JPH04126099A - ミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床生化学検査、食品検査等におけるミオイ
ノシトールの酵素サイクリング反応を用いた新規な高感
度測定法およびミオイノシトール定量用組成物に関する
。

〔従来の技術〕

ミオイノシトールはイノシトールの９つの異性体の１つ
で、極めて安定した環状アルコールである。

人の場合、ミオイノシトールは食事により１日約１ｇ、
腎臓における生合成により約２ｇが供給され、細胞への
取り込みと腎臓における排泄・再吸収および酸化により
血漿レベルがほぼ一定になるように調節されている。そ
のため腎機能障害においては血漿ミオイノシトールレベ
ルの著明な増加が見られる〔臨床科学２４巻、１１号、
１４４８−１４５５頁（１９８Ｂ））。このようにミオ
イノシトールを測定することによって腎機能のモニタリ
ングができる。

従来、ミオイノシトールはガスクロマトグラフィ、高速
液体クロマトグラフィー等で測定されいるが、検体の前
処理が必要であり、また操作も煩雑１臨床検査等大量の
検体測定には用い難い。また、ｒ常価も３０μｍ　ｏ　
ｌ　／　１．付近と低値であり　Ｃ日本に床化学会年会
記録第２８集（１９８Ｂ））簡便で運感度な測定方法が
望まれている。

〔発明が解決しようとする課題〕

微量の基質や酵素活性を酵素サイクリング法として二種
類の酵素を用いて増幅する手法が従来より失られている
。よく知られたものとしてＮＡＤサイクリング、ＣｏＡ
サイクリング、ＡＴＰサイクリンクなどがあるが、臨床
検査等のルーチン分析において操作が煩雑なため、はと
んど用いられていないの力現状である。

本発明者らはミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ
，１，１，１，１８）がチオＮＡＤ　（Ｐ）類に作用し
て、サイクリング反応を形成し得ることを見出した。

本発明はＮＡＤ及びＮＡＤＰのアナログであるチオＮＡ
Ｄ　（Ｐ）類ととＮＡＤ　（Ｐ）類の還元型吸収極大波
長が、それぞれ４００ｎｍ付近、３４０ｎｍ付近と異な
っていることを利用したもので、ミオイノシトールデヒ
ドロゲナーゼを用いた酵素サイクリング反応を実施する
にあたり、二種類の補酵素のひとつにチオＮＡＤ　（Ｐ
）類を使用して、どちらが−方の補酵素の変化量のみを
分別定量することによるものであり、その結果、ミオイ
ノシトールを高感度に測定できる。

すなわち、本発明は被検体に、 ■チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドポスフェ
ート類（以下、チオＮＡＤＰ類という）及びチオニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、チオＮＡＤ
類という）からなる群より選ばれるひとつと、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以下、
ＮＡＤＰ類という）およびニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド類（以下、ＮＡＤ類という）からなる群より
選ばれるひとつとを補酵素とし、少なくともミオイノシ
トールを基質としてミオイノソースを生成する可逆反応
をなすミオイノシトールデヒドロゲナーゼ、 ■Ａ１、 ■Ｂ１　、 を含有する試薬を作用セしめて、次の反応式（Ｉ）８２
　　　　　　　　　　　Ｂｌ　　　　　（Ｉ）（式中、
Ａ置よチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類また
はＮＡＤ類を示し、ＡＺはＡ、の還元型性成物を示し、
Ｂ、はＡ、がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のとき
は還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ、がＮ
ＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類
または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型
生成物を示す）で表されるサイクリング反応を形成せし
め、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定
することを特徴とするミオイノシトールの高感度定量法
、並びに上記■、■及び■を含有することを特徴とする
ミオイノシトール定量用組成物を提供するものである。

本発明において、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼと
しては、上記条件を具備するものであれば何れのもので
も使用できるが、その具体例として、酵素ハンドブック
（朝倉書店ｐ６）記載の本酵素住産菌Ａｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ　　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　（Ｊ。

Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、２４１，８００−８０６　（１９６
６））、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ、５ｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ。

Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、。

２９３．２９５−３０３　（１９７３））、牛脳〔Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、
、６８．１１３３　１１３８　（１９７６））およびＢ
ａｃ　ｉ　１１ｕｓ　　１上、Ｎｏ、３　（東洋醸造社
製）が挙げられる。しかしながら、Ａｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒ　　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　　
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓ
ｃｅｎｓの三種は標準微生物学第２版（医学書院ｐ２０
９−２１２）によると肺炎あるいは日和見感染起因菌と
して化学療法剤、抗生物質に抵抗性を有する難治性感染
菌として知られており、このような病原菌を工業的規模
で培養することは実質的には困難である。また酵母Ｃｒ
ｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍの生産
する酵素のミオイノシトールに対するＫｍ値は約１１．
０ｍＭ、ＮＡＤに対するＫ　ｍ　（＠：は約０．０７ｍ
Ｍと記載されており、Ｋｍ値が高いため充分な反応速度
が得られ難い。〔酵素ハンドブック、ｐ６） そこで、本発明者らは、ミオイノシトールを測定する目
的で、危険性のない、培養活性の高い、基質であるミオ
・イノシトールとＮＡＤ”に対するＫｍ値のできるだけ
低い、安定で精製の簡単な酵素を生産する菌株を広く自
然界よりスクリーニングしたところ、静岡県賀茂郡東伊
豆町熱用の温泉近くの土壌より分離したＢａ　ｃ　ｉ　
］　１　ｕ　５−１１Ｎｏ、　　３菌株が目的とする性
質を有するミオイノシトールデヒドロゲナーゼを産生ず
ることを見出した。

本発明者らが見出したＢａ　ｃ　ｉ　］　ｌ　ｕ　ｓ　
　土り。

Ｎｏ、３の生産するこの酵素は、ｐＨａ、５において測
定したミオイノシトールとＮＡＤ’に対するＫｍ値がそ
れぞれ約０．６ｍＭ、０．００４ｍＭと非常に低い、反
応性の高い性質を有し、かつほぼ６０℃の緩衝液中で約
１５分間処理した後の活性が、処理前の活性の約９５％
以上の値を保持している性質を有している新規なミオイ
ノシトールデヒドロゲナーゼあり、かつ補酵素としてＮ
ＡＤ　（Ｐ）類のみならずチオＮＡＤ　（Ｐ）類も補酵
素として利用する酵素であることを知り、また、本酵素
は、バチルス属に属するミオイノシトールデヒドロゲナ
ーゼ生産菌を培地に培養し、得られた培養物からミオイ
ノシトールデヒドロゲナーゼを採取してミオイノシトー
ルデヒドロゲナーゼを製造できる。

ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ生産菌はバチルス属
に属するが、例えば本発明者らが分離したＮｏ、３菌株
は、本発明における酵素の製造に最も有効に使用される
菌株の一例であって、本菌株の菌学的性質を示すと次の
通りである。

（ａ）形態的特徴 端の丸いまっすくまたはやや曲がった桿状細菌で大きさ
は０．５〜０．７Ｘ１．５〜３．５μｍで周毛で運動す
る。端または亜端に０．８Ｘ１．０〜２０８ｍの楕円〜
卵形の芽胞を形成し、芽胞によって菌体は膨張する。多
形性なし。

（ｂｌ各培地における生育状態 各種培地上で、１〜２日、５０〜５ 観察した所見は次の通りである。

■普通寒天平板培地 円形で丘状（ｃｏｎｖｅｘ）の集落を形成する。

表面は滑らかで縁は丸い。黄土色〜淡黄出色を呈するが
、可溶性色素は産生じない。

■普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。

可溶性色素は産生じない。

■液体培地（ペプトン水） 生育良好で一様に混濁する。

■リドモスミルク培地 ４〜５日後、弱酸性になる。

ＤＮＡの００モル％：４１．９モル％ 主たるイソプレノイドキノン：ＭＫ−７（ＨＰ　Ｌ　Ｃ
法） ２℃で培養し、 淡黄土〜黄土色を呈する。

ｔｅｌ生理的、 生化学的性質 ダラム染色 ＫＯＨ反応 カプセル形成 抗酸性染色 ＯＦテスト （Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉ ○Ｆテスト （Ｎ源にＮ　Ｈａ　Ｈ！ 好気での生育 嫌気での生育 生育温度　７０℃ ６０℃ ３７℃ ３０℃ 食塩耐性　　０％ ３％ ５％ 〔＋；陽性、（＋）； 弱陽性、−；陰性、 ＮＴ；未実験〕 十 ５ｏｎ） Ｏ４ ＮＴ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 生育ｐＨ５，６ ６，２ ９，０ ゼラチンの分解 澱粉の分解 カゼインの分解 エスクリンの分解 チロシンの分解 アルギニンの分解 セルロースの分解 カタラーゼ産生 オキシダーゼ産生 レシチナーゼ産生 ウレアーゼ産生（Ｓ　Ｓ　Ｒ） ウレアーゼ産生（Ｃｈｒｉｓ） インドール産生 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） アセトイン産生（Ｋ、ＨＰＯ３） アセトイン産生（ＮａＣ＃） ＭＲテスト （＋） 硝酸塩還元テスト（ガス産生） （ＮＯ７−の検出） （ＮＯｌ−の検出） シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 リンゴ酸塩 マレイン酸塩 マロン酸塩 プロピオン酸塩 グルコン酸塩 コハク酸塩 クリステンゼン培地での利用性 クエン酸塩 リンゴ酸塩 マレイン酸塩 マロン酸塩 プロピオン酸塩 グルコン酸塩 コハク酸塩 グルコースよりガスの産生 各種糖類より酸の産生 アドニトール Ｌ（＋）アラビノース セロビオース ヅルシトール メソ・エリスリトール フラクトース フコース ガラクトース グルコース グリセリン イノシトール イヌリン ラクトース マルトース マンニトール マンノース メレジトース メソビオース ラフィノース ラムノース　　　　　　　　　　　　　　＋Ｄ−リボー
ス　　　　　　　　　　　　＋サリシン　　　　　　　
　　　　　　　＋Ｌ−ソルボース ソルビトール 澱粉　　　　　　　　　　　　　　　　十すフカロース
　　　　　　　　　　　　＋トレハロース　　　　　　
　　　　　　　＋キシロース 以上の通り、本菌株の主性状は、グラム陽性の桿状細菌
で、大きさは０．５〜０．７Ｘ１．５〜３゜５μｍ、周
毛で運動、芽胞形成、多形性なし、グルコースを醗酵的
に分解し、酸を産生ずる。カタラーゼ・オキシダーゼ産
生。高温性の通性嫌気性であり、これらのグラム陽性桿
菌で芽胞を形成し、好気で生育する特徴から、バチルス
属に属すると判断された。

そこで、本菌株がバチルス属のどの種に属するか否かを
同定した。即ち、Ｂｅｒｇｅｙ’　　ｓ　　Ｍａｎｕａ
ｌ　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、２によれば、高温（５０℃）で
生育する菌種はバチルス　アシドカルダリウス（Ｂ、ａ
ｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス　サブチリス
（Ｂ、５ｕｂｔ　ｉ　］　ｉｓ）　、バチルス　バジウ
ス（Ｂ、ｂａｄ　１ｕｓ）　、バチルス　フレビス（Ｂ
、ｂｒｅｖｉｓ）　、バチルス　コアグランス（Ｂ、ｃ
ｏａｇｕ　１ａｎｓ）　、バチルス　リケニフォルミス
（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス　パン
トセンチカス（Ｂ、ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔ　１ｃｕｓ）
　、バチルス　シェゲリ　（Ｂ、　　ｓｃｈｅｇｅ　１
１　ｉ）　、バチルス　ステアロサーモフィルス　（Ｂ
、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕＳ）の９菌種が
記載されている。その内で、嫌気下で生育する菌種はバ
チルス　Ｂ、ｃｏａｇｕｌａｎｎｓとＢ、ｌｉｃｈｅｎ
ｆｏｒｍｉｓの２菌種のみである。即ち、１３．ｃｏａ
ｇｕｌａｎｎｓ　　（以下、「Ｃ」と略記することがあ
る）およびＢ、Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（以下、ｒ
ＬＪと略記することがある）と本面とを対比した結果は
、次の通りである。

尚、Ｃ，Ｌおよび本面で示される「＋」は陽性、ｒ　（
＋）　Ｊは弱陽性、「−」は陰性、ｒｄＪは菌株によっ
て異なる、ＮＤはデータなしであることを示す。

ＣＬ　　　本面 オキシダーゼ産生　　　　−ｄ　　＋ 芽胞による膨張　　　　　ｄ−十 嫌気生育　　　　　　　　十　　＋　　＋アセトイン産
生　　　　　＋　　＋ グルコース（酸）　　　　　十　　÷　　十Ｌ・アラビ
ノース（酸）　　十　　→　　千キシロース　　　　　
　　ｄ　　＋ マンニット　（酸）　　　　　ｄ　　＋　　＋カゼイン
分解　　　　　　ｄ　　＋ ゲラチン分解　　　　　　ｄ　　十 デンプン分解　　　　　　−＋（＋） クエン酸塩利用　　　　　＋　　＋ プロピオン酸塩利用　　　ｄ　　＋ チロシン分解　　　　　　−十 ＬＶ反応　　　　　　　　−＋ インドール産生　　　　　−＋ 食塩耐性　２％　　　　　十　　＋　　十５％　−十 ７％　　　　　−＋ １０％　　　　　−ＮＤ 生育温度４０℃　　　　　＋＋＋ ５０℃　　　　　＋　　＋　　＋ ５５　℃　　　　　　　　　　　十　　　　　＋　　　
　　＋６０℃　　　　　ＮＤ　　ＮＤ　　＋ ７０℃ 硝酸塩還元　　　　　　　ｄ　　＋ ＤＮＡの００モル％　　４４．５　４６．４　４１．９
（Ｔｙｐｅ）　（Ｔｙｐｅ） ４４．３　４２．９ 〜５０．３　〜４９．９ 以上対比した結果によれば、本菌株Ｎ００３の諸性状は
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｏａｇｕｌａｎｓに近いと考え
られるが、アセトイン産生能、ＤＮＡの００モル％、ま
た上記対比表には載せていないが、リドモスミルク培地
での反応も違っている。

よって、本菌株を公知のものと区別するため、バチルス
・エスピーＮｏ、３　（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、Ｎｏ、
３）と命名し、通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所に受託番号微工研条寄第３０１３号（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−３０１３）として寄託した。

本発明においては、先ずバチルス属に属するミオイノシ
トールデヒドロゲナーゼ生産菌が適当な培地に培養され
る。

上記のミオイノシトールデヒロゲナーゼ生産菌としては
、前述のバチルス・エスピーＮ００３が挙ケられるが、
細菌の一般的性状として蘭学上の性質は変異し得るもの
であるから、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射
、放射線照射または変異誘導剤、例えばＮ−メチル−Ｎ
−二トローＮ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスル
ホネートなどを用いる人工的変異手段により変異し得る
人工変異株は勿論、自然変異株も含め、バチルス属に属
し、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼを生産する能力
を有する菌株は、すべて本発明に使用することができる
。

上記の培養は、細菌の培養に一般に用いられる条件によ
って行うことができるが、本菌株の培養にあたっては、
ミオイノントールデヒロゲナーゼがミオイノシトールに
よって誘導的に生成される誘導酵素であることから、例
えばミオイノシトール０．５％〜５％を含む培地で培養
することが、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの生産
性を１０〜３００倍程度良好とするので好ましい。

培地としては、ミオイノシトールを添加する以外に微生
物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらには必
要に応し、無機塩などを含有させた栄養培地が使用され
る。

同化し得る炭素源としては、グルコース、フラクトース
、サッカロースなどが単独または組み合わせて用いられ
る。消化し得る窒素源としては、例えばペプトン、肉エ
キス、酵母エキスなどが単独または組み合わせて用いら
れる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、
カルシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、その他、鉄
、マンガンなどの種々の重金属塩などが使用される。上
記以外に公知の同化し得る炭素源、消化し得る窒素源が
使用できることはいうまでもない。

培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条
件下で行うのがよく、工業的には深部通気攪拌培養が好
ましい。培養温度はミオイノシトールデヒロゲナーゼ生
産菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得
るが、通常は４０〜６０℃、特に５０℃付近が好ましい
。培養時間は培養条件によって異なるが、本酵素が最高
力価に達する時期を見計らって適当な時期に培養すれば
よいが、通常は１〜２日間程度である。

これらの培地組成、培地の液性、培養温度、撹拌速度、
通気性などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条
件などに応して好ましい結果が得られるように適宜調節
、選択されることは言うまでもない。

液体培養において発泡があるときは、シリコン油、植物
油などの消泡剤が適宜使用される。

このようにして得られたミオイノシトールデヒドロゲナ
ーゼは、主として菌体内に含有されるので、得られた培
養物から濾過または遠心分離等の手段により集菌し、こ
の菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスピー
ズ処理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やリヅチーム
等の酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜組み
合わせて、粗製のミオイノシトールデヒロゲナーゼ含有
液が得られる。

次いで、この粗製のミオイノシトールデヒドロゲナーゼ
含有液から公知の蛋白質、酵素等の単離、精製手段を用
いることによりさらに精製されたミオイノシトールデヒ
ドロゲナーゼを得ることができる。

例えば粗製のミオイノシトールデヒドロゲナーゼ含有液
に、硫安、硫酸ナトリウム等を添加する塩析沈澱法によ
り本酵素を回収すればよい。さらにこの沈澱物は、分子
篩、各種の樹脂を用いたクロマトグラフィー法、電気泳
動法あるいは超遠心分析法を適宜組み合わせ用いて、必
要に応じて精製すればよく、その精製手段としては、目
的とするミオイノシトールデヒドロゲナーゼの性質を利
用した手段を用いればよく、例えば上記の沈澱物を水ま
たは緩衝液ムこ溶解した後、必要に応して半透膜にて透
析し、さらにＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セファ
セル、ＤＥＡＥ−セファロース、ＤＥＡＥ−セファデッ
クス、Ｑ−セファロース（ファルマシアり　、ＤＥＡＥ
トヨバール（東洋曹達社製）ハイトロキシルアパタイト
等のイオン交換樹脂や、オクチルセファロース、フェニ
ル−セファロース（ファルマシア社製）等の疎水クロマ
ト樹脂や、その他のアフィニティークロマト樹脂が使用
される。また、セファデックスＧ−１００、セファアク
リルＳ−２００等のゲル濾過剤による分子篩クロマトや
、さらに必要に応じて透析膜を用いて脱塩すればよい。

その後、必要に応じて糖類、例えばマンニトール、サッ
カロース、ソルビトール等、アミノ酸、例えばグルタミ
ン酸、グリシン等、ペブタイドまたは蛋白質として牛血
清アルブミン等の安定剤の０．０５〜１０％程度を添加
し、凍結乾燥等の処理により精製されたミオイノシトー
ルデヒドロゲナーゼの粉体を得ることができる。

ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの性状は以下の通り
である。

（１）基質特異性 ミオイノシトール　　　　　　　　１００％グルコース
　　　　　　　　　　　　　Ｏフルクトース　　　　　
　　　　　　　　Ｏガラクトース　　　　　　　　　　
　　０ソルビトール　　　　　　　　　　　　Ｏマンノ
ース　　　　　　　　　　　　　　Ｏマルトース　　　
　　　　　　　　　　０サン力ロース　　　　　　　　
　　　　Ｏラクトース　　　　　　　　　　　　　０（
２）酵素作用 下記式に示すように少なくともミオイノシトールおよび
ＮＡＤ”よりミオイノソースおよびＮＡＤＨを生成する
反応を触媒する。

ミオイノシトール＋ＮＡＤ’　　□ ミオイノソース”＋ＮＡＤＨ十Ｈ” ＊　（２，４，６／３．５−ペンタヒドロキシシクロヘ
キサノン） （３）分子量 １３０．０００±１５，０００ トーソー社製ＴＳＫゲル３０００ＳＷ（０，７５ｘ５Ｑ
ｃｍ）による値、溶臼液；０．２Ｍ　　ＮａＣｌ含有０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　、標準品はオリエ
ンタル酵母社製の次の分子量マーカーを使用。

Ｍ、Ｗ、　　　１２，４００　　　シトクロムＣＭ、Ｗ
、　　　３２．０００　　　アデニレイトキナ−一ゼ Ｍ、Ｗ、　　　６７．０００　　　牛血清アルブミンＭ
、Ｗ、１４２，０００　　　ラクテートデヒドロゲナー
ゼ Ｍ、Ｗ、２９０，０００　　　グルタメートデヒドロゲ
ナーゼ （４）等電点 ｐＨ４，５±０．５ キャリアアンフオライトを用いる焦点電気泳動法により
４℃、７００ｖの定電圧で４０時間通電した後、分画し
、各画分の酵素活性を測定した。

（５１Ｋ　ｍ値 １００ｍＭ　　トリス塩酸緩衝！（ｐＨ８，５）、５Ｕ
　　ジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、１ｍＭ　　ＮＡ
Ｄ”　　（オリエンタル酵母社製）、０．０２５％　Ｎ
ＴＢ　（和光紬薬工業社製）を含む反応液中でミオイノ
シトールの濃度を変化させて、ミオイノシトールに対す
るＫｍ値を測定した結果は、０．６４ｍＭの値を示した
。

一方、前記反応液中でＮＡＤ”の代わりに１５ｍＭのミ
オイノシトールを添加し、ＮＡＤ”の濃度を変化させて
ＮＡＤ”に対するＫｍ値を測定した結果は、０．００４
ｍＭの値を示した。

また、補酵素として１ｍＭのＮＡＤ”の代わりに１ｍＭ
チオＮＡＤ”　　（シグマ社製）を用いて同様にミオイ
ノシトールに対するＫｍ値を測定した結果は１０．０ｍ
Ｍの値を示した。

一方、チオＮＡＤ”の代わりに１５０ｍＭのミオイノシ
トールを添加したところ、チオＮＡＤ”に対するＫｍ値
は０．１７ｍＭの値を示した。さらに、ＮＡＤＰ”とミ
オイノシトールとの反応におけるＮＡＤＰ”に対するＫ
ｍ値は０．１９ｍＭ、ミオイノシトールに対するＫｍ値
は３０．９１ｍＭであり、さらにまたチオＮＡＤＰ”　
とミオイノシトールの反応におけるチオＮＡＤＰ’に対
するＫｍ値は２．５４　ｍ　Ｍ　％　ミオイノシトール
に対するＫｍ値は１７９゜６２ｍＭであった。

また以上のことからも、本酵素はＮＡＤ　（Ｐ）’のみ
ならず、チオＮＡＤ　（Ｐ）”についても補酵素として
利用するものであることが明らかである。

（６）至適ｐＨ 後記の酵素活性測定法に従い、反応液中の１００ｍＭｈ
リス塩酸緩リン酸緩衝液５）に代えて１００ｍＭのリン
酸緩衝液（ｐＨ６，５〜８．０、−〇−）、トリス塩酸
緩衝液（ｐ　Ｈ８，０〜９，０、ロー）およびグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ）ＩＣ１，０〜１０．０
、−■−）の各緩衝液を用いて測定した活性の相対値の
結果は第４図に示す通りであって、ｐＨ９，５付近で最
大の活性を示す。

（７１ｐ　Ｈ安定性 本酵素（ｌｕ／ｍｆ）を４０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４
，５〜６．０、−ム一）、リン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜
８．０、−〇−）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０〜９
．５、−ロー）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９，０〜１０．０、−一）の各緩衝液で調製し
、５０℃で１５分間加熱処理した後、その残存活性を後
記の酵素活性測定法に従って測定した結果は、第３図に
示す通りであって、ｐＨ６，５〜９．０の範囲で８０％
以上の活性を保持している。

（８）熱安定性 本酵素液（Ｉｕ／ｍｆ）を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７）で調製し、１５分間加熱処理後、その残存活性
を後記の酵素活性測定法に従って測定した結果は、第１
図に示される通りであって、６０℃までは残存活性とし
て９５％以上を有する安定なものであった。

（９）至適温度 １００ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）を用い、後
記の酵素活性測定法に従い、３５．４０．４５．５０．
５５．６０および６５℃の各温度で１０分間反応後、０
．ＩＮ塩酸２ｍ！！で反応を停止し、波長５５０ｎｍで
吸光度を測定した相対値の結果は、第２図に示す通りで
あって、６０℃付近で最大の活性を有している。

００）ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼ活性測定法 ■反応液組成 １００ｍＭ　　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）、１５
ｍＭ　　ミオイノシトール（和光紬薬社製）１ｍＭ　　
ＮＡＤ”　　（オリエンタル酵母社製）５Ｕ　　ジアフ
ォラーゼ（東洋醸造社製）、０．０２５％ＮＢＴ　（和
光紬薬工業社製）、■酵素活性測定 上記の反応液１ｍ！！を小試験管に入れ、３７℃で５分
間インキュベートした後に、適当に希釈した酵素液０．
０２ｍ１を添加して攪拌し、反応を開始する。正確に１
０分間反応の後に、０．ＩＮ塩酸２゜０ｍｌを添加して
攪拌し、反応を停止して、Ａ９．。

ｎｍを測定して吸光度Ａ１を求める。上記反応液よりミ
オイノシトールを除いた反応液を用いて同様の測定を行
い、その吸光度Ａｏを求める。

■計算式 ％式％ 前記反応式（１）においてＡ、およびＢ２はチオＮＡＤ
Ｐ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類を示すが、
チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類としては、例えばチ
オニコチンアミドアデニンジヌクレオチオドホスフェー
ト（チオＮＡＤＰ）　、チオニコチンＸミドヒボキサン
チンジヌクレオチドホスフェート、およびチオニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）　、チオ
ニコチンアミドヒボキサンチンジヌクレオチドが挙げら
れ、又、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類としては、例えばニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（Ｎ
ＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホ
スフェート　（アセチルＮＡＤＰ）　、ニコチンアミド
ヒボキサンチンジヌクレオチドホスフェート（デアミノ
ＮＡＤＰ）；及びニコチンアミノドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオ
チド（アセチルＮＡＤ）　、ニコチンアミドヒボキサン
チンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）が挙げられる。

本発明のＡ、およびＢ１において例えばＡ１がチオＮＡ
Ｄ　（Ｐ）類である場合Ｂ、はＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ類であ
ることが必要であり、Ｂ、がチオＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ類で
ある場合Ａ、はＮＡＤ　（Ｐ）Ｎであることが必要であ
り、Ａ１およびＢ、の関係において１つのチオ型補酵素
を使用するものである。

又、定量に用いるミオイノシトールデヒドロゲナーゼが
チオＮＡＤ類とＮＡＤ類を補酵素とする場合は、上述の
チオＮＡＤ類とＮＡＤｉより、また、用いるミオイノシ
トールデヒドロゲナーゼがチオＮＡＤ　（Ｐ）！及びＮ
ＡＤ　（Ｐ）類を共に補酵素とする場合は、上述のチオ
ＮＡＤ類及びチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類及びＮＡＤＰ類
より適宜選択して用いればよい。

Ａ、およびＢ＋　の量は、被検体中のミオイノシト−ル
の量に比較して過剰量であり、またミオイノシトールデ
ヒドロゲナーゼのＡ、及びＢ、それぞれに対するＫｍ値
に比較しても過剰量であることが必要であり、特にミオ
イノシトール量の２０〜１００００倍モルが好ましい。

本発明のミオイノシトール定量用組成物においては、Ａ
１及びＢ、の濃度は０．０２〜１００ｍＭ。

特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、ミオイノシトール
デヒドロゲナーゼの量は５〜１０００ｕ／ｍＩ！、特に
２０〜５００ｕ／ｍｆが好ましいが、その量は被検体の
種類等により適宜決定することができ、これ以上の量を
用いることもできる。

また、本発明定量法は更に被検体に■成分としてミオイ
ノシトールに作用せず、Ｂ　ｚ　＝　Ｂ　＋の反応を形
成する第二のデヒドロゲナーゼ及び該第二のデヒドロゲ
ナーゼの基質を組み合わせて作用せしめることにより、
後記反応式（Ｉ［）のごとく、Ｂ、とＢ２の間にＢ、の
再生のための反応系を付与せしめることによりミオイノ
シトールのサイクリング反応を形成せしめ得る。この場
合、定量の際には反応により生成したＡ２の量を測定す
る。

Ａ１　ミオイノシトール　Ａ２ ナーゼ　　　　　　　　（ＩＩ） （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ、の還元型生成物
を示し、Ｂ、はＡ、がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ＠またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤｉを示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示し、Ｂ　ｚ　”””　Ｂ　＋への反
応はＢ２を補酵素として第二のデヒロゲナーゼにてＢ１
を生成する酵素反応を示す）すなわち、第二のデヒドロ
ゲナーゼはＢＩの再生のために補助的に添加するもので
あり、これによってＢ、の使用量を少なくすることが可
能となり、特にＢ、が高価な場合は有効である。又、Ｂ
、の代わりにＢ２あるいはＢ１と８２の混合物を用いて
反応を行ってもよい。この場合、Ｂ１または／及びＢ２
の使用量は特に限定されるものではないが、−射的には
Ａ１の１／１０モル以下が好ましく、より好ましくは１
１５０〜１／１０００モルまたはそれ以下であってもよ
い。

この成分■を用いるミオイノシトール定量用組成物にお
いて、Ａ１の濃度は０．０２’−１００ｍＭ。

特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ｂ２または／及び
Ｂ、の濃度は０．０５〜５０００μＭ、特に５〜５００
μＭが好ましく、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの
濃度は５〜１０００μ７ｍｌ、特に２０〜５００ｕ／ｍ
！！が好ましく、第二のデヒドロゲナーゼはＢ２に対す
るＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量（ｕ　／　ｍ　１単位
）以上になるように調製すればよく、例えば１〜１００
ｕ／ｍｊ！が好ましく、また第二のデヒドロゲナーゼの
基質は過剰量、例えば０゜０５〜２０ｍＭが好ましい。

これらの量は被検体の種類等により適宜決定することが
でき、これ以上の量を用いることもできる。

第二のデヒドロゲナーゼ及び第二のデヒドロゲナーゼの
基質としては、例えば、Ｂ、がＮＡＤ類またはチオＮＡ
Ｄ類のときは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１
，１，１，１）とエタノール、グリセロールデヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣ，１，１，１，６）（Ｅ、Ｃｏ１１由来）
とグリセロール、グリセロール−３−リン酸デヒロゲナ
ーゼ（ＥＣ，１，１゜１．８）（ウサギ筋肉由来）とＬ
−グリセロール−３−リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ，１゜１．１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由
来）とＬ−リンゴ酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，１，１２）（ウサギ骨格筋
、肝、酵母、Ｅ、Ｃｏ１１由来）とＤ−グリセロアルデ
ヒドリン酸とリン酸、Ｂ２がＮＡＤＰ類またはチオＮＡ
ＤＰ類のときは、グルコース−６−リン酸デヒロゲナー
ゼ（ＥＣ，１，１，１，４９）（酵母由来）とグルコー
ス−６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
，１，１，１，４２）（酵母、ブタ心筋由来）とイソク
エン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，
２，１，１７）　　（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ　　ｏｘ
ａ］ａｔｉｃｕｓ由来）とＣｏＡとグリオキシル酸、ホ
スホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，１，
４４）　　（ラット肝、ビール酵母、Ｅ、ｃｏｌｊ由来
）と６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒド
リン酸デヒロゲナーゼ（ＥＣ，１，２，１，１３）（植
物葉緑体由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸
とリン酸、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ。

１．２．１．７）　　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来）とベンズアルデヒド等が挙
げられる。

更にまた、本発明定量法は更に被検体に■成分としてミ
オイノシトールに作用せず、Ａ２→Ａ１への反応を形成
する第３のデヒドロゲナーゼ及び該第三のデヒドロゲナ
ーゼの基質を作用せしめることにより、後屈反応式（Ｉ
ＩＩ）の如く、Ａ１とＡ２の間に八〇の再生の為の反応
系を付与せしめることによりミオイノシトールのサイク
リング反応を形成し得る。

この場合、 定量の際にはＢ１ の消費量を測定する。

ＡＩミオイノシトール　Ａｔ Ｂ、　　　　　　　　　　　　　　　Ｂ、　　　　（Ｉ
ｎ）（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、Ｎ
ＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ、はＡ、の還元型生
成物を示し、Ｂ１はＡ、がチオＮＡＤＰ類またチオＮＡ
Ｄ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を
、Ａ、がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオ
ＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ
１の酸化型生成物を示し、Ａ２−４　Ａ　、への反応は
Ａ２を補酵素として第三のデヒドロゲナーゼにてＡ、を
生成する酵素反応を示す）すなわち、第三のデヒドロゲ
ナーゼはＡ、の再生のために補助的に添加するものであ
り、これによってＡ１の使用量を少なくすることが可能
となり、特にＡ、が高価な場合には有効である。又、Ａ
１の代わりにＡ２あるいはＡ、とＡ２の混合物を用いて
反応を行ってもよい。この場合、Ａ１または／及びＡ。

の使用量は特に限定されるものではないが、−船釣には
Ｂ１の１／１０モル以下が好ましく、より好ましくは１
１５０〜１／１０００モルまたはそれ以下であってもよ
い。

この成分■を用いるミオイノシトール定量用組成物にお
イテ、Ｂ、（７）１度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０
．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ａ２または／及びＡ、の
濃度ハ０．　０５〜５０００　ｕＭ、特に５〜５００μ
Ｍが好ましく、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの濃
度は５〜１０００　ｕ／ｍ７！、特に２０〜５００ｕ／
ｍ７！が好ましく、第三のデヒドロゲナーゼはＡ２に対
するＫｍ値（ｍＭ値）の２０倍量（ｕ／ｍＩ！単位）以
上になるように調製すればよく、例えば１〜１００ｕ／
ｍβが好ましく、また第：のデヒドロゲナーゼの基質は
過剰量、例えばｏ、０５〜２０ｍＭが好ましい。これら
の量は被検体の種類等により適宜決定することができ、
これ以上の量を用いることもできる。

第三のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例えば
Ａ、がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときは、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，１１）とアセトア
ルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，１，
１，１，６）（Ｅ、Ｃｏ１１由来）とジヒドロキシアセ
トン、グリセロール−３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
，１，１，１，８）　（ウサギ筋肉由来）とジヒドロキ
シアセトンリン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ，
１，１，１３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とオギザ
ロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（
ＥＣ，１，１，１，１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、
Ｅ、Ｃｏ１１由来）と１．　３−シ＊ス＊−Ｄ　−グリ
セリン酸、Ａ１がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類のと
きは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
，１，１，１，４９）（酵母由来）とグルコノラクトン
−６ゝ−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣ，１，２，１，１３）（植物葉緑体由来）
と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン等が挙げられる。

本発明のミオイノシトール定量用組成物の調製にあたっ
て、使用できるミオイノシトールデヒドロゲナーゼに関
しては、例えば補酵素としてＮＡＤ類（好ましくはＮＡ
Ｄ）　、チオＮＡＤ類（好ましくはチオＮＡＤ）　、あ
るいはＮＡＤＰ類（好ましくはＮＡＤＰ）、チオＮＡＤ
Ｐ類（好ましくはチオＮＡＤＰ）を用いて基質であるミ
オイノシトールに対する反応性を有するものであればよ
く、本発明の知見に基づき、これら補酵素と基質を用い
て確認できるものである。

反応液組成については、使用するミオイノシトールデヒ
ドロゲナーゼの各種補酵素間の相対活性等を考慮して二
種の補酵素を適宜選択し、その後圧反応／逆反応の至適
ｐＨの間でｐＨ条件を酵素サイクリング反応が効率よく
進行するように設定すればよい。

例えば１３ａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ、Ｎｏ、３　　（東
洋醸造社製）由来のミオイノシトールデヒドゲナーゼに
ついてみれば、補酵素にチオＮＡＤを用いた場合のＮＡ
Ｄを用いた場合に対する相対活性は約１０〜１５％であ
り、又、正反応の至適ｐＨは９．５付近で、また逆反応
の至適ｐＨは７〜７．５である。本酵素は更にＮＡＤ類
のみでなくＮＡＤＰ類をも補酵素とする。これら使用す
る酵素は単独でも、あるいは適宜２種以上を組み合わせ
て用いてもよい。

かくして、調製された本発明のミオイノシトール定量用
組成物によって被検体中のミオイノシトールを測定する
には、上記成分■〜■、■〜■、あるいは■〜■及び■
を含有する組成物に被検体０．００１〜０．５ｍｌを加
え、約３７℃の温度にて反応させ、反応開始一定時間後
の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分後
の１分間、または３分後と８分後の５分間における生成
されたＡｔＯ量または消費されたＢ１の量を、それぞれ
の吸収波長に基づく吸光度の変化によって測定すればよ
い。例えば、Ａ２がチオＮＡＤＨ，Ｂ、がＮＡＤＨの場
合、Ａ２の生成を４００ｎｍの吸光度の増加により測定
するか、あるいはＢ、の消費を３４０ｎｍの吸光度の減
少により測定し、既知？震度のミオイノシトールを用い
て測定したときの値と比較すれば、被検液中のミオイノ
シトール量をリアルタイムで求めることができる。

また、本発明定量法は、被検液中のミオイノシトールそ
のものを酵素サイクリング反応に導くものであり、被検
液中の共存物質の影響を受けにくいため、被検液のブラ
ンク測定を省略することができ、レイトアッセイによる
筒便な測定を成し得る。

尚、本発明においてはＡ２またはＢ１の測定に当たり、
吸光度測定の代わりに他の公知の測定法を使用して定量
を行うこともできる。

〔発明の効果〕

上述のごとく、本発明は還元型の吸収波長の異なる補酵
素を用いるため測定誤差を生じず、また、酵素サイクリ
ング反応を組み合わせることによって怒度を増大させる
ことができるため、少量の検体で迅速かつ正確に被検体
中のミオイノシトールを定量することができる、特に６
０℃にて９５％以上の残存活性を有する熱に安定なミオ
イノシトールデヒドロゲナーゼを用いることが好ましい
。

〔実施例〕

次いで本発明の実施例および参考例を挙げて具体的に述
べるが、本発明はこれによって何ら限定されるものでな
い。

±１−１ バチルス・エスピーＮｏ、３の培養： 酵母エキス（極東製薬社製）２％、ペプトン（極東製薬
社製）２％、リン酸２カリウム（和光紬薬社製）０．２
％、塩化カルシウム（和光紬薬社製）０゜０２％、ｇ酸
マグネシウム（和光紬薬社製）０．０５％、ミオイノシ
トール（和光紬薬社製）２％、ｐＨ７，３を含む液体培
地１００ｍｆを５００ｍＡ容三角フラスコに分注し、１
２０℃で２０分間加熱滅菌した後、これにバチルス・エ
スピーＮ００３の１白金耳を接種し、５０℃で１２Ｏｒ
、ｐ、ｍ、の振とう培養器で３０時間培養して種母８５
ｍ１　（酵素活性１．２ｕ／ｍβ）を得た。

一方、上記と同様の培地組成にて消泡側としてデイスフ
オーム４４２　（日本油脂）を０．１％添加した液体培
地２ＯＬを３ＯＬ容ジヤーフアメンターに仕込み、加熱
滅菌した後に上記の種母８５ｍ１を移植し、培養温度５
０℃、通気ｆ２０　Ｌ／分、内圧０４ｋｇ／ｃｍ”、攪
拌速度１５０ｒ、ｐ、ｍ、で２４時間通気培養し、培養
物１８．ＯＬ（酵素活性１．８ｕ／ｍｊりを得た。

養１」１−１ 実施例１で得た培養物を遠心分離で集菌し、これに０．
１％リヅチーム（エーザイ社製）を含む２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，５）５Ｌを加え、３７℃で１時間イン
キュベイトした後、遠心分離して沈澱物を除去し、上滑
４．５Ｌ　（６ｕ／ｍＡ）を得た。

この上清にアセトンを１．８Ｌ添加撹拌し、生じた沈澱
物を遠心分離して集め、これを２０ｍＭリン酸緩衝液で
溶解しＩＬの粗酵素液（２４，２ｕ／ｍｌ）を得た。こ
の溶液に固形硫安を２００ｇ溶解し、生した沈澱物を遠
心分離して除去し、得られた上清に再び固形硫安を２５
０ｇ溶解した。この処理液を遠心分離して得られた沈澱
物を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）で溶解し、
５００ｍ１！の酵素液（３６，３ｕ／ｍ１）を得た。こ
の酵素液を透析ｙ、（三光紬薬社製）を用いて２０Ｌの
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して一晩透析
し、得られた酵素液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
５）で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ　
（ファルマシア）２５０ｍｔ！のカラムに通し、０．１
ＭＫＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）Ｌ
Ｌを流した後、次いで０．３Ｍ　　ＫＣＩ！を含む２０
ｍＭ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で熔出し、酵素液３
５０ｍＪ　（３５，２ｕ／ｍｊりを得た。得られた酵素
液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）２０Ｌに対し
て一晩透析した。こうして得られた酵素液に牛血清アル
ブミン（シグマ社製）を０．２ｇ溶解した後に凍結乾燥
して、凍結乾燥標品１．１ｇ（１０，６ｕ／ｍｇ）を得
た。

亥！−上 〈反応系〉 ０ｍＭ ０、　２ｍＭ 　　　ｍＭ １５０ｕ／ｍｆ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ １０，０） 還元型ＮＡＤ　（オリエンタル酵母） チオＮＡＤ　（三共） ミオイノシトールデヒドロゲナー ゼ（東洋Ｎ　造、バチルス・エスピ ーＮｏ、３由来） 〈操作〉 上記試薬１ｍｌをキュベツトにとり、０．１０．２０．
３０．４０．５０μＭのミオイノシトール溶液をそれぞ
れ２０μｌを添加し、３７℃にて反応を開始させた。反
応開始後２分目と７分目の４００ｎｍにおける吸光度を
読み取りその差を求めた。その結果を第５図に示した。

第５図から明らかなように、ミオイノシトール量に対す
る吸光度変化量は良好な直線を示した。

ス１■Ｌ−１ 〈反応系〉 ４０ｍＭ　　　グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，５
） ０．１ｍＭ　　還元型デアミノＮＡＤ　（シグマ）２　
　ｍＭ　　　チオＮＡＤ　（三共）２００ｕ／ｍＺ　　
ミオイノシトールデヒドロゲナーセ（東洋醸造、バチル
ス・エスピ ーＮｏ、３由来） 〈操作〉 上記試薬１ｍＡをキュベツトにとり、０．２．４．６．
８．１０μＭのミオイノシトールシン容液をそれぞれ５
０μｌ添加し、３７℃にて６０分間反応させたのち、０
．５％ドデシル硫酸ナトリウム液１ｍｆを加え反応を停
止させた。４００　ｎｍにける吸光度を測定し、第６図
に示すようなような良好な定量曲線を得た。

人［ 〈反応系〉 ５０ｍＭ　　　グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，
０） ０．２ｍＭ　　還元型ＮＡＤ　（オリエンタル酵母）４
　　ｍＭ　　　チオＮＡＤ　（三共）２５０ｕ／ｍ／　
　ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（東洋醸造、バチ
ルス・エスピ ーＮｏ、３由来） ０．２％　　　トリトン　Ｘ−１００ 〈操作〉 キュベントに上記反応液１ｍ／を加え、３７℃にて予備
加温する。３種類の血清サンプルをそれぞれについて２
０μｉキユベツトに加え、３７℃にて反応を開始させた
。反応開始後の５分目と６分目の４００μｍにおける吸
光度を読み取り、その差を計算した。別に、標準液とし
て５０μＭミオイノシトール溶液を、また試薬ブランク
としてサンプルの代わりに蒸留水を加えたちのそれぞれ
について同様の測定を行った。標準液の吸光度差よりそ
れぞれの血清サンプルのイノシトール濃度を算出し下記
の表を得た。

スＪｌ−土 く反応系〉 ４０ｍＭ　　　グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，
０） １５　　ｍＭ　　　ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母）５０
８Ｍ　　チオＮＡＤ　（三共） ０．４Ｍ　　　エタノール ３　Ｑ　ｕ　／　ｍ　ｌ　　アルコールデヒドロゲナー
ゼ（オリエンタル酵母） ２５０ｕ／ｍｌ　ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（
東洋醸造、バチルス　エスピ ーＮｏ、３由来） 〈操作〉 上記試薬１　ｍ　Ｉ！をキュベントにとり、０．２０．
４０．６０．８０．１００μＭのミオイノシトール溶液
をそれぞれ５０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させ
た。はんおう開始後３分目と８分目の３４０μｍにおけ
る吸光度を読み取りその差を求めた。

その結果を第７図に示した。

スｔ５ 〈反応系〉 ５０ｍＭ　　　　リン緩衝液（ｐＨ７，０）０．２５ｍ
Ｍ　　還元型ＮＡＤＰ　（オリエンタル酵母） ５０８Ｍ　　　チオＮＡＤ　（三共） ５　　ｍＭ　　　　ジヒドロキシアセトンリン酸１０ｕ
／ｍｌ　　グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ベーリンガー社 製；ウサギ筋肉由来） ２５０ｕ／ｍｌ　　　ミオイノシトールデヒドロゲナー
ゼ（東洋醸造、バチルス　エ スピーＮｏ、３由来） 〈操作〉 上記試薬１ｍｊ＋をキュベントにとり、０．５ｏ、１０
０．１５０．２００．２５０μＭのミオイノシトール溶
液をそれぞれ５０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始さ
せた。はんおう開始後３分目と８分目の３４０μｍにお
ける吸光度を読み取りその差を求めた。その結果を第８
図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のミオイノシトールデヒドロケナーゼの
熱安定性を示す曲線、第２図はその至適温度を示す曲線
、第３図はそのｐＨ安定性を示す曲線、第４図はその至
適ｐＨを示す曲線、第５図ないし第８図は本発明に基づ
くミオイノシトールの定量曲線である。 第１ 図 （０Ｃ） （０Ｃ） 第３ 図 Ｈ 第４ 図 Ｈ 第５ 図 ミオイノシトール１し虻 （）ＩＭ） 第６ 図 ミオイノシトール４」＆　　（）ｒＭ 第７ 図 ミオ４ノシトールｊＪＬ崖 ）ＪＭ） 第８ 図 ミオイノシトールＪＬｉＬ　（ｐＭ） 手続補正書 平成３年１２月　５日 ２゜ ３゜ ４゜ 平成　２年　特許願　第２４９７７６号発明の名称 ミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物 補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１名称　東
洋醸造株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）被検液に、 ［１］チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
   フェート類（以下、チオＮＡＤＰ類という）およびチオ
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、チオ
   ＮＡＤ類という）のいずれか１つと、ニコチンアミドア
   デニンジヌクレオチドホスフェート類（以下、ＮＡＤＰ
   類という）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
   ド類（以下、ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれる
   １つとを補酵素とし、少なくともミオイノシトールを基
   質としてミオイノソースを生成する可逆反応をなすミオ
   イノシトールデヒドロゲナーゼ、［２］Ａ＿１、 ［３］Ｂ＿１、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式▲数式、化
   学式、表等があります▼ （式中、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
   ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型
   生成物を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮＡＤＰ類または
   チオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型Ｎ
   ＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
   還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
   、Ｂ＿２はＢ＿１の酸化型生成物を示す）で表されるサ
   イクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化する
   Ａ＿２またはＢ＿１の量を決定することを特徴とするミ
   オイノシトールの高感度定量法。（２）被験液に、 ［１］チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類のいずれか１
   つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれ
   る１つとを補酵素とし、少なくともミオイノシトールを
   基質としてミオイノソースを生成する可逆反応をなすミ
   オイノシトールデヒドロゲナーゼ、［２］Ａ＿１、 ［３］Ｂ＿１または／およびＢ＿２、 ［４］ミオイノシトールに作用せず、Ｂ＿２からＢ＿１
   への反応を形成する第二のデヒドロゲナーゼおよび該第
   二のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を作用せ
   しめて、次の反応式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
   ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型
   生成物を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮＡＤＰ類または
   チオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型Ｎ
   ＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
   還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
   、Ｂ＿２はＢ＿１の酸化型生成物を示し、Ｂ＿２からＢ
   ＿１への反応はＢ＿２を補酵素として第二のデヒドロゲ
   ナーゼにてＢ＿１を生成する酵素反応を示す）で表され
   るサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化
   するＡ＿２の量を測定することを特徴とするミオイノシ
   トールの高感度定量法。 （３）被験液に、 ［１］チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類のいずれか１
   つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれ
   る１つとを補酵素とし、少なくともミオイノシトールを
   基質としてミオイノソースを生成する可逆反応をなすミ
   オイノシトールデヒドロゲナーゼ、［２］Ａ＿１または
   ／およびＡ＿２、 ［３］Ｂ＿１、 ［５］ミオイノシトールに作用せず、Ａ＿２からＡ＿１
   への反応を形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび該第
   三のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を作用せ
   しめて、次の反応式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
   ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型
   生成物を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮＡＤＰ類または
   チオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型Ｎ
   ＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
   還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
   、Ｂ＿２はＢ＿１の酸化型生成物を示し、Ａ＿２からＡ
   ＿１への反応はＡ＿２を補酵素として第三のデヒドロゲ
   ナーゼにてＡ＿１を生成する酵素反応を示す）で表され
   るサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化
   するＢ＿１の量を測定することを特徴とするミオイノシ
   トールの高感度定量法。 （４）チオＮＡＤＰ類が、チオニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）またはチ
   オニコチンアミドピポキサンチンジヌクレオチドホスフ
   ェートである請求項（１）から（３）のいずれかの請求
   項記載のミオイノシトールの高感度定量法。（５）チオ
   ＮＡＤ類が、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
   ド（チオＮＡＤ）またはチオニコチンアミドピポキサン
   チンジヌクレオチドである請求項（１）から（３）のい
   ずれかの請求項記載のミオイノシトールの高感度定量法
   。 （６）ＮＡＤＰ類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンア
   デニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ
   ）およびニコチンアミドピポキサンチンジヌクレオチド
   ホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）からなる群より選ば
   れた補酵素である請求項（１）から（３）のいずれかの
   請求項記載のミオイミノシトールの高感度定量法。 （７）ＮＡＤ類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
   チド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンヌクレオチ
   ド（アセチルＮＡＤ）およびニコチンアミドピポキサン
   チンヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる群より選
   ばれた補酵素である請求項（１）から（３）のいずれか
   の請求項記載のミオイノシトールの高感度定量法。 （８）次の成分［１］〜［３］ ［１］チオＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類のいずれか１つと
   、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれる１
   つとを補酵素とし、少なくともミオイノシトールを基質
   としてミオイノソースを生成する可逆反応をなすミオイ
   ノシトールデヒドロゲナーゼ、［２］Ａ＿１、 ［３］Ｂ＿１、 （但し、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
   ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮ
   ＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類
   または還元型ＮＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮ
   ＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオ
   ＮＡＤ類を示す）を含有することを特徴とするミオイノ
   シトール定量用組成物。 （９）次の成分［１］〜［４］ ［１］チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類のいずれか１
   つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれ
   る１つとを補酵素とし、少なくともミオイノシトールを
   基質としてミオイノソースを生成する可逆反応をなすミ
   オイノシトールデヒドロゲナーゼ、［２］Ａ＿１、 ［３］Ｂ＿１または／およびＢ＿２、 ［４］ミオイノシトールに作用せず、Ｂ＿２からＢ＿１
   への反応を形成する第二のデヒドロゲナーゼおよび該第
   二のデヒドロゲナーゼの基質、 （但し、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
   ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮ
   ＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類
   または還元型ＮＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮ
   ＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオ
   ＮＡＤ類を示し、Ｂ＿２はＢ＿１の酸化型生成物を示す
   ）を含有することを特徴とするミオイノシトール定量用
   組成物。 （１０）次の成分［１］〜［３］および［５］［１］チ
   オＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類のいずれか１つと、Ｎ
   ＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれる１つと
   を補酵素とし、少なくともミオイノシトールを基質とし
   てミオイノソースを生成する可逆反応をなすミオイノシ
   トールデヒドロゲナーゼ、［２］Ａ＿１または／および
   Ａ＿２、 ［３］Ｂ＿１、 ［５］ミオイノシトールに作用せず、Ａ＿２からＡ＿１
   への反応を形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび該第
   三のデヒドロゲナーゼの基質、 （但し、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
   ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮ
   ＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類
   または還元型ＮＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮ
   ＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオ
   ＮＡＤ類を示し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型生成物を示す
   ）を含有することを特徴とするミオイノシトール定量用
   組成物。