・イノシトールおよびＮＡＤ＋からミオ・イノ
ソースおよびＮＡＤＨ＋Ｈ”を生成する反応を触媒する
酵素生産菌として知られている人１ｒｏｂａｃｔｅｒ　
　　ａｅｒｏ　　　ｅｎｅｓ　　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　
ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　３５．３２６　（１
９６２）（Ｖ））の生産する酵素は至適ｐＨが９．０、
ミオ・イノシトールに対するＫｍ値は１２５Ｘ１０−３
Ｍであり、ＮＡＤ”に対するＫｍ値は３．３Ｘ１０−４
Ｍであると記載されている。（酵素ハンドブック、朝倉
書店発行、ｐ、６）。また、公知の本酵素生産菌として
知られている、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　　　　　ｎｅｕ
ｍｏｎ　　１　ａｅ、　　５ｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓ　　（酵素ハンドブック、ｐ、６）の２
種は標準微生物学第２版（医学書院、ｐ、２０９−２１
２）によると肺炎あるいは日和見感染起因菌として化学
療法剤、抗生物質に抵抗性を有する難治性感集菌として
知られており、工業的規模で培養することは避けなけれ
ばならず、現状ではこれら生産菌による当該酵素の性状
についての報告はない。更に、従来公知のＣｒ　　　ｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、２９３．２９５　３
０３（１９７３））の生産する酵素のミオ・イノシトー
ルに対するＫｍ値は５．ｌＸｌ０−３Ｍであり、ＮＡＤ
４に対するＫｍ値は６．９Ｘ１０−’Ｍであると記載さ
れている。（酵素ハンドブック、ｐ、６）。その他、本
酵素は動物の器官として牛の脳（Ｂ　ｉ　ｏ　ｃｈｅｍ
、Ｂｉ　ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ。

、６８：１１３３−１１３８　（１９７６））に存在す
ることが知られているが、酵素を分離するために常に新
鮮な脳を入手することは非常に困難なことである上に経
済的でなく、また分子量は７４．０００であると記載さ
れている。

〔発明が解決しようとする課題〕

このように公知の酵素はその生産菌（Ａｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、５ｅｒｒａｔｉａ）が感
染菌であったり１、Ｃｒ　　　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍ
ｅｌｉｂｆｏｓｕｍ由来の酵素のようにミオ・イノシト
ールおよびＮＡＤ“に対するＫｍ値が高いために十分な
反応速度が得られなかったり、牛の脳のように新鮮な原
料を常に多量に入手することが困難であった。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、ミオ・イノシトールを測定する
目的で、危険性のない、培養活性の高い、基質であるミ
オ・イノシトールとＮＡＤ’に対するＫｍ値のできるだ
け低い、安定で精製の簡単な酵素を生産する菌株を広く
自然界よりスクリーニングしたところ、静岡県賀茂郡東
伊豆町熱用の温泉近くの土壌より分離したＢａｃ　ｉ　
１１ｕｓ　−１１Ｎｏ、３菌株が目的とする良好な性質
を有する新規なミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを
産生ずることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、ｐＨ８，５において測定したミオ・イ
ノシトールとＮＡＤ”に対するＫｍ値がそれぞれ０．６
４ｍＭ、０．００４ｍＭと非常に低い、反応性の高い性
質を有し、かつほぼ６０’Ｃの緩衝液中で約１５分間処
理した後の活性が、処理前の活性の９５％以上の値を保
持している優れた熱安定性を有している新規なミオ・イ
ノシトールデヒドロゲナーゼを提供するものである。ま
た、本発明は、バチルス属に属するミオ・イノシトール
デヒドロゲナーゼ生産菌を培地に培養し、得られた培養
物がらミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを採取する
ことを特徴とするミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ
の製造法を提供するものである。

ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ生産菌はバチルス
属に属するが、例えば本発明者らが分離したＮｏ、３菌
株は、本発明に最もを効に使用される菌株の一例であっ
て、本菌株の菌学的性質を示すと次の通りである。

尚、本菌株の同定に当たっては、同定実験は医学細菌同
定の手引きく第２版）　、Ｍ　ｉ　ｃ　ｒ　ｏ　ｂ　ｉ
　ｏ　１ｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　（３巻）
に準じて行い、実験結果をＢｅｒｇｅｙ’　　ｓ　　Ｍ
ａｎｕａｌｏｆ　　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　　Ｖｏｌ、　　１　　（１９
８４）、２　　（１９８６）などと対比して同定を行っ
た。

（ａ）形態的特徴 端の丸いまっすぐまたはやや曲がった桿状細菌で大きさ
は０．５〜０．７Ｘ１．５〜３．５μｍで周毛で運動す
る。端または亜端に０．８Ｘ１．０〜２０μｍの楕円〜
卯形の芽胞を形成し、芽胞によって菌体は膨張する。多
形性なし。

（ｂｌ各培地における生育状態 各種培地上で、１〜２日、５０〜５２℃で培養し、観察
した所見は次の通りである。

■普通寒天平板培地 円形で丘状（ｃ　ｏ　ｎ　ｖ　ｅ　ｘ）の集落を形成す
る。

表面は滑らかで縁は丸い。黄土色〜淡黄出色を呈するが
、可溶性色素は産生しない。

■普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。淡黄土〜黄土色を呈する。

可溶性色素は産生じない。

■液体培地（ペプトン水） 生育良好で一様に混濁する。

■リドモスミルク培地 ４〜５日後、弱酸性になる。

ＤＮＡのＣＣモル％　　　　：４１．９モル％（ＨＰ　
Ｌ　Ｃ法） 主たるイソプレノイドキノン：ＭＫ−７ＩＣ）止環的、
生化学的性質〔＋；陽性、（＋）；弱陽性、−；陰性、
ＮＴ；未実験〕 ダラム染色　　　　　　　　　　　　　＋ＫＯＨ反応 カプセル形成 抗酸性染色 ＯＦテスト （Ｈｕｇｈ−Ｌｅ　ｉ　ｆ　ｓ　ｏｎ）　　　　　　Ｎ
ＴＯＦテスト （Ｎ源にＮＨ４Ｈｚ　ＰＯ４）　　　　　　　Ｆ好気で
の生育　　　　　　　　　　　　十嫌気での生育　　　
　　　　　　　　　十生育温度　７０℃ ６０℃　　　　　　　　　　＋ ３７℃ ３０℃ 食塩耐性　　０％ ３％ ５％ 生育ｐＨ５，６ ６，２ ９，０ ゼラチンの分解 澱粉の分解 カゼインの分解 エスクリンの分解 チロシンの分解 アルギニンの分解 セルロースの分解 カタラーゼ産生 オキシダーゼ産生 レシチナーゼ産生 ウレアーゼ産生（ＳＳＲ） ウレアーゼ産生（Ｃｈｒｉｓ） ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ （＋） ＋ ＋ ＋ インドール産生 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） アセトイン産生（Ｋｇ　ＨＰ　０４　）アセトイン産生
（ＮａＣｆｆ） ＭＲテスト 硝酸塩還元テスト（ガス産生） （Ｎ　Ｏｘ−の検出） （Ｎ　Ｏ：ｌ−の検出） シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 リンゴ酸塩 マレイン酸塩 マロン酸塩 プロピオン酸塩 グルコン酸塩 コハク酸塩 クリステンゼン培地での利用性 クエン酸塩 リンゴ酸塩 マレイン酸塩 マロン酸塩 プロピオン酸塩 グルコン酸塩 コハク酸塩 グルコースよりガスの産生 各種ｗＭ類より酸の産生 アドニトール Ｌ（＋）アラビノース セロビオース ヅルシトール メソ・エリスリトール フラクトース フコース ガラクトース グルコース グリセリン イノシトール イヌリン ラクトース マルトース マンニトール　　　　　　　　　　　　＋マンノース　
　　　　　　　　　　　　　＋メレジトース メソビオース　　　　　　　　　　　　　＋ラフィノー
ス ラムノース　　　　　　　　　　　　　　＋Ｄ−リボー
ス　　　　　　　　　　　　＋サリシン　　　　　　　
　　　　　　　＋Ｌ−ソルボース ソルビトール 澱粉　　　　　　　　　　　　　　　　十すフカロース
　　　　　　　　　　　　＋トレハロース　　　　　　
　　　　　　　＋キシロース 以上の通り、本菌株の主性状は、ダラム陽性の桿状細菌
で、大きさは０．５〜０．７Ｘ１．５〜３゜５μｍ、周
毛で運動、芽胞形成、多形性なし、グルコースを醗酵的
に分解し、酸を産生する。カタラーゼ・オキシダーゼ産
生。高温性の通性嫌気性であり、これらのグラム陽性桿
菌で芽胞を形成し、好気で生育する特徴から、バチルス
属に属すると判断された。

そこで、本菌株がバチルス属のた゛の種に属するが否か
を同定した。即ち、Ｂｅｒｇｅｙ’　　ｓ　　Ｍａｎｕ
ａｌ　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、２によれば、高温（５０℃）
で生育する菌種はバチルス　アシドカルダリウス（Ｂ、
ａｃ　１ｄｏｃａ　１ｄａｒ　１ｕｓ）　、バチルス　
サブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス　バジ
ウス（Ｂ、ｂａｄ　１ｕｓ）　、バチルス　プレビス（
Ｂ、ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス　コアグランス（Ｂ、ｃ
ｏａｇｕｌａｎｓ）　、バチルス　リケーニフォルミス
（Ｂ、　　１　ｉ　ｃｈｅｎ　ｉ　ｆ　ｏ　ｒｍｉ　ｓ
）、バチルス　パントセンチカス（Ｂ、ｐａｎｔｏｔｈ
ｅｎｔ　ｉ　ｃｕｓ）　、バチルス　シエゲリ　（Ｂ、
　　ｓｃｈｅｇｅ　ｌ　１　ｉ）　、バチルス　ステア
ロサーモフィルス（Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉ　１ｕＳ）の９菌種が記載されている。その内で、嫌
気下で生育する菌種はバチルス　Ｂ、ｃｏａｇｕｌａｎ
ｎｓとＢ、Ｉｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓの２菌種のみであ
る。即ち、１３．ｃｏａｇｕｌａｎｎｓ　　（以下、「
Ｃ」と略記することがある）およびＢ、Ｉｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｓ　　（以下、ｒＬＪと略記することがある
）と本面、とを対比した結果は、次の通りである。

尚、Ｃ，Ｌおよび本面で示される「＋」は陽性、ｒ　（
＋）　Ｊは弱陽性、「−」は陰性、ｒｄＪは菌株によっ
て異なる、ＮＤはデータなしであることを示す。

オキシダーゼ産生 芽胞による膨張 嫌気生育 アセトイン産生 グルコース（酸） Ｌ・アラビノース キシロース マンニット　（酸） カゼイン分解 ゲラチン分解 Ｌ ＋　　　　　＋ ＋　　　　　＋ ＋　　　　　＋ （酸）＋＋ ｄ　　　　＋ ｄ　　　　＋ ｄ　　　　＋ ｄ　　　　＋ ＋ ＋ ＋ デンプン分解 クエン酸塩利用 プロピオン酸塩利用 チロシン分解 ＬＶ反応 インドール産生 食塩耐性　２％ ５％ ７％ １０％ 生育温度４０℃ ５０℃ ５５℃ ６０℃ ７０℃ 硝酸塩還元 ＤＮＡの００モル％ ＋ ＋ ｄ　　　　＋ ４４．５　４６．４ （Ｔｙｐｅ）（Ｔｙｐｅ） ４４．３　４２．９ 〜５０．３　〜４９．９ （＋） ４１．９ 以上対比した結果によれば、本菌株Ｎｏ、３の諸性状は
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｏａｇｕｌａｎｓに近いと考え
られるが、アセトイン産生能、ＤＮＡの００モル％、ま
た上記対比表には載せていないが、リドモスミルク培地
での反応も違っている。

よって、本菌株を公知のものと区別するため、バチルス
・エスピーＮｏ、３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ、Ｎｏ
、３）と命名し、通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所に受託番号微工研条寄第３０１３号（ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−３０１３）として寄託した。

本発明においては、先ずバチルス属に属するミオ・イノ
シトールデヒドロゲナーゼ生産菌が適当な培地に培養さ
れる。

上記のミオ・イノシトールデヒロゲナーゼ生産菌として
は、前述のバチルス・エスピーＮ００３が挙げられるが
、細菌の一般的性状として蘭学上の性質は変異し得るも
のであるから、自然的にあるいは通常行われる紫外線照
射、放射線照射または変異誘導剤、例えばＮ−メチル−
Ｎ゛　−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタ
ンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異
し得る人工変異株は勿論、自然変異株も含め、バチルス
属に属し、ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを生産
する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用すること
ができる。

上記の培養は、細菌の培養に一般に用いられる条件によ
って行うことができるが、本菌株の培養にあたっては、
ミオ・イノシトールデヒロゲナーゼがミオ・イノシトー
ルによって誘導的に生成される誘導酵素であることから
、例えばミオ・イノシトールを０．５〜５％含む培地で
培養することがミオ・イノシトールデヒロゲナーゼの生
産性を１００〜３００倍程度良好とするので好ましい。

培地としては、ミオ・イノシトールを添加する以外に微
生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらには
必要に応し、無機塩などを含有させた栄養培地が使用さ
れる。

同化し得る炭素源としては、グルコース、フラクトース
、サッカロースなどが単独または組み合わせて用いられ
る。消化し得る窒素源としては、例えばペプトン、肉エ
キス、酵母エキスなどが単独または組み合わせて用いら
れる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、
カルシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、その他、鉄
、マンガンなどの種々の重金属塩などが使用される。上
記以外に公知の同化し得る炭素源、消化し得る窒素源が
使用できることはいうまでもない。

培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条
件下で行うのがよく、工業的には深部通気攪拌培養が好
ましい。培養温度はミオ・イノシトールデヒロゲナーゼ
生産菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し
得るが、通常は４０〜６０℃、特に５０℃付近が好まし
い。培養時間は培養条件によって異なるが、本酵素が最
高力価に達する時期を見計らって適当な時期に培養すれ
ばよいが、通常は１〜２日間程度である。

これらの培地組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、
通気性などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条
件などに応して好ましい結果が得られるように適宜調節
、選択されることは言うまでもない。

液体培養において発泡があるときは、シリコン油、植物
油などの消泡剤が適宜使用される。

このようにして得られたミオ・イノシトールデヒドロゲ
ナーゼは、主として菌体内に含有されるので、得られた
培養物から濾過または遠心分離等の手段により集菌し、
この菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスピ
ーズ処理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やりゾチー
ム等の酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜組
み合わせて、粗製のミオ・イノシトールデヒロゲナーゼ
含有液が得られる。

次いで、この粗製のミオ・イノシトールデヒドロゲナー
ゼ含有液から公知の蛋白質、酵素等の単離、精製手段を
用いることによりさらに精製されたミオ・イノシトール
デヒドロゲナーゼを得ることができる。例えば粗製のミ
オ・イノシトールデヒドロゲナーゼ含有液に、硫安、硫
酸ナトリウム等を添加する塩析沈澱法により本酵素を回
収すればよい。さらにこの沈澱物は、分子篩、各種の樹
脂を用いたクロマトグラフィー法、電気泳動法あるいは
超遠心分析法を適宜組み合わせ用いて、必要に応じて精
製すればよく、その精製手段としては、目的とするミオ
・イノシトールデヒドロゲナーゼの性質を利用した手段
を用いればよく、例えば上記の沈澱物を水または緩衝液
に溶解した後、必要に応じて半透膜にて透析し、さらに
ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セファセル、ＤＥＡ
Ｅ−セファロース、ＤＥＡＥ−セファデックス、Ｑ−セ
ファロース（ファルマシア製）、ＤＥＡＥ−）ヨパール
（東洋曹達社製）ハイトロキシルアパタイト等のイオン
交換樹脂や、オクチルセファロース、フェニル−セファ
ロース（ファルマシア社製）等の疎水クロマト樹脂や、
その他のアフィニティークロマト樹脂が使用される。ま
た、セファデックスＧ−１００、セファアクリルＳ−２
００等のゲル濾過剤による分子篩クロマトや、さらに必
要に応して透析膜を用いて脱塩すればよい。その後、必
要に応して糖類、例えばマンニトール、サッカロース、
ソルビトール等、アミノ酸、例えばグルタミン酸、グリ
シン等、ペプタイドまたは蛋白質として牛血清アルブミ
ン等の安定剤の０．０５〜１０％程度を添加し、凍結乾
燥等の処理により精製されたミオ・イノシトールデヒド
ロゲナーゼの粉体を得ることができる。

以上の如くして得られたミオ・イノシトールデヒドロゲ
ナーゼの性状は以下の通りである。

ｆｌ）基質特異性 ミオ・イノシトール　　　　　　　１００％グルコース
　　　　　　　　　　　　　０フルクトース　　　　　
　　　　　　　　０ガラクトース　　　　　　　　　　
　　　Ｏソルビトール　　　　　　　　　　　　　０マ
ンノース　　　　　　　　　　　　　　０マルトース　
　　　　　　　　　　　　０サツカロース　　　　　　
　　　　　　０ラクトース　　　　　　　　　　　　　
０（２）酵素作用 下記式に示すように、少なくともミオ・イノシトールお
よびＮＡＤ”よりミオ・イノソースおよびＮＡＤＨを生
成する反応を触媒する。

ミオ・イノシトール＋ＮＡＤ′″□ ミオ・イノソース”　＋ＮＡＤＨ十Ｈ”＊　（２，４，
６／３．５−ペンタヒドロキシシクロヘキサノン） （３）分子量 １３０．０００±１５，０００ トーソー社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（０゜７５Ｘ６
０ｃｍ）による値、溶出液；０．２ＭＮａｃ１含有０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）、標準品はオリエンタ
ル酵母社製の次の分子量マーカーを使用。

Ｍ、Ｗ、　　　１２，４００　　　シトクロムＣＭ、Ｗ
、　　　３２，０００　　　アデニレイトキナー−ゼ 牛血清アルブミン ラクテートデヒドロ ゲナーゼ グルタメートデヒド ロゲナーゼ Ｍ、Ｗ、　　　６７．０００ Ｍ、　　Ｗ、　　１４２．　０００ Ｍ、　　Ｗ、　　２９０．　０００ （４）等電点 ｐＨ４，５±０．５ キャリアアンフオライトを用いる焦点電気泳動法により
４℃、７００Ｖの定電圧で４０時間ｉｌｌ　Ｈシた後、
分画し、各両分の酵素活性を測定した。

（５）　Ｋ　ｍ値 １００ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）、５Ｕ
　　ジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、１ｍＭ　　ＮＡ
Ｄ”　　（オリエンタル酵母社製）、０．０２５％　　
ＮＴＢ　（和光線１ＩＪＪＬ’ｆｆ）を含む反応液中で
ミオ・イノシトールの濃度をｉ化させて、ミオ・イノシ
トールに対するＫｍ値を測定した結果は、０．６４ｍＭ
の値を示した。

一方、前記反応液中でＮＡＤ”の代わりに１５ｍＭのミ
オ・イノシトールを添加し、ＮＡＤ”の濃度を変化させ
てＮＡＤ”に対するＫｍ値を測定した結果は、０．００
４ｍＭの値を示した。

（６）至適ｐＨ 後記の酵素活性測定法に従い、反応液中の１００ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に代えて１゜ＯｍＭのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，５〜８．Ｏ１−〇）、トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０〜９．０、ロー）およびグリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０〜１０．０、−■
−）の各緩衝液を用いて測定した活性の相対値の結果は
第４図に示す通りであって、ｐＨ９，５付近で最大の活
性を示す。

（７１ｐ　Ｈ安定性 本酵素（ｌｕ／ｍｆ）を４０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４
，５〜６，０、−ム−）、リン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜
８．０、−〇−）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０〜９
，５、−口−）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９，０〜１０．０、■−）の各緩衝液で調製し
、５０℃で１５分間加熱処理した後、その残存活性を後
記の酵素活性測定法に従って測定した結果は、第３図に
示す通りであって、ｐＨ６，５〜９．０の範囲で８０％
以上の活性を保持している。

（８）熱安定性 本酵素液（ｌｕ／ｍ１）を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７）で調製し、１５分間加熱処理後、その残存活性
を後記の酵素活性測定法に従って測定した結果は、第１
図に示される通りであって、６０℃までは残存活性とし
て９５％以上を有する安定なものであった。

（９）至適温度 １００ｍＭ）リス塩酸緩衝１（ｐＨ８，５）を用い、後
記の酵素活性測定法に従い、３５．４０．４５．５０．
５５．６０および６５℃の各温度で１０分間反応後、０
．ＩＮ塩酸２ｍｌで反応を停止し、波長５５０ｎｍで吸
光度を測定した相対値の結果は、第２図に示す通りであ
って、６０℃付近で最大の活性を有している。

００）ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ活性測定法 ■反応液組成 １００ｍＭ　　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）、１５
ｍＭ　　ミオイノシトール（和光純薬社製）１ｍＭ　　
ＮＡＤ”　　（オリエンタル酵母社製）５Ｕ　　ジアフ
ォラーゼ（東洋醸造社製）、０．０２５％ＮＢＴ　（和
光純薬工業社製）、■酵素活性測定 上記の反応液１ｍｌを小試験管に入れ、３７℃で５分間
インキュベートした後に、適当に希釈した酵素液０．０
２ｍ１を添加して攪拌し、反応を開始する。正確に１０
分間反応の後に、０．ＩＮ塩酸２゜Ｑ　ｍ　ｌを添加し
て攪拌し、反応を停止して、Ａ　５５゜ｎｍを測定して
吸光度ＡＩを求める。上記反応液よリミオ・イノシトー
ルを除いた反応液を用いて同様の測定を行い、その吸光
度ＡＯを求める。

■計算式 ％式％ 〔発明の効果〕 本発明のバチルス属に属するバチルス・エスピーＮｏ、
３由来の新規な性状を有するミオ・イノシトールデヒド
ロゲナーゼは６０℃で残存活性として９５％以上有する
熱安定性に優れている新規な酵素であり、かつ、基質の
ミオ・イノシトールおよび補酵素のＮＡＤ”に対するＫ
ｍ値が非常に低いために優れた反応性を有していること
から、本酵素を利用した極めて優れたミオ・イノシトー
ル測定用試薬ヲ提供できる。また本発明の酵素は分離、
精製中における失活も少なく、精製も容易であるので、
ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼの製法として有利
な製造法を提供できる。

次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、こ
れにより本発明を限定するものではない。

実施例　１ バチルス・エスピーＮ００３の培養 酵母エキス（極東製薬社製）２％、ペプトン（極東製薬
社製）２％、リン酸２カリウム（和光純薬社Ｗ）０．２
％、塩化カルシウム（和光純薬社製）０゜０２％、硫酸
マグネシウム（和光純薬社製）０．０５％、ミオ・イノ
シトール（和光純薬社製）２％、ｐＨ’７．３を含む液
体培地１００ｍｊ！を５００ｍ７！容三角フラスコに分
注し、１２０℃で２０分間加熱滅菌した後、これにバチ
ルス・エスピーＮ０１３の１白金耳を接種し、５０℃で
１２０ｒ、ｐ、ｍ、の振とう培養器で３０時間培養して
種母８５ｍｊ！（酵素活性１．２ｕ／ｍｊｌりを得た。

一方、上記と同様の培地組成にて消泡剤としてデイスフ
オーム４４２　（日本油脂）を０．１％添加した液体培
地２０Ｌを３ＯＬ容ジヤーフアメンターに仕込み、加熱
滅菌した後に上記の種母８５ｍ１を移植し、培養温度５
０℃、通気量２０Ｌ／分、内圧０４ｋｇ／ｃｍ”、攪拌
速度１５０ｒ、ｐ、ｍ、で２４時間通気培養し、培養物
１８．ＯＬ（酵素活性１．８ｕ／ｍｌ）を得た。

実施例　２ 実施例１で得た培養物を遠心分離で集菌し、これに０．
１％リヅチーム（エーザイ社製）を含む２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，５）５Ｌを加え、３７℃で１時間イン
キュベイトした後、遠心分離して沈澱物を除去し、上滑
４．５　Ｌ　（６ｕ／ｍ６）を得た。

この上清にアセトンを１．８Ｌ添加攪拌し、生じた沈澱
物を遠心分離して集め、これを２０ｍＭリン酸緩衝液で
溶解しＩＬの粗酵素液（２４，２ｕ／ｍＪ）を得た。こ
の溶液に固形硫安を２００ｇ溶解し、生じた沈澱物を遠
心分離して除去し、得られた上清に再び固形硫安を２５
０ｇ溶解した。この処理液を遠心分離して得られた沈澱
物を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）”？：溶解し
、５００ｍｌ！（Ｄ酵素液（３６，３ｕ／ｍｆ）を得た
。この酵素液を透析膜（三光純薬社製）を用いて２０Ｌ
の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して一晩透
析し、得られた酵素液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ
７，５）で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６
Ｂ　（７ｙルマシア）２５０ｍｌのカラムに通し、０．
１ＭＫＣＺを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
ＩＬを流した後、次いで０．３Ｍ　　ＫＣＩ！を含む２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で溶出し、酵素液３
５０ｍ！！（３５，２ｕ／ｍ！りを得た。得られた酵素
液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）２０Ｌに対し
て一晩透析した。こうして得られた酵素液に牛血清アル
ブミン（シグマ社製）　ヲ０．　２　ｇＲ％Ｅした後に
凍結乾燥して、凍結乾燥標品１．Ｉｇ　（１０，５ｕ／
ｍｇ）を得た。

参考例　ｌ 公知の生産菌によるミオ・イノシトールデヒドロゲナー
ゼの製造および性質の比較ニ ーＬ見工」」−Ｉ　Ｆ　Ｏ１２９７９および３ｅｒｒａ
ｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓＡＴｃｃ１３８８０の
培養：ペプトン（極東製薬社製）；５ｇ／ｌ、肉エキス
（Ｄｉ　ｒ　ｃｏ、）；５ｇ／ｊｉ！、塩化ナトリウム
（和光純薬社製）；５ｇ／ｌ、ミオ・イノシトール（和
光純薬社製）；１０ｇ／ｌ；ｐＨ７，０を含む液体培地
１００ｍ１を５０　ＱｍＡ容三角フラスコに分注し、１
２０℃、２０分間加熱滅菌した後に、上記３株をそれぞ
れ１白金耳接種し、３７℃、１００　ｒ。

ｐ、ｍ、の振とう培養器で４８時間培養した後に、遠心
分離で集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ’７
．０に懸濁し超音波破砕器（久保田製作所製）を用いて
１８０Ｗ、１０分間ソニケイションした後に１５０００
ｒ、Ｉ）、ｍ、　、１５分間遠心分離して上清を得た。

それぞれの上滑の活性を前記αωミオ・イノシトールデ
ヒドロゲナーゼ活性測定法で測定した。

それぞれの酵素液ｌ　ｍ　ｌを試験管に分注し、３５℃
、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃で１５分間
加熱処理後、その残存活性を活性測定法にしたがって測
定した結果を第５図に示す。

Ｋｌｅｂｓ　ｉ　ｅ　１１ａ　；−〇−Ａｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　；−△ ５ｅｒｒａｔｉａ　　　；−ロー 参考例　２ Ｃｒ　　　　　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　　　ｍｅｌｉｂｉｏ
ｓｕｍｒＦｏ　　１８７１株を用いてＢｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ａｃｔａ、　　２９３．　２９５
−３０３（１９７３）記載の培養条件で培養した。ミオ
・イノシトール（和光純薬社製）；０．５％、Ｂａｃｔ
ｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ　（Ｄｉｒｃｏ、）；１％、Ｂａｃ
ｔｏ−ｙｅａｓｔ　　ｅｘｔｒａｃｔ　（Ｄｉｆｃｏ。

）；０．５％、ｐＨ６，２を含む液体培地１００ｍ１を
５００ｍｊ！容三角フラスコに分注し、１２０℃２０分
間加熱滅菌した後に上記菌株を１白金耳接種し、２５℃
、１００ｒ、ｐｏｍ、の振とう培養器で４８時間培養し
た後に遠心分離で集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）に懸濁し、超音波破砕器（久保田製作所社製）
を用いて１８０Ｗ、１０分間ソニケイションの後に１５
００Ｏｒ、ｐ、ｍ。

１５分間遠心分離して上清（１０ｍｌ、２１ｕ／ｍ　ｊ
２　）を得た。

参考例　３ 牛の脳を用いてＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄＢｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａ　　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　　Ｃｏｍｍｕｎ
ｉｃａｔｉｏｎｓ、６８．Ｎｏ、４．１１３３−１１３
８　（１９７６）記載の方法で牛の脳１００ｇよりホモ
シネイト、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　　Ｇ−１００カラムクロマトグラフイーを用い
て精製酵素液（５０ｍｌ）を得た。

しかし、文献中にも記載されているように牛の脳の酵素
はミオ・イノソースとＮＡＤＨよりミオ・イノシトール
とＮＡＤ”を生成する方向に活性が大きく傾いており、
事実本精製酵素でもミオ・イノソースからミオ・イノシ
トールの逆方向への活性はｏ、。

４５　ｕ　／　ｍ　ｌ認められたが、正方向の活性はほ
とんど認められなかった。

ミオ・イノソースとＮＡＤＨからミオ・イノシトールと
ＮＡＤ”を生成する活性の活性測定法反応液組成 １００ｍＭ　　　　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）１
０ｍＭ　　　　ミオ・イノソース（シグマ社製）０、　
３ｍＭ　　　ＮＡＤＨ 活性測定法 上記反応液１ｍｌを石英セルに分注し、３７℃で２分間
インキュベイトした後に酵素液（前記参考例２および３
）０．０５ｒｒ＋１を添加し、ＮＡＤＨのＡ３４Ｄｎｍ
における減少を測定する。

−Ａ、４゜７．７分　　１．０５ ＴＪ　／　ｍ　ｌ　＝　　　　　　　　Ｘ６．２２　　
　　０．０５ ６．２２：分子吸光度係数　μｍｏｌ／ｃｍ”それぞれ
の酵素１ｍＪを試験管に分注し、３５℃、４０℃、４５
℃、５０℃で１５分間加熱処理後、その残存活性を参考
例におけるＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来の酵素につい
てはαのの活性測定法に従って測定し、牛の脳由来の酵
素については前述の活性測定法に従って測定した結果は
第５図に示した。

Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ；
−・− 牛の脳；−ｍ− ４、図面の簡単説明 第１図は本発明のミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ
の熱安定性を示す曲線、第２図はその至適温度を示す曲
線、第３図はそのｐＨ安定性を示す曲線、第４図はその
至適ｐＨを示す曲線、第５図は本発明のミオ・イノシト
ールデヒドロゲナーゼの熱安定性を示す曲線である。

第１ 図 （０Ｃ） 第２ 図 （０Ｃ） ｐＨ 第４ 図 ｐＨ ；ＪＬ＆（’Ｃ） 手続補正書 平成３年１２月　５日

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）基質特異性として少なくともミオ・イノシトール
   に基質特異性を有し、酵素作用として下記式ミオ・イノ
   シトール＋ＮＡＤ＾＋■ ミオ・イノソース＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＾＋ に示すように、少なくともミオ・イノシトールおよびＮ
   ＡＤ＾＋からミオ・イノソースおよびＮＡＤＨ＋Ｈ＾＋
   を生成する反応を触媒し、６０℃における残存活性が９
   ５％以上である特徴を有するミオ・イノシトールデヒド
   ロゲナーゼ。
2. （２）少なくとも下記の理化学的性状を有する請求項１
   記載のミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ。 ［１］分子量：１３０，０００±１５，０００（ＴＳＫ
   ゲルＧ３０００ＳＷによる濾過法） ［２］等電点：ｐＨ４．５±０．５ ［３］Ｋｍ価： ミオ・イノシトールに対するＫｍ値：０．６４ｍＭ ＮＡＤ＾＋に対するＫｍ値：０．００４ｍＭ ［４］至適ｐＨ：ｐＨ９．５付近 ［５］ｐＨ安定性 ：ｐＨ６．５〜９．０で８０％以上の 残存活性を有する。
3. （３）バチルス属に属するミオ・イノシトールデヒドロ
   ゲナーゼ生産菌を培地に培養し、得られた培養物からミ
   オ・イノシトールデヒドロゲナーゼを採取することを特
   徴とするミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼの製造法
   。
4. （４）バチルス属に属するミオ・イノシトールデヒドロ
   ゲナーゼ生産菌が、バチルス・エスピーＮｏ．３〔微工
   研条寄第３０１３号（ＦＥＲＭＢＰ−３０１３）〕であ
   る請求項３記載の製造法。