JPH0833482A - 新規なソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製造方法並びに該酵素を用いたソルビトールの定量のための試薬及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ＮＡＤ⁺ の存在下で、Ｄ−ソルビトールを酸
化してＤ−フルクトースとＮＡＤＨ生成し、また本反応
の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下で、Ｄ−フルクト
ースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ⁺ を生成する
熱安定性に優れた新規なソルビトールデヒドロゲナー
ゼ、シュードモナス属に属し、ソルビトールデヒドロゲ
ナーゼ生産能を有する菌株を用いる該酵素の製造方法、
並びに該酵素及びＮＡＤ⁺ を用いたＤ−ソルビトールの
定量のための試薬及び方法。 【効果】 本酵素は、Ｄ−ソルビトールの酵素的測定法
に極めて有用であり、従来になく酵素活性が安定であ
り、本酵素を用いれば、Ｄ−ソルビトール量又はＤ−フ
ルクトース量を精度よく測定することが可能である。ま
た本発明の製造方法を用いれば、容易にそして安価に本
酵素を製造することができる。更に、本発明の試薬及び
方法によれば、Ｄ−ソルビトール量を精度よく測定する
ことが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＮＡＤ⁺ の存在下で、
Ｄ−ソルビトールを酸化してＤ−フルクトースを生成
し、また本反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下
で、Ｄ−フルクトースを還元してＤ−ソルビトールを生
成する、新規なソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製
造方法並びに該酵素を用いたＤ−ソルビトールの定量の
ための試薬及び方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】Ｄ−ソルビトールは、ヒトの血清中や尿
中などに微量に存在し、病気、例えば糖尿病などの診断
において、その含有量が重要な指標となることが知られ
ており、現在、研究機関などでは酵素法を用いて、血清
中のＤ−ソルビトールが測定されている。

【０００３】また、粉末又は粒状のＤ−ソルビトール
は、ブドウ糖を高温高圧のもとで水素添加することによ
り、Ｄ−ソルビトール液が得られ、この液をイオン交換
樹脂などにより精製することにより得られる。Ｄ−ソル
ビトールは、においがなく、爽快な甘味を有し、舌に寒
冷感を与えることや、吸湿性に優れていることから、チ
ューインガム、キャンディー、その他製菓類などの甘味
料として、また、合成酒のコク付けやタバコの甘味保湿
剤などに、広く用いられている。

【０００４】そしてまた、Ｄ−フルクトースは、イヌリ
ンを多量に含有する植物、例えばきくいもなどを加水分
解する方法、ショ糖にインベルターゼを作用させて転化
する方法などによって得られる。このＤ−フルクトース
は、上品で強い甘味を有し、かつ、湿潤性を与えること
などから、食品業界では甘味料などとして広範囲にわた
り用いられている。

【０００５】このようなことから、血清中や尿中などに
微量に存在するＤ−ソルビトール、そして食品中に含有
するＤ−ソルビトール又はＤ−フルクトースを測定する
のに利用可能な酵素を得ることは産業上極めて重要な意
義を有する。従来知られているソルビトールデヒドロゲ
ナーゼとしては、動物肝由来、例えばＳＩＧＭＡ社など
から販売されている羊肝由来のもの、また微生物由来酵
素としては、例えばエンザイム・マイクロバクテリア・
テクノロジー（ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎ
ｏｌ．）第１３巻、４月号、第３３２〜３３７頁、１９
９１年、に記載のシュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）由来のものやジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第
２６７巻、３５号、第２４９８９〜２４９９４頁、１９
９２年、に記載のバチルス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のものが知られている。

【０００６】しかしながら、前記の動物肝由来のソルビ
トールデヒドロゲナーゼは、製造方法が煩雑で、しかも
価格の面で問題があること、また前記のＰｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｓｐ．由来の該酵素は、２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液ｐＨ７．０の条件下で、４０℃では、５分間で
その活性が半減するため、酵素法による測定で多く採用
される３７℃で３０分間反応させる方法においては、酵
素活性の安定性に欠けることなどの欠点があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前述した従
来のソルビトールデヒドロゲナーゼが有する欠点を克服
し、例えば、食品中に含有されるＤ−ソルビトール又は
Ｄ−フルクトースあるいはヒトの血清中や尿中などに存
在するＤ−ソルビトールの測定に利用でき、そして通常
の酵素法による測定で多く採用される温度条件において
も、酵素活性が安定である、微生物由来の新規な酵素及
びこの酵素を安価に、そして容易に製造する方法、並び
にこの酵素を用いたソルビトールの定量のための試薬及
び方法を提供することを目的としてなされたものであ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ね、広く自然界より微生
物の検索を行った結果、土壌中より分離したシュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する菌株が、Ｄ
−ソルビトールに作用しＤ−フルクトースを生成し、ま
た本反応の逆反応によって、Ｄ−フルクトースに作用し
てＤ−ソルビトールを生成する新規な酵素を生産するこ
と、そして、この酵素が通常の酵素法による測定で多く
採用される温度条件においても、酵素活性が安定である
こと、そしてこの酵素を用いればＤ−ソルビトールを酵
素法により精度よく定量しうることを見出し、この知見
に基づいて本発明を完成するに至った。

【０００９】即ち、本発明の第１は、下記の理化学的性
質： （１）作用：ＮＡＤ⁺ の存在下で、Ｄ−ソルビトールを
酸化してＤ−フルクトースとＮＡＤＨを生成し、また本
反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下で、Ｄ−フル
クトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ⁺ を生成
する。 （２）基質特異性：Ｄ−ソルビトール及びガラクチトー
ルに特異的に作用する。

【００１０】（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐ
Ｈは１０近辺であり、安定ｐＨ範囲は、３０℃、４時間
処理で、ｐＨ５．５〜１０．５である。 （４）作用適温の範囲：１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．０）で作用適温の範囲は、５０℃近辺であ
る。

【００１１】（５）ｐＨ、温度などによる失活の条件：
３０℃、４時間処理で、ｐＨ５．５〜１０．５で安定あ
り、ｐＨ５．０以下及びｐＨ１１．０以上で完全に失活
する。ｐＨ７．０において、３０分間処理で、４０℃近
辺まで安定であり、またｐＨ７．０で４０℃の条件にお
いて２４時間で完全に失活する。 （６）阻害：ＨｇＣｌ₂ によって強く阻害される。

【００１２】（７）分子量：約６４，５００±５，００
０（ゲルろ過法）。を有するソルビトールデヒドロゲナ
ーゼであり、また本発明の第２は、シュードモナス属に
属し、前記ソルビトールデヒドロゲナーゼ生産能を有す
る菌株を培地に培養し、その培養物からソルビトールデ
ヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする前記ソルビ
トールデヒドロゲナーゼの製造方法であり、また本発明
の第３は、前記ソルビトールデヒドロゲナーゼ及びＮＡ
Ｄ⁺ を含むＤ−ソルビトール定量用試薬であり、更に本
発明の第４は、Ｄ−ソルビトール含有試料に、前記ソル
ビトールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ⁺ を作用させ、生
成するＮＡＤＨを定量することを特徴とするＤ−ソルビ
トールの定量方法である。

【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。まず、本
発明の新規な酵素、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（以
下「本酵素」ということもある）の理化学的性質の詳細
は下記のとおりである。 （１）作用：本酵素は、ＮＡＤ⁺ の存在下で、１ｍｏｌ
のＤ−ソルビトールを酸化して１ｍｏｌのＤ−フルクト
ースとＮＡＤＨを生成し、また本反応の逆反応によっ
て、ＮＡＤＨの存在下で、１ｍｏｌのＤ−フルクトース
を還元して１ｍｏｌのＤ−ソルビトールとＮＡＤ⁺ を生
成する。

【００１４】この結果より、本酵素は、次の反応式：

【００１５】

【化１】

【００１６】で示される反応を触媒することが認められ
た。 （２）基質特異性：Ｄ−ソルビトール及びガラクチトー
ルに特異的に作用し、Ｌ−イディトールにも作用する。
本酵素の各種基質に対する相対活性を調べた結果の一例
を表１に示す。

【００１７】

【表１】

【００１８】（３） 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適
ｐＨは、緩衝液として、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６．０〜７．５）、１００ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５〜９．０）、１００ｍＭグリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．５）、１０
０ｍＭ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ１０．５〜１１．５）、１００ｍＭシクロヘキシルア
ミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ１０．５〜１１．０）を用い、３７℃で
各ｐＨにおける本酵素の活性測定を行って求めた。酵素
活性の測定は、１００ｍＭの各緩衝液２．４ｍｌ、１．
１Ｍ Ｄ−ソルビトール水溶液０．５ｍｌ及び３０ｍＭ
ＮＡＤ⁺ 水溶液０．０５ｍｌを混合し、３７℃でプレ
インキュベーションした後、０．０５ｍｌの酵素液を加
え、３７℃で反応させ、７０〜８０秒間の３４０ｎｍに
おける吸光度増加量を測定することにより行った。その
結果は図１に示すとおりであり、本酵素の至適ｐＨは１
０近辺、特にｐＨ９．５〜１０．５である。

【００１９】また、安定ｐＨ範囲は、緩衝液として、１
００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５〜
６．０）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．
０〜８．０）、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５〜９．０）、１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．５）、１００ｍＭ炭酸
ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０
〜１１．５）を用い、ｐＨ４．５〜１１．５において３
０℃で４時間それぞれ処理した後、１００ｍＭトリス−
塩酸緩衝液で１０倍に希釈し、本酵素の残存活性を測定
して求めた。その結果は図２に示すとおりであり、本酵
素の安定ｐＨ範囲はｐＨ５．５〜１０．５である。

【００２０】（４）作用適温の範囲：後述する力価の測
定法における基質・酵素混合液を用い、種々の温度にて
本酵素の活性測定を行った。即ち、１００ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）２．４ｍｌ、１．１Ｍ Ｄ−
ソルビトール水溶液０．５ｍｌ及び３０ｍＭ ＮＡＤ ⁺
水溶液０．０５ｍｌを混合し、所定温度でプレインキュ
ベーションした後、０．０５ｍｌの酵素液を加え、所定
温度で反応させ、３０〜９０秒間の３４０ｎｍにおける
吸光度増加量を測定することにより本酵素の活性測定を
行った。その結果は図３に示すとおりであり、本酵素の
作用適温の範囲は５０℃近辺である。

【００２１】（５）ｐＨ、温度などによる失活の条件：
本酵素は、３０℃、４時間処理で、ｐＨ５．５〜１０．
５で安定あり、図２からわかるように、ｐＨ５．０以下
及びｐＨ１１．０以上で完全に失活する。

【００２２】また、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）及び２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用
いて、各温度（３０℃、３７℃、４０℃）で本酵素を３
０分間〜２４時間処理した場合の熱安定性を調べた。そ
の結果は図４及び図５に示すとおりであり、本酵素は、
前記各温度で３０分間処理では、いずれも４０℃近辺ま
で安定であり、また４０℃における本酵素の活性半減時
間は、ｐＨ９．０で約３．５時間であり、ｐＨ７．０で
約２時間であり、更にまた本酵素は、ｐＨ７．０〜ｐＨ
９．０で４０℃の条件において２４時間で完全に失活す
る。

【００２３】（６）阻害：後述する力価の測定法におけ
る基質・酵素混合液に、種々の添加剤（金属塩）を各１
ｍＭの濃度になるように添加して酵素活性を測定した。
その結果は表２に示すとおりであり、本酵素はＨｇＣｌ
₂ によって強く阻害される。

【００２４】

【表２】

【００２５】（７）分子量：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００
ＳＷＸＬ（東ソー社製）によるゲルろ過法で、分子量は
約６４，５００±５，０００である。なお、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によるサブユニットの
分子量は、約２７，４００であるため、本酵素は、２量
体と考えられる。また、アクリルアミド１０〜２０％
（Ｗ／Ｖ）の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲル
を用い、常法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った結果、図６に示すごとく単一のバンドが
認められ単一酵素であることを確認した。 （８）力価の測定法：本酵素の力価の測定は、下記の方
法で行い、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成する酵
素量を１Ｕとした。

【００２６】（試薬調製） １液；基質液 Ｄ−ソルビトール２０ｇを蒸留水に溶解し１００ｍｌと
する。 ２液；基質液 ＮＡＤ⁺ ８６ｍｇを蒸留水に溶解し、４ｍｌとする。 ３液；緩衝液 トリス−塩酸６．０５ｇを蒸留水に溶解した後、４規定
塩酸でｐＨを９．０に調整した後、５００ｍｌにする。

【００２７】（測定手順） １）１液０．５ｍｌ、２液０．０５ｍｌ、３液２．４ｍ
ｌを混合し３７℃にて５分間プレインキュベーションす
る。 ２）前記５分間プレインキュベーションした液と０．１
〜０．８Ｕ／ｍｌに調整した酵素液０．０５ｍｌを混合
し、３７℃において３４０ｎｍにおける１分間あたりの
サンプル吸光度増加量を測定する。 ３）ブランク値の測定は１液の代わりに蒸留水０．５ｍ
ｌを加え、２液０．０５ｍｌ、３液２．４ｍｌを混合し
３７℃にて５分間プレインキュベーションし、０．１〜
０．８Ｕ／ｍｌに調整した酵素液０．０５ｍｌを混合
し、３７℃において３４０ｎｍにおける１分間あたりの
ブランク吸光度増加量を測定する。

【００２８】（力価の計算）

【００２９】

【数１】

【００３０】（９）精製方法：本酵素の単離、精製は、
常法に従って行うことができ、例えば、硫安塩析法、有
機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲルろ過
クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、アフィニテ
ィークロマトグラフ法、電気泳動法などを単独又は適宜
組み合わせて用いられる。

【００３１】次に、本酵素のその他の理化学的性質の一
例を示す。 （１０）Ｋｍ値及びＶｍａｘ／Ｋｍの相対比（Ｄ−ソル
ビトールの値を１００とした値）：ラインウエーバー・
バークのプロットから、Ｋｍ値は１．４１×１０^-2Ｍ
（Ｄ−ソルビトールを基質としてｐＨ９．０、３７℃に
おいて）であった。

【００３２】本酵素のｐＨ９．０、３７℃における各基
質に対するＫｍ値（ｍＭ）、Ｖｍａｘ（μｍｏｌ・ｍｉ
ｎ^-1・ｍｇ^-1）、Ｖｍａｘ／Ｋｍ、及びＤ−ソルビトー
ルのＶｍａｘ／Ｋｍを１００としたときの相対比は、表
３に示すとおりである。

【００３３】

【表３】

【００３４】表３から、Ｄ−ソルビトールを基質とした
ときのＫｍ値が最も小さく、またＤ−ソルビトールのＶ
ｍａｘ／Ｋｍ（ｍｉｎ^-1・ｍｇ^-1）を１００としたとき
の相対比は、Ｄ−ソルビトールが最も大きいことから見
ても、本酵素はＤ−ソルビトールに対して最も親密に作
用することがわかる。本発明の酵素の主要な理化学的性
質は前記のとおりであるが、この酵素が新規である根拠
を次に示す。

【００３５】従来、前記、羊肝由来のソルビトールデヒ
ドロゲナーゼ、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）又はバチルス サブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が生産するソルビ
トールデヒドロゲナーゼが、ＮＡＤ⁺ 存在下でＤ−ソル
ビトールを酸化し、Ｄ−フルクトースを生成することが
知られている。

【００３６】

【表４】

【００３７】（注１）：羊肝由来酵素（ＳＩＧＭＡ社製
「ソルビトールデヒドロゲナーゼＳ−３７６４」）を用
いて、本発明酵素と同様な前記の方法で、分子量、至適
ｐＨ、安定ｐＨ範囲を測定した。 （注２）：公知シュードモナス エスピー由来の酵素の
データは、Ｅｎｚ-ｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈ
ｎｏｌ．（第１３巻、４月号第３３２〜３３７頁、１９
９１年）から引用した。

【００３８】（注３）：公知バチルス由来の酵素のデー
タは、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２６７巻、３５号、第２４９８９
〜２４９９４頁、１９９２年）から引用した。 （注４）：熱安定性は、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）及び２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
０）を用いて、３７℃、４０℃において酵素活性が１０
０％残存する時間を示す。

【００３９】また、活性半減条件は、同緩衝液で４０℃
において活性が半減する時間を示す。

【００４０】しかしながら、表４から、本発明の酵素
は、特に分子量において羊肝由来の酵素が１２９，００
０±５，０００（ゲルろ過法）、またバチルス サブチ
リス由来の酵素が１５３，０００（ゲルろ過法）であ
り、いずれも４量体であるのに対して６４，５００±
５，０００（ゲルろ過法）で２量体であることから、本
発明の酵素はこれらの酵素とは全く異なるものである。

【００４１】また特に、熱安定性において前記シュード
モナス エスピー由来の酵素がｐＨ７．０で４０℃にお
ける活性半減時間が５分間であるのに対し、本酵素の活
性半減時間が、ｐＨ７．０で約２時間であることから、
この酵素は、本発明の酵素とは全く異なるものであるこ
とがわかる。即ち、本発明の酵素は、Ｄ−ソルビトール
に作用し、かつ、ｐＨ７．０〜９．０において、３０分
間処理で、４０℃近辺まで安定で約１００％の活性を保
ち、本酵素の活性半減時間が、ｐＨ７．０で約２時間で
あるという従来にない性質を有する新規なソルビトール
デヒドロゲナーゼである。

【００４２】次に、本発明の新規ソルビトールデヒドロ
ゲナーゼの製造方法について説明する。先ず、使用され
る菌としては、シュードモナス属に属し、本酵素生産能
を有するする菌株であればいかなる菌でもよく、またこ
れらの菌の変種又は変異株でもよい。そして、その微生
物の具体例としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）ｓｐ．ＫＳ−Ｅ１８０６が挙げられ、該菌株
の変種又は変異株も用いることができる。このシュード
モナス ｓｐ．ＫＳ−Ｅ１８０６は、本発明者らが京都
府内の土壌より分離して得た菌株であり、その菌学的性
質は以下に示すとおりである。

【００４３】なお、菌学的性質の同定のための実験は、
主として、長谷川武治編著「微生物の分類と同定」東京
大学出版会（１９７５年）によって行った。また分類同
定の基準として、「バージーズ・マニュアル・オブ・デ
ターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’
ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」第８版（１９７４年）
を参考にした。

【００４４】 シュードモナス ｓｐ．ＫＳ−Ｅ１８０６の菌学的性質 （Ａ）形態的性質 顕微鏡的観察［肉汁寒天培地( ｐＨ９．０) 、３０℃、
２４〜４８時間培養］ （１）細胞の形及び大きさ：０．５〜１．０×２．０〜
４．０μｍの短桿菌である。 （２）細胞の多形性の有無：なし （３）運動性の有無：あり。極多毛を有する。 （４）胞子の有無：なし （５）グラム染色性：陰性 （６）抗酸性：陰性

【００４５】 （Ｂ）各培地（ｐＨ ８．０）における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養：３０℃、４８時間の静置培養
で、直径４〜５ｍｍのやや乳白色に近い茶色の円形コロ
ニ−を形成する。表面は平滑で光沢があり、周縁はなめ
らかである。色素の産生は認められない。 （２）肉汁寒天斜面培養：３０℃、４８時間の培養で、
糸状の生育を示す。 （３）肉汁液体培養：３０℃、４８時間の静置培養で、
培地全体に生育（濁り）が認められ、菌膜を生じ、沈渣
も認められる。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：２０℃、１０日間の静置
培養で、培地中部まで生育し、ゆっくりとゼラチンを液
化する。 （５）リトマスミルク培養：３０℃、１４日間の静置培
養で、リトマスミルクの凝固は認められないが、液化は
認められる。酸及びアルカリの産生も認められない。

【００４６】（Ｃ）生理学的性質 主にｐＨ６．５ に調整した培地を用いて試験した。 （１）硝酸塩の還元：還元しない。 （２）脱窒反応：なし。 （３）ＭＲテスト：陰性 （４）ＶＰテスト：陰性 （５）インド−ルの生成：生成しない。 （６）硫化水素の生成：生成しない。 （７）デンプンの加水分解：加水分解しない。 （８）クエン酸の利用：利用する。

【００４７】（９）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用し
ないが、アンモニウム塩は利用する。 （１０）色素の生成：生成しない。 （１１）ウレア−ゼ：陽性 （１２）オキシダ−ゼ：陽性 （１３）カタラ−ゼ：陽性 （１４）生育の範囲：温度；２５〜４０℃、ｐＨ；５．
０〜８．０ （１５）酸素に対する態度：好気性 （１６）Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ
法）：酸化 （１７）糖類からの酸及びガスの生成：表５に示すとお
り、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノー
ス、Ｄ−ガラクトース、ショ糖より酸の生成が認められ
るが、ガスの生成はいずれからも認められない。

【００４８】

【表５】

【００４９】前記した菌学的性質を有し、新規ソルビト
ールデヒドロゲナーゼ生産能を有する本菌株は、グラム
染色性が陰性であること、運動性を有し、極多毛を有す
ること、Ｏ−Ｆテストが酸化であることなどから、シュ
ードモナス属に属するものと判定される。従って、本菌
株をシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．
ＫＳ−Ｅ１８０６と命名した。なお、本菌株は工業技術
院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４２９
９として寄託されている。

【００５０】なお、本発明におけるソルビトールデヒド
ロゲナーゼとしては、前記した作用、基質特異性などの
主要な理化学的性質を有するものであればよく、その他
の理化学的性質が多少の相違を示すものであっても、本
発明の酵素として包含される。そして、前記の微生物
は、このようなソルビトールデヒドロゲナーゼを得るた
めの使用菌の一例であって、本発明においてはシュード
モナス属に属し、前記ソルビトールデヒドロゲナーゼ生
産能を有するものであればすべて使用できる。

【００５１】次に、前記ソルビトールデヒドロゲナーゼ
生産能を有する微生物を用いて、本発明のソルビトール
デヒドロゲナーゼを製造するには液体培養法が用いられ
る。そしてその培地としては、炭素源、窒素源、無機
物、その他の栄養素を適度に含有するものであれば、合
成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。

【００５２】炭素源としては、同化可能な炭素化合物で
あればよく、例えばＤ−ソルビトール、グルコース、フ
ルクトース、マルトース、デンプン加水分解物、糖蜜な
どが使用される。また窒素源としては、利用可能な窒素
化合物であればよく、例えば酵母エキス、ポリペプト
ン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、アミノ
酸、硫安、硝酸アンモニウムなどが使用される。その他
無機物としては、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化マンガン、硫酸第一鉄、リン酸二水素カリウ
ム、リン酸水素二カリウムなど種々の塩類、その他ビタ
ミン類、消泡剤などが用いられる。これらの栄養源は、
それぞれ単独又は組合せによっても用いることができ
る。

【００５３】前記のごとくして調製した液体培地を用い
て本酵素を生産するには、通気攪拌培養又は振盪培養等
により好気的に培養することが好ましい。その際に、培
地の初発ｐＨを６．５〜７．５程度に調整し、２５〜３
７℃、好ましくは３０℃前後の温度で、１０〜３６時間
培養する。このようにすることにより、培養物中に本酵
素が生成される。培養終了後、培養物からソルビトール
デヒドロゲナーゼを採取するには、通常の酵素採取手段
を用いることができる。

【００５４】本酵素は、主に菌体内に存在する酵素であ
るため、培養物から、例えばろ過、遠心分離などの操作
により菌体を分離し、この菌体から本酵素を採取するこ
とが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることも
できるが、例えば超音波破砕機、フレンチプレス、ダイ
ナミルなどの種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方
法、リゾチームなどのような細胞壁溶解酵素を用いて菌
体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００などの界
面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などを単
独又は組み合わせて採用するができる。次いで、これを
ろ過又は遠心分離などによって不純物を除き、本酵素の
粗酵素液を得る。

【００５５】このようにして得られた粗酵素液から本酵
素を必要により単離、精製するには、前記精製方法が適
用できる。以上のごとくして得られた本酵素は、Ｄ−ソ
ルビトールの定量に極めて有用であり、本酵素を用いる
ことにより酵素的にＤ−ソルビトールの定量が可能とな
る。例えば、ヒトの血清中又は尿中に存在するＤ−ソル
ビトール量の測定に用いて糖尿病など各種疾患の診断へ
の利用、また食品中などに含まれているソルビトールの
定量、更に本酵素の逆反応によるＤ−フルクトースの定
量などにも使用が可能である。

【００５６】本発明のＤ−ソルビトール定量用試薬は、
本酵素及びＮＡＤ⁺ を含むものである。Ｄ−ソルビトー
ルを定量するための有利な系としては、例えば反応試薬
としては、0.5 〜20Ｕ／mlの本酵素及び10〜500 mMの緩
衝剤を含有するpH 6.5〜10.0の系、0.5 〜３mMのＮＡＤ
⁺ の系などが挙げられる。

【００５７】これらの系に用いられる緩衝剤としては、
例えばリン酸カリウム、トリス塩酸塩などが挙げられ
る。このような系に、前記成分以外に、本発明の目的を
損なわない範囲で必要に応じて慣用の種々の添加成分、
例えば溶解補助剤、安定化剤などとして、界面活性剤
（トリトンＸ−100 など）、還元剤（２−メルカプトエ
タノール、ジチオスレイトールなど）、牛血清アルブミ
ン、糖類（グリセリン、ショ糖など）などを添加するこ
ともできる。これらの成分は、前記の系を調製する適当
な段階で添加し、１種又は２種以上を組み合わせて用い
ることもできる。

【００５８】本発明の試薬は、乾燥物又は溶解した状態
のものを用いてもよいし、薄膜状の担体、例えばシート
含浸性の紙などに含浸させて用いてもよい。また使用酵
素は、常法により固定化させて反復使用してもよい。こ
のような本発明の試薬を用いることにより、各種の試料
中に含有されるＤ−ソルビトールを簡単な操作で精度よ
く定量することができる。

【００５９】次に、本発明のＤ−ソルビトールの定量方
法は、前記のごとく、Ｄ−ソルビトール含有試料に本酵
素及びＮＡＤ⁺ を添加、作用させて生成するＮＡＤＨを
定量することにより行うものであるが、Ｄ−ソルビトー
ル含有試料としては、Ｄ−ソルビトールを含有するもの
であれば如何なるものでもよく、例えばＤ−ソルビトー
ルを測定すべき、ヒトの血清、尿などの診断用試料、及
び液体又は粉末食品、ジュース、チューインガム、キャ
ンディーその他の製菓類、合成酒、タバコなどの嗜好品
類などが挙げられる。

【００６０】そして、該試料は、そのまま又は水、緩衝
液などで抽出し、Ｄ−ソルビトールが適当な濃度になる
ように濃縮又は希釈して定量に供してもよい。定量に際
しては、これらの試料のpHは無調整でもよいが、適当な
pH調整剤、例えば塩酸、硫酸、硝酸、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムなどによりpH８〜10に調整すること
が望ましい。

【００６１】また、Ｄ−ソルビトール含有試料に作用さ
せる本酵素の添加量は、該試料中に含まれるＤ−ソルビ
トール含有量、酵素反応条件などにより適宜選択される
が、例えば通常、本酵素を終濃度0.5 〜20Ｕ／mlになる
ように添加する。次に、Ｄ−ソルビトール含有試料に本
酵素及びＮＡＤ⁺ を作用させ、生成するＮＡＤＨを定量
する方法は、特に制限されず、如何なる方法を用いても
よい。ＮＡＤＨの定量方法としては、例えば (i) 340nm
における吸光度増加量を測定する方法、(ii)励起波長 3
66nm、蛍光波 452nmを用いて蛍光測定する方法などによ
り、それぞれ予め作成した検量線を用いて試料中のＤ−
ソルビトールを算出する方法が挙げられる。

【００６２】次に、本発明のＤ−ソルビトールの定量方
法の好適な一例を示す。先ず、Ｄ−ソルビトール含有試
料に、本酵素を0.5 〜20Ｕ／ml、好ましくは２〜６Ｕ／
ml及び緩衝剤（pH７〜９）を50〜150 mM、ＮＡＤ⁺ を0.
5 〜３mMとなるように加え、pH７〜９、温度25〜40℃で
酵素反応させる。このときの反応時間は、Ｄ−ソルビト
ールを酸化するに十分な時間であればよく、15〜60分
間、好ましくは25〜35分間である。次いで、生成するＮ
ＡＤＨを前記の方法によって定量し、予め同方法で定量
して作成したＤ−ソルビトールの検量線を用いて試料中
のＤ−ソルビトールの定量値を算出する。

【００６３】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定され
るものではない。 （実施例１）Ｄ−ソルビトール０．５％、ポリペプトン
２．０％、酵母エキス０．５％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．０１
％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．０１％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ
０．０１％、及び水道水からなる培地（ｐＨ７．２）１
００ｍｌを坂口コルベンに入れて、１２１℃で１５分間
殺菌した。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
ｓｐ．ＫＳ−Ｅ１８０６（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２９９）
の保存スラントより１白金耳接種し、これを振盪機にて
３０℃で約２４時間振盪培養し、種培養液とした。

【００６４】次に、前記と同様にして調製、殺菌した培
地２０Ｌを含む３０Ｌ容ジャーファメンターへ前記種培
養液１００ｍｌ（坂口コルベン１本分）を接種し、回転
数３００ｒｐｍ、通気量２０Ｌ／ｍｉｎ、３０℃で約２
０時間培養した。培養終了後、培養液２０Ｌから旭化成
マイクローザ（ＰＷ−３０３）を用いて菌体を集め、２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて菌体を洗浄した
後、菌体を同緩衝液約５Ｌに懸濁した。本酵素の精製
は、以下に示す操作によって行った。

【００６５】ステップ１（粗酵素液の調製）：前記菌体
懸濁液に、リゾチーム１０ｇ、トリトンＸ−１００を１
０ｍｌと０．５５Ｍ ＥＤＴＡ ２Ｎａ（ｐＨ８．０）
５００ｍｌを添加、混合し、２０℃で一晩放置した後、
５％プロタミン水溶液（ｐＨ８．０）２００ｍｌを攪拌
しながら滴下して除核酸処理を行った。この上澄液を限
外ろ過膜を用いて、５０ｍＭ塩化カリウムを含有する１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下「緩衝
液Ａ」という）に対して透析した。

【００６６】ステップ２（ＤＥＡＥ−セルロース処
理）：透析液（約１０Ｌ）に、湿重量約９ｋｇのＤＥＡ
Ｅ−セルロースを添加、混合して、本酵素を吸着させた
後、５０ｍＭ塩化カリウムを含む緩衝液ＡにてＤＥＡＥ
−セルロースを洗浄し、次に、０．５Ｍ塩化カリウムを
含有する緩衝液Ａにて本酵素を溶出して、限外濃縮し
た。 ステップ３（ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０ 処
理）：前記濃縮液（１０００ｍｌ）に１０００ｍｌのＱ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０を添加、混合して、
本酵素を吸着させた後、０．０５Ｍ塩化カリウムを含有
する緩衝液ＡにてＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０
を洗浄し、次に、０．５Ｍ塩化カリウムを含有する緩衝
液Ａにて本酵素を溶出して、限外濃縮し、更に４０ｍＭ
塩化カリウムを含有する２０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．０）（以下「緩衝液Ｂ」という）にて
透析した。

【００６７】ステップ４（ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
５５０ｃカラムクロマトグラフィー）：前記濃縮透析
液（１００ｍｌ）を、ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５
５０ｃのカラム（２．５×３３ｃｍ）に吸着させ、０．
０４Ｍ塩化カリウムを含有する緩衝液Ｂにて洗浄し、次
に、０．０５Ｍ〜０．１Ｍ塩化カリウムを含有する緩衝
液Ｂにて直線濃度勾配法により溶出させ、約０．６Ｍ塩
化カリウムにて溶出された活性画分を限外濃縮した。

【００６８】ステップ５（バイオゲル Ａ １．５ｍ
２００−４００ｍｅｓｈカラムクロマトグラフィー）：
濃縮液（約２ｍｌ）を、バイオゲル Ａ １．５ｍ ２
００−４００ｍｅｓｈカラム（２．５×９５ｃｍ）に通
過させ、０．１Ｍ食塩及び０．０２％アジ化ナトリウム
を含有する緩衝液Ａにてゲルろ過を行い、溶出された活
性画分（４６ｍｌ）を採取した。

【００６９】以上の精製操作により得た該画分は、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図６）により均
一と判断された本酵素の精製標品であり、全タンパク量
が５．３ｍｇ、全活性が４８０Ｕ、比活性が９０Ｕ／ｍ
ｇであった。

【００７０】（実施例２） （１）Ｄ−ソルビトール定量用試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することによ
り、試薬を調製した。また酵素液については、１００ｍ
Ｍ塩化カリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）にて、所定の単位に濃度を調整した。

【００７１】 成 分 濃 度 トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０） ２５０ｍＭ ＮＡＤ⁺ （オリエンタル酵母工業（株）製） ３０ｍＭ 本酵素 ４０Ｕ／ml

【００７２】（２）Ｄ−ソルビトールの定量方法 Ｄ−ソルビトール標品（和光純薬工業（株）製、１級）
を用いて２５，５０，７５，１００μＭに調整した試料
各１．０ｍｌにそれぞれトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．
０）０．８ｍｌ、ＮＡＤ⁺ ０．１ｍｌを添加し、３７℃
で５分間プレインキュベーションを行った。そして本酵
素０．１ｍｌを添加し、日立社製分光光度計（Ｕ−２０
００型）内で３７℃で３０分間反応を行い、３０分後の
３４０ｎｍの吸光度を求め、試料の代わりに蒸留水を用
いたブランク値を差し引いた、該吸光度増加量（ΔＯ
Ｄ）を求めた。この値とＤ−ソルビトール含有量との間
には直線的な相関があった。その検量線を図７に示す。
該検量線の式は、 ｙ＝0.0298Ｘ＋0.002 （ｒ＝1.000 ） となる。これから検量線として有効であることがわか
り、しかも試料中のＤ−ソルビトールを正確に定量でき
た。

【００７３】

【発明の効果】本酵素は、Ｄ−ソルビトールに作用し、
しかも通常の酵素法による測定で多く用いられる条件
（ｐＨ９．０、３７℃、３０分間の反応）においても酵
素活性が安定である新規な酵素であり、本酵素を用いれ
ば、例えば食品中あるいはヒトの血清中又は尿中に存在
するＤ−ソルビトール量を精度よく測定することが可能
である。また、本酵素の逆反応によって、例えば食品中
Ｄ−フルクトースを測定することも可能である。

【００７４】また本酵素は、従来市販されている羊肝由
来酵素などの動物起源の酵素とは異なり、微生物由来酵
素であるため、容易にそして安価に製造することができ
るので、産業上きわめて有用である。更に、本酵素を用
いた本発明の定量用試薬及び定量方法によれば、例えば
食品中あるいはヒトの血清中又は尿中に存在するＤ−ソ
ルビトール量を精度よく測定することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素の３７℃における至適ｐＨを示すグラフ
である。

【符号の説明】

○ １００ｍＭリン酸カリウム緩衝液 ▲ １００ｍＭトリス−塩酸緩衝液 □ １００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 △ １００ｍＭ ＣＡＰＳ−水酸化ナトリウム緩衝液 ● １００ｍＭ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩
衝液

【図２】本酵素の３０℃における安定ｐＨ範囲を示すグ
ラフである。

【符号の説明】

× １００ｍＭ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩
衝液 ○ １００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 ● １００ｍＭトリス−塩酸緩衝液 △ １００ｍＭリン酸カリウム緩衝液 ▲ １００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液

【図３】本酵素のｐＨ９．０における作用適温の範囲を
示すグラフである。

【図４】本酵素のｐＨ９．０における熱安定性を示すグ
ラフである。

【符号の説明】

○ ３０℃ ● ３７℃ △ ４０℃

【図５】本酵素のｐＨ７．０における熱安定性を示すグ
ラフである。

【符号の説明】

○ ３０℃ ● ３７℃ △ ４０℃

【図６】本酵素の電気泳動図である。

【図７】Ｄ−ソルビトールの検量線を示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するソルビトー
   ルデヒドロゲナーゼ。 （１）作用：ＮＡＤ⁺ の存在下で、Ｄ−ソルビトールを
   酸化してＤ−フルクトースとＮＡＤＨを生成し、また本
   反応の逆反応によって、ＮＡＤＨの存在下で、Ｄ−フル
   クトースを還元してＤ−ソルビトールとＮＡＤ⁺ を生成
   する。 （２）基質特異性：Ｄ−ソルビトール及びガラクチトー
   ルに特異的に作用する。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは１０近辺
   であり、安定ｐＨ範囲は、３０℃、４時間処理で、ｐＨ
   ５．５〜１０．５である。 （４）作用適温の範囲：１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液
   （ｐＨ９．０）で作用適温の範囲は、５０℃近辺であ
   る。 （５）ｐＨ、温度などによる失活の条件：３０℃、４時
   間処理で、ｐＨ５．５〜１０．５で安定あり、ｐＨ５．
   ０以下及びｐＨ１１．０以上で完全に失活する。ｐＨ
   ７．０において、３０分間処理で、４０℃近辺まで安定
   であり、またｐＨ７．０で４０℃の条件において２４時
   間で完全に失活する。 （６）阻害：ＨｇＣｌ₂ によって強く阻害される。 （７）分子量：約６４，５００±５，０００（ゲルろ過
   法）。
2. 【請求項２】 シュードモナス属に属し、請求項１記載
   のソルビトールデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を
   培地に培養し、その培養物からソルビトールデヒドロゲ
   ナーゼを採取することを特徴とする請求項１記載のソル
   ビトールデヒドロゲナーゼの製造方法。
3. 【請求項３】 請求項１記載のソルビトールデヒドロゲ
   ナーゼ及びＮＡＤ⁺を含むＤ−ソルビトール定量用試
   薬。
4. 【請求項４】 Ｄ−ソルビトール含有試料に、請求項１
   記載のソルビトールデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤ⁺ を作
   用させ、生成するＮＡＤＨを定量することを特徴とする
   Ｄ−ソルビトールの定量方法。