JPH04341186A - 新規なグルコースイソメラーゼおよびその製造法ならびに異性化糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、新規なグルコースイソ
メラーゼに関し、さらに詳細には、耐酸性が大きい新規
なグルコースイソメラーゼ、この新規なグルコースイソ
メラーゼの製造法およびこの新規なグルコースイソメラ
ーゼの用途に係わる。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従来
、澱粉からの異性化糖の製造法において、澱粉の液化、
液化澱粉の糖化およびグルコースの異性化はそれぞれｐ
Ｈ６付近、ｐＨ４．５付近およびｐＨ７〜８付近で行わ
れているが、グルコースの異性化に先立って酸性の糖化
液をグルコースの異性化に適するｐＨに調整しなければ
ならない煩雑さがあり、またグルコースの異性化がアル
カリ側で行われた場合には、糖の分解および着色という
問題点があった。 【０００３】また、食品およびアルコール飲料の多くは
弱酸性であり、例えば、日本酒ではｐＨは４．３付近で
ある。さらに日本酒には約３重量％のグルコースが含有
されており、このグルコースを異性化することにより、
今までになかった新しい風味の日本酒を創生することが
できる。 【０００４】従って、酸性においてさえも高い活性を有
するグルコースイソメラーゼの出現が期待されているが
、このようなグルコースイソメラーゼは未だ見出されて
いない。グルコースイソメラーゼは少くともＤ−グルコ
ースをＤ−フルクトースに異性化する反応を触媒する酵
素であり、１９７２年に国際生化学連合では新しく酵素
番号ＥＣ５．３．１．１８が付されたが、１９７８年の
改訂でキシロースイソメラーゼ（酵素番号ＥＣ５．３．
１．５）との差が認められず同一の酵素として取扱われ
削除されている（株式会社シーエムシー社発行「バイオ
テクノロジー事典」第３３０頁１９８６年）が、グルコ
ースイソメラーゼ（酵素番号ＥＣ５．３．１．１８）の
名称は工業面では慣用的に使用されている。 【０００５】従来知られているグルコースイソメラーゼ
生産菌株はＷｅｎ−Ｐｉｎ　Ｃｈｅｎ，　Ｐｒｏｃｅｓ
ｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｊｕｎｅ／Ｊｕｌｙ　
１９８０　に掲載されているだけでも８０株ある。とこ
ろで、グルコースイソメラーゼの研究の多くは耐熱性の
面からのアプローチがなされている。例えば、Ａｍｐｕ
ｌｌａｒｉｅｌｌａ　属（米国特許第４３０８３４９　
号）　、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ（米国特許第４３４８４８０　号、同第４３５５１０
３　号）　、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｒｂｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ　（Ｃ．　Ｂｏｇｕｓｌａｗｓｋｉ，　
Ｊ．　Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　５　，１８６−
１９６　，１９８３）　、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ　属、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ　属（特
開昭４９−３０５８８号）　、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　（米国特許第３８
２６７１４　号）　、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌ
ａｎｓ（米国特許第３９７９２６１　号）およびＢａｃ
ｉｌｌｕｓ属（特許公開公報平２−２４２６８０）　は
全て耐熱性グルコースイソメラーゼについての報告であ
り、約ｐＨ５以下の酸性条件下ではほとんど活性を示さ
ないものであった。 【０００６】耐酸性グルコースイソメラーゼ、あるいは
酸性側での相対活性の高いグルコースイソメラーゼにつ
いてはＫ．　Ｙａｍａｎａｋａ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　
Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１５１，６７０−６８
０　（１９６８）に記載されているＬａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓのものと、栗田ら、日本農芸化
学会誌・１９９１年大会講演要旨集〔１２２〕に記載さ
れているＮ−２７株からのものの２つが知られているに
過ぎない。Ｌ．　ｂｒｅｖｉｓ　の酵素のｐＨ４．５に
おける活性は至適ｐＨ６．５付近の活性に対する相対比
として約４２％、ｐＨ４．０においては約２０％の相対
活性を示すと記載されている。Ｎ−２７株由来の酵素は
ｐＨ５．０において安定して作用し、また、ｐＨ５．０
付近、６０℃においても安定して作用したとこの要旨集
には記載されてはいるが、ｐＨ４．５以下の条件で作用
するとは記載されてはいない。また、口頭での発表によ
れば、このＮ−２７株由来の酵素は、ｐＨ５．０におけ
る活性が至適ｐＨ７．０付近における活性の５０％程度
の相対活性を示すにすぎず、また、ｐＨ４．０において
は４０％以下程度の相対活性を示すにすぎないものであ
る。 【０００７】さらにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｆｌ
ａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ（Ｗ．Ｐ．　Ｃｈｅｎ　＆　Ａ．
Ｗ．　Ａｎｄｅｒｓｏｎ，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，　３８　，（６）　１１１１−１１
１９　，１９７９）　，Ｓｔ．　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃ
ｕｓ　Ｓ−４１　（Ｔ．　Ｋａｓｕｍｉ，　Ｋ．　Ｈａ
ｙａｓｈｉ，　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ，　Ｃｈｅｍ．
，　４６（１）　，２１−３０　，１９８２）およびＳ
ｔ．　ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ　（Ｍ．　Ｃａｌｌ
ｅｎｓ，　Ｈ．Ｋ．　Ｈｉｌｄｅｒｓｏｎ，　ＥＮＺＹ
ＭＥ　Ｍｉｃｒｏｂ．　Ｔｅｃｈｎｏｌ．　８，６９６
−７００　，１９８６）　のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
属由来の酵素はｐＨ５以下では、殆ど活性を示していな
い。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　　ＴＸ−３（Ｍ
．　Ｋｉｔａｄａ，　Ｙ．　Ｄｏｂａｓｈｉ，　Ａｇｒ
ｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，５３（６），１４６
１−６８　、１９８９）　の酵素も同様にｐＨ５以下で
は殆ど活性を示さない。Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．
　Ｂｉｏｐｈｙｓ．，　４８　，１２０　，１９５４に
記載されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｈｙｄｒｏ
ｐｈｉｌａは、すでにＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ　第８版（１９７４）Ｐ３４６ではＡｅｒｏ
ｍｏｎａｓ　　　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａに訂正されてい
るが、このＡｅｒｏｍｏｎａｓ　　　ｈｙｄｒｏｐｈｉ
ｌｉａ　由来の酵素はｐＨ５．０以下ではほとんど活性
を示さない。また、以上からＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属
に属する微生物がグルコースイソメラーゼを生産するこ
とについて知られていなかった。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明者らはグルコース
の異性化を糖化と同じ酸性で行うべく、酸性条件下にお
いても十分な安定性を保持している優れた性質を有する
グルコースイソメラーゼを発見し、さらには、例えば日
本酒のようにｐＨが低い上に、アルコールや各種の有機
酸類が多量に存在している飲食類中においても十分な活
性を発現するグルコースイソメラーゼの開発を目的とし
て、広く自然界からスクリーニングを行った結果、和歌
山県新宮市佐野の野菜畑土壌より分離したシュードモナ
ス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）Ｎｏ
．　１−４が目的とする性質を有する酵素を生産してい
ることを発見し、この発見に基づいて本発明を完成させ
るに至ったものである。 【０００９】すなわち、本発明は少なくとも下記の理化
学的性質を有することを特徴とするグルコースイソメラ
ーゼおよびシュードモナス属に属する該酵素の生産菌を
培地にて培養し、得られた培養物から該酵素を採取する
ことを特徴とする該酵素の製造法である。本発明のグル
コースイソメラーゼの理化学的性質は以下のとおりであ
る。 （１）　酵素作用：少なくとも下記の反応を触媒する。 Ｄ−グルコース―→Ｄ−フルクトース （２）　基質特異性：少なくともＤ−グルコースを基質
とする。 （３）　作用ｐＨ：ｐＨ３．５〜５．０における活性が
ｐＨに関する最大活性に対する相対比として７０％以上
であり、かつ、ｐＨ５．０〜１０．０における活性が、
相対比として８０％以上である。また、本発明は前記の
酵素を用いた簡便な異性化糖の製造法である。 【００１０】本発明の新規なグルコースイソメラーゼ生
産菌はシュードモナス属に属するが、例えば、本発明者
らが分離したＮｏ．　１−４菌は本発明に最も有効に利
用される菌株の代表例であって、本菌株の菌学的特徴を
示すと次のとおりである。尚、本菌株の同定にあたって
は、同定実験は「医学細菌同定の手引き第２版」、“Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ”第３
巻に準じて行い、実験結果を“Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａ
ｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”第８版、“Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍ
ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ”　Ｖｏｌ．１（１９８４）、“同誌、
Ｖｏｌ．２（１９８６）”などと対比して同定を行った
。ＤＮＡのＧＣｍｏｌ％測定は、精製ＤＮＡをヌクレア
ーゼＰ１で消化し、ＤＥＡＥカラムを用いたＨＰＬＣ法
で測定し、キノンの分析は「新しい分類学に伴走する細
菌同定法」に準じてキノンを精製しＨＰＬＣで分析した
。培養は２８〜３０℃で行なった（生育温度テストを除
く）。なお、シュードモナス・エスピーＮｏ．　１−４
は通産省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄
第３３４８号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３３４８）として寄
託されている。 【００１１】Ｎｏ．　１−４株の菌学的性質を示す。 １）生育の特徴 普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。淡い黄土色を呈するが可溶性色
素は産生しない。半光沢。 普通寒天平面培地 緑のなめらかで平な円形の集落を形成する。やや湿潤で
半光沢を有し淡い黄土色を呈するが、可溶性色素は産生
しない。 液体培地（ペフトン水） 良好に生育する。混濁せずに、壊れやすいが厚い皮膜を
形成する。 リトマスミルク培地 アルカリ性になりペプトン化する。 【００１２】２）ＤＮＡのＧＣｍｏｌ　％約６７．７ 【００１３】３）主たるイソプレノイドキノンＱ８　 【００１４】４）形態の特徴 端の丸いまっすぐまたはやや曲がった短桿状〜桿状細菌
で、単独、二連、たまに短連鎖。大きさは０．４〜０．
６μｍ　×０．５〜１．０μｍ　、極毛で運動する。芽
胞非形成、多形性もない。 【００１５】 ５）生理・生化学的性状 グラム染色　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　−ＫＯＨ反応　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　＋抗酸性染色　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−カプセル
形成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　−ＯＦテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ）　　　　
　　　　　　　ＮＴＯＦテスト（Ｎ源にＮＨ４Ｈ２ＰＯ
４）　　　　　　　　　Ｏ（酸化）好気での生育　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋嫌気で
の生育　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−生育温度　　３７℃　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　−３０℃　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　＋２０℃　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋１０℃　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ＮＴ食塩耐性　　　　０％　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　＋１．５％　　　　　　　　　
　　　　　　　　　＋３．０％　　　　　　　　　　　
　　　　　　　−生育ｐＨ　　　　４．８　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　＋５．６　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　＋９．０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋１０．０　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−【００１
６】 ゲラチン分解　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋デンプン分解　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　−カゼイン分解　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　＋エスクリン分解
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋セル
ロース分解　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−チロシン分解　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　−Ｔｗｅｅｎ　８０分解　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　−アルギニン分
解　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋【
００１７】 カタラーゼ産生　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　＋オキシダーゼ産生　　　　　　　　　　　　
　　　　　　（＋）レシチナーゼ産生　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　＋ウレアーゼ産生（ＳＳＲ）
　　　　　　　　　　　　　　　　−ウレアーゼ産生（
Ｃｈｒｉｓ．）　　　　　　　　　　　（＋）インドー
ル産生　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
−硫化水素産生（ｌｅａｄ　ａｃｅｔａｔｅ　ｐａｐｅ
ｒ）　　　−アセトイン産生（Ｋ２ＨＰＯ４）　　　　
　　　　　　　　　−アセトイン産生（ＮａＣｌ）　　
　　　　　　　　　　　　　−【００１８】 ＭＲテスト　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　−硝酸塩還元テスト（ガス産生）　　　　
　　　　−（　ＮＯ２−　の検出）　　　　　− （　ＮＯ３−　の検出）　　　　　＋ 【００１９】 シモンズ培地での利用性 クエン酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　＋リンゴ酸塩　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　＋マレイン酸塩　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　−マロン酸塩　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋プロピオン酸
塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋グルコ
ン酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
−コハク酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋【００２０】 クリステンゼン培地での利用性 クエン酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　＋リンゴ酸塩　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　＋マレイン酸塩　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　−マロン酸塩　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋プロピオン酸
塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋グルコ
ン酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（＋
）コハク酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　＋【００２１】 グルコースよりガスの産生　　　　　　　　　　　　−
糖より酸の産生 アドニトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　−Ｌ（＋）−アラビノース　　　　　　　　　　
　　＋セロビオース　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　＋ズルシトール　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−メソ−エリスリトール　　　　
　　　　　　　　　　−フルクトース　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　＋Ｄ−ガラクトース　　
　　　　　　　　　　　　　　　　＋Ｄ−グルコース　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋グリセリン
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
イノシトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　＋イヌリン　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　−ラクトース　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　＋マルトース　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋マンニトー
ル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋マ
ンノース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　＋メレジトース　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　＋メリビオース　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　−ラフィノース　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　（＋）Ｌ（＋）−ラムノー
ス　　　　　　　　　　　　　　−Ｄ−リボース　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋サリシン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
−Ｌ−ソルボース　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　−ソルビトール　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　＋スターチ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　−サッカロース　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　＋トレハロース　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋Ｄ−キ
シロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
【００２２】Ｎｏ．　１−４株の主な性状グラム陰性の
桿状細菌で極鞭毛で運動する。カタラーゼ、オキシダー
ゼ陽性で、グルコースを酸化的に分解し酸を産生する。 ＤＮＡのＧＣｍｏｌ　％は６６．７％。主たるイソプレ
ノイドキノンはユビキノンＱ８　。多形性なし。 芽胞非形成。 【００２３】Ｎｏ．　１−４の同定 本菌株の主性状を“Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ　”　Ｖｏｌ．１、２　、３と対比した結果、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　属に属することが判った。Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　属で、主たるキノン系としてＱ８　を
含有する菌種は１６種あった（Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．，　２９，１７〜４０，１９８３）　。 そのうち“Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　”　
Ｖｏｌ．１に記載があるのは１３菌種である。記載され
ていない３菌種のうち１菌種はＰ．　ａｃｉｄｏｖｏｒ
ａｎｓに、また１菌種はＤＮＡのＧＣｍｏｌ　％が３６
〜３７．５％と低く、残りの１菌種は基準株の指定がな
かった。前記の“Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ”に
記載のあった１３菌種の中で、黄色色素を産生する菌種
と、硝酸塩の還元能のある菌種合計９菌種を除いた４菌
種の性状を対比して表１にまとめた。 【００２４】 【表１】 【００２５】表１には示さなかったが、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　　　ｉｎｅｒｓ　はグルコースからフルクト
ースの酸産生能はなく、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　　
ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉｉ　はグルコース等多くの糖
が利用できない。本菌株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
　　ｇｌａｄｉｏｌｉとはスライム形成、Ｔｗｅｅｎ　
８０の分解、４１℃での生育で、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　　　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ　とはゲラチンの分解
、アルギニンの分解の点で異なっている（アルギニンの
分解性状はキーポイントの一つになっている）。よって
本菌株をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　　ｓｐ．　と同定
したが、種（Ｓｐｅｃｉｅｓ）の確定はできなかった。 よって本菌株（Ｎｏ．　１−４）をシュードモナス・エ
スピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）Ｎｏ．　１
−４と命名した。 【００２６】本発明において、初めてシュードモナス属
に属する微生物がグルコースイソメラーゼを産生するこ
とが明らかになり、しかも、シュードモナス・エスピー
Ｎｏ．１−４の産生するグルコースイソメラーゼは新規
なグルコースイソメラーゼであることを開示するもので
ある。本発明においては、先ずシュードモナス属に属す
る新規なグルコースイソメラーゼの生産菌が適当な培地
で培養される。前記の新規なグルコースイソメラーゼ生
産菌の代表例としては、前記のシュードモナス・エスピ
ーＮｏ．　１−４が挙げられるが、耐酸性を有する本発
明の新規なグルコースイソメラーゼを生産する能力を有
する菌株はすべて本発明に使用することができることは
言うまでもない。なお、シュードモナス・エスピーＮｏ
．　１−４の変異株およびこれらの菌株から、たとえば
遺伝子組換えおよび細胞融合などによって誘導された菌
株を当然に使用することができる。 【００２７】前記の培養は、細菌の培養に一般的に用い
られる条件によって行うことができる。培地としては、
菌が同化し得る炭素源、窒素源、さらに必要に応じて無
機塩などを含有させた栄養培地が使用される。炭素源と
しては、グルコース、フルクトース、サッカロースおよ
びマンノースなどが単独、または組み合わせて用いられ
る。窒素源としてはペプトン、肉エキス、酵母エキスお
よびマルトエキスなどが単独、または組み合わせて用い
られる。その他、必要に応じて無機塩、金属塩およびビ
タミン類などが使用される。前記以外に同化し得る炭素
源、窒素源が使用できることは言うまでもない。培養は
通常、振とうまたは通気撹拌培養などの好気的条件下で
行うのがよく、工業的には深部通気撹拌培養が好ましい
。培養温度はグルコースイソメラーゼ生産菌が発育し、
本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は１
５〜３２℃、特に２８℃付近が好ましい。培養時間は培
養条件によって異なるが、本発明の新規な酵素が最高の
力価に達する時期を見計らって適当な時間に培養を停止
すればよく、通常は１〜３日程度である。発泡があると
きにはシリコン油などの消泡剤が適宜使用される。 【００２８】本発明の新規なグルコースイソメラーゼは
、このようにして得られた培養物中の主として菌体内に
含有されているので、培養菌体が溶菌していないかぎり
、培養液上清には存在しない場合が多い。従って、得ら
れた培養物から濾過または遠心分離等の通常の固液手段
によって集菌し、これらの菌体を超音波処理、フレンチ
プレス処理およびガラスビーズ処理等の機械的破壊手段
やリゾチーム等の酵素的溶解等の種々の方法を適宜単独
、あるいは組み合わせて粗製のグルコースイソメラーゼ
含有液が得られる。 【００２９】本発明の新規なグルコースイソメラーゼは
、このようにして得られた粗製のグルコースイソメラー
ゼ含有液から、例えば、硫安沈澱法、等電点沈澱法、ゲ
ル濾過法および半透膜による透析などの通常の酵素回収
法によって分離、回収される。 【００３０】このようにして得られたグルコースイソメ
ラーゼの純度を必要に応じてさらに向上させるために、
たとえば、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換
クロマトグラフィおよび電気泳動などにより常法で精製
することができる。 【００３１】本発明の新規なグルコースイソメラーゼの
性状を示す。すなわち、 （１）　酵素作用 つぎの式に示すように、少なくともグルコースよりフル
クトースを生成する反応を触媒する活性を有する。 Ｄ−グルコース　　―→　　Ｄ−フルクトース（２）　
基質特異性：少なくともグルコースに作用する。またキ
シロース、リボースにも作用する。 （３）　分子量 ６０，０００　　±　　７，０００ トーソー社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（０．７５×６
０ｃｍ）による値である。 溶出液；０．２Ｍ　　ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０） 標準品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マーカーを
使用。 分子量 １２，４００　　　　シトクロムＣ ３２，０００　　　　アデニレイトキナーゼ６７，００
０　　　　エノラーゼ １４２，０００　　　　ラクテイトデヒドロゲナーゼ２
９０，０００　　　　グルタメイトデヒドロゲナーゼ【
００３２】（４）　至適ｐＨおよび作用ｐＨ本発明の新
規なグルコースイソメラーゼの作用ｐＨは、ｐＨ３．３
〜５．０における活性が、ｐＨに関する最大活性に対す
る相対比として７０％以上であり、かつ、ｐＨ５．０〜
１０．０における活性が相対比として８０％以上である
。なお、本発明において「ｐＨに関する最大活性」とは
ｐＨを酸性からアルカリ性へ変化させてそれぞれの活性
を調べた時に最大値を示す活性と定義され、至適ｐＨに
おける活性の値と一致する。後記５０ｍＭの各緩衝液に
１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、２００ｍＭグルコースになる
ように調製し、酵素を添加して反応させて、生成された
フルクトースを後記のフルクトース測定法を用いて測定
した。 ｐＨ　　　　　　　　　　　　緩衝液 ３．３−４．０　　　　　　グリシン塩酸４．０−６．
０　　　　　　酢酸 ６．５−８．２　　　　　　リン酸 ８．０−９．０　　　　　　トリス塩酸９．０−１０．
０　　　　グリシン水酸化ナトリウムその結果を図１に
示した。図１において実線はエタノールを含まない反応
液を用いた結果であり、点線は３０％のエタノールを含
有した反応液を用いて行った結果を示している。それに
よると本発明の酵素の至適ｐＨは、ｐＨ７〜９付近にブ
ロードなピークとして認められた。エタノールを含まな
い反応液を用いた場合には、ｐＨ３．３においてさえ至
適ｐＨにおける活性の７５％以上の相対活性を示してい
る。３０％のエタノールが共存した場合には、ｐＨ４．
５以上の高いｐＨでは８５％以上の相対活性を示してい
る。ｐＨ４．５以上の高いｐＨではエタノール共存下の
方が活性が高めに保持される。 【００３３】（５）ｐＨ安定性 至適ｐＨと同様の各緩衝液に酵素を添加して５０℃、３
０分間加熱した後の残存活性を検討した結果を図２に示
した。少なくともｐＨ４．０−９．０において広い範囲
安定であり、７０％以上の活性を保持していた。 （６）　熱安定性 ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４）および５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて、４０℃から８０℃までの
各温度で１５分間加熱処理をした後の残存活性を検討し
た結果を図３に示した。図３において、実線は酢酸緩衝
液を、点線はトリス塩酸緩衝液を用いて行った結果を示
す。ｐＨ４においては約５０℃まで、ｐＨ８においては
約６０℃までは安定であった。 （７）　至適温度 ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いて至適温度の
検討を行った結果を図４に示した。これによれば５０℃
付近に至適温度を有していた。 （８）　等電点 ｐＨ　　５．１　　±　　０．６ キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法により
４℃、７００Ｖの定電圧で４０時間通電した後、分画し
、各画分の酵素活性を測定した。 （９）阻害剤 ５０ｍＭグリシン緩衝液を用いて、それぞれ１ｍＭの酢
酸、コハク酸、クエン酸および乳酸をそれぞれ共存させ
、酵素の活性発現率を検討したところ、本発明の酵素は
表２に示したごとく、前記の有機酸存在下でも９９．５
％以上の相対活性を示した。 【００３４】 【表２】 【００３５】なお、前記のグルコースイソメラーゼの性
状および後記の実施例におけるグルコースイソメラーゼ
の活性はＡｐｐｌ．　Ｅｎｖ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
，３８（６）　，　１１１１−１１１９（１９７９），
Ｗ．　Ｐ．Ｃｈｅｎらの変法に準拠して測定した。すな
わち、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ
グルコース、０．０５Ｍ　　ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２Ｏ　
、０．００５ＭおよびＣｏＣｌ２　・６Ｈ２Ｏ　からな
る混合液０．９ｍｌに適当に希釈した酵素液０．１ｍｌ
を添加し、３７℃で１時間反応させた後に０．５Ｍ過塩
素酸２ｍｌを添加して反応を停止する。その０．５ｍｌ
に２．４％システイン−塩酸０．１ｍｌ、７０％硫酸３
ｍｌ、０．１％カルバゾール／エタノール０．１ｍｌを
添加撹拌し、３７℃、１５分間インキュベートの後にＡ
５６０ｎｍ　（Ａ１）を測定する。この時、０．１ｍＭ
に調製したフルクトースの０．５ｍｌを用いて同様にし
てＡ５６０ｎｍ　（Ａ０）を測定し、スタンダードとす
る。 計算式　　　　Ｕ／ｍｌ＝（Ａ１／Ａ０）　×０．１　
×６×１／６０×１／０．１　×希釈率 【００３６】またフルクトースは、反応液１．０ｍｌに
０．５Ｍ過塩素酸２ｍｌを添加撹拌し、その０．５ｍｌ
に前記の発色試薬を添加してＡ５６０ｎｍ　（Ａ２）を
測定する。 計算式　　　　ｍＭ＝（Ａ２／Ａ０）　×０．１　×０
．６【００３７】本発明の新規なグルコースイソメラー
ゼは、異性化糖の製造などに好適に使用されるが、この
際にグルコースイソメラーゼは精製された酵素自体のほ
かに、この酵素を含有する培養物ならびに酵素自体およ
び培養物それぞれの処理物も好適に使用することができ
る。前記の培養物には、培養液ならびに培養物から分離
された菌体および濾液があるが、就中、菌体が好ましい
。前記の処理物には菌体の破壊物、培養物および菌体破
壊物、それぞれからの抽出物および抽出粗製物ならびに
固定化物などがある。菌体破壊物は、菌体をたとえば超
音波、ガラスビーズまたはフレンチプレスなどによる粉
砕ならびに自己消化などの常法により処理して得られる
。培養物および菌体破壊物のそれぞれから常法により、
これらの抽出物およびこの抽出物から分離された抽出粗
製品が得られる。固定化物は、酵素自体、培養物、菌体
破壊物ならびに培養物および菌体破壊物、それぞれから
の抽出物および抽出粗製物を、常法により、担体結合法
、架橋法および包括法によって固定化したものである。 【００３８】本発明の新規なグルコースイソメラーゼを
使用した異性化糖の製造法について説明する。従来の異
性化糖は、直接、グルコースを糖原料として異性化する
こともできるが、安価に製造するために、従来のグルコ
ースイソメラーゼを使用してたとえば、次の３工程で製
造されている。すなわち、 （１）　液化工程 原料澱粉液に、耐熱性アミラーゼを添加し、これをｐＨ
６．０〜６．５で、通常は蒸気加熱条件下にて液化澱粉
液（マルトオリゴ糖またはマルトデキストリン含有）を
得る。 なお、原料澱粉としては特に制限はないが、たとえば、
イモ類および穀物類に由来する、所謂、植物澱粉が好適
に使用される。 【００３９】（２）　糖化工程 液化工程で得られた液化澱粉液に糖化酵素として、たと
えば、イソアミラーゼもしくはプルラナーゼとグルコア
ミラーゼを併用し、またはマルターゼを使用し、ｐＨ４
．５付近で、一般には４５〜５０℃程度の加温条件下に
て液化澱粉液中のマルトデキストリンを加水分解してグ
ルコースに変化させる。 【００４０】（３）　異性化工程 糖化工程で得られたグルコースを含有する糖化液に従来
のグルコースイソメラーゼを加えてｐＨ７．５〜８．０
で５５〜６０℃程度に加熱して、グルコースの一部をフ
ルクトースに変化させてグルコースとフルクトースとを
含有する（通常は約１：１）異性化液が得られる。 【００４１】この従来法の異性化工程における従来のグ
ルコースイソメラーゼに替えて、本発明の新規なグルコ
ースイソメラーゼを使用することができる。この場合に
は異性化反応液のｐＨは３〜１０の広い範囲とすること
ができるが、異性化糖の分解および着色を防止するため
にはｐＨを４〜７とすることが好ましく、またｐＨを４
〜５とすることが特に好ましい。なお、この場合におい
ては前段の糖化工程からの糖化液はｐＨ４．５程度の酸
性であるが、この糖化液のｐＨを従来法におけるように
７．５〜８．０に調整する必要はなく、糖化液のｐＨ調
整を省略し得る。 【００４２】また、従来法の糖化工程において、本発明
の新規なグルコースイソメラーゼを併用して糖化と異性
化とを併進させることができ、これにより従来法におけ
る異性化工程を省略することができ、原料澱粉から２段
で異性化糖を製造することができる。この場合において
、反応液のｐＨは従来の糖化工程における反応液のｐＨ
と同様に４．５付近とすればよく糖化工程との都合で他
のｐＨ条件選択してよい。本発明の新規なグルコースイ
ソメラーゼの使用法としては、該酵素または該酵素を含
有する培養物もしくはそれらの処理物を添加もしくは接
触せしめて作用させる方法が例示される。該酵素の使用
量は反応の時間と温度および糖原料中のグルコースの濃
度によって適宜選択すればよく、例えば、１０ｍＭのグ
ルコースの存在下、該酵素を０．１ｕ／ｍｌを使用した
場合には、通常、３７℃、１時間の条件にて異性化する
ことができる。 【００４３】本発明の新規なグルコースイソメラーゼを
使用して、たとえば、酸性の食品およびアルコール飲料
の風味を変えることができる。酸性アルコール飲料とし
ては、特に、日本酒が例示されるが、その他にビールや
ワイン等の特に醸造酒が好適な例として挙げられる。す
なわち、日本酒に本発明の新規なグルコースイソメラー
ゼを作用せしめれば、日本酒はアルコールおよび多種類
が多量な有機酸が存在し酸性であるにも拘らず、このグ
ルコースイソメラーゼは日本酒に含有されているグルコ
ースに有効に作用してフルクトースに変化させる。処理
方法は、前記と同様に、該酵素または該酵素を含有する
培養物もしくはそれらの処理物を作用せしめればよく、
使用量や時間、温度等の条件も適宜選択すればよい。 【００４４】 【実施例】 実施例１　　シュードモナス・エスピーＮｏ．　１−４
の培養肉エキス０．５重量％、ペプトン（極東）０．５
重量％および塩化ナトリウム０．５重量％を含みｐＨ７
．０に調整された液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三
角フラスコに分注し、１２１℃で２０分間加熱滅菌した
後、これにシュードモナス・エスピーＮｏ．　１−４の
１白金耳を接種し、２８℃で１２０ｒ．ｐ．ｍ．の振と
う培養器で７０時間培養して種母９０ｍｌ（酵素活性０
．０１ｕ／ｍｌ）を得た。一方、消泡剤としてＳＡＧ４
７１（商品名　　日本ユニカー株式会社製）１０ｍｌを
添加した前記と同様な培地２０Ｌを、３０Ｌ容ジャーフ
ァメンターに仕込み、加熱滅菌した後に前記の種母に移
植し、培養温度２８℃、撹拌速度２００ｒ．ｐ．ｍ．、
培養時間５０時間の培養条件で通気撹拌培養し、培養物
１９Ｌ（酵素活性０．０１ｕ／ｍｌ）を得た。 【００４５】実施例２　　酵素の分離精製実施例１で得
られた培養物１９Ｌから遠心分離で集菌し、５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３００ｍｌの菌体懸濁液を
調製し、超音波破砕機（クボタ社製）を用いて菌体を破
砕した。この菌体破砕液に８Ｍ尿素液を４０ｍｌ添加撹
拌後、遠心分離して沈澱物を取り除き上清３００ｍｌ（
酵素活性０．５ｕ／ｍｌ）を得た。得られた上清を５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で緩衝化したＤＥＡＥ
−セテァロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）１００
ｍｌのカラムに通し、同様の緩衝液２００ｍｌで洗浄し
た後に、０．１５Ｍの塩化カリウムを含んだ５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌで溶出し、粗酵素
液１００ｍｌ（酵素活性１ｕ／ｍｌ）を得た。この粗酵
素液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０Ｌに対
して透析し、酵素液１１０ｍｌ（酵素活性０．８５ｕ／
ｍｌ）を得た。この酵素液の５０ｍｌを凍結乾燥し、３
８０ｍｇの凍結乾燥標品（０．１ｕ／ｍｇ）を得た。 【００４６】実施例３　　培養菌体を用いた酸性条件に
おけるグルコースの異性化 実施例１と同様にして得られた２０Ｌ分の培養菌体を蒸
留水で洗浄し、２００ｍｌの生理食塩水に懸濁した。こ
の菌体懸濁液を５０℃で１２時間加熱処理した後、遠心
分離（４５００ｒｐｍ　、１５分間）し、得られた沈澱
を再び生理食塩水２００ｍｌに懸濁し、この懸濁液を用
いて後記の種々の酸性条件におけるグルコースの異性化
の検討を行った。 反応条件 （１）　　　１０ｍＭ　　クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５
）（２）　　　１０ｍＭ　　酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）
（３）　　　１０ｍＭ　　グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ４
．５）（４）　　　１０ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）それぞれの緩衝液中で１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２
　、１００ｍＭグルコースになるように反応液１０ｍｌ
を調製し、これに菌懸濁液１ｍｌを添加して、３７℃で
１時間インキュベイトした後に、生成されたフルクトー
ス量を測定し、その（４）の条件下のフルクトース生成
量を１００％として、その相対生成量を表３に示した。 ｐＨ３．５のクエン酸緩衝液中においてさえも、至適ｐ
Ｈのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）の９８％もの相対
活性を示していた。 【００４７】 【表３】 【００４８】実施例４　　マルトオリゴ糖からフルクト
ースの生成 マルトオリゴ糖（シグマ社製：マルトデキストリン）１
ｇを蒸留水２０ｍｌに溶解し、ｐＨを４．５に調整した
。これにグルコアミラーゼ（クモノスカビ由来　　和光
純薬製）１０ｕおよびプルラナーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ　　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　由来　　シグマ社製
）１０ｕを添加し、１０ｍｌづつを試験管に分けた。そ
れぞれの試験管に　ＳＰＥＺＹＭＥ　ＧＩ（Ｓｔｏｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　　　ｒｉｂｉｇｉｎｏｓｕｓ　由来
のグルコースイソメラーゼ　　ＦＩＮＮＩＳＨＳＵＧＡ
Ｒ　社製；商品名）と実施例２で得られた本発明酵素を
それぞれ０．１ｕづつ添加し、３７℃で１時間インキュ
ベイトした後に生成されたフルクトース量を測定し、本
発明の酵素を用いたフルクトース生成量を１００％とし
た相対生成量を表４に示した。ＳＰＥＺＹＭＥ　ＧＩで
はフルクトースは微量しか生成されていない。 【００４９】 【表４】 【００５０】実施例５　　酵素の固定化キトパールＢＣ
Ｗ３５０３（富士紡績株式会社製：商品名）５ｇを蒸留
水でよく洗浄した後に、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
．０）２０ｍｌ中で３０分間インキュベイトした。濾過
後、洗浄したキトパールＢＣＷ３５０３を実施例２で得
られた酵素液（０．８５ｕ／ｍｌ）２５ｍｌに添加し、
これを撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベイトし
た。濾過後、ケーキを２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０
）で洗浄して固定化酵素を得た。前記の固定化酵素を用
いて後記の２つの反応液を用いてそれぞれ反応を行い、
グルコースから生成したフルクトースの量を測定した。 反応液： １．　　　　１００ｍＭ　　酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）
１００ｍＭ　　グルコース １ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　 ２．　　　　１００ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８
．５）１００ｍＭ　　グルコース １ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　 すなわち、前記のそれぞれの反応液１０ｍｌに固定化酵
素２ｇずつを添加し、撹拌しながら３７℃で１時間イン
キュベイトした後に生成されたフルクトースの量を測定
し、反応液　２の条件で生成されたフルクトース量を１
００％として相対生成量の値を表５に示した。フルクト
ース相対生成量は微差であった。 【００５１】 【表５】 【００５２】実施例６　　菌体の固定化アクリルアミド
（和光純薬）７．５ｇ、Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリ
ルアミド（和光純薬）０．２ｇ、１．５Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．９）および１．５％過硫酸アンモニウム
（和光純薬）１ｍｌを蒸留水で溶解して２０ｍｌに調整
し、実施例３の菌体懸濁液１０ｍｌを加えて混合した後
にＴＥＭＥＤ（和光純薬）を３０μｌ添加し、よく撹拌
した。２８℃で２４時間インキュベイトした後に固化し
たゲルを約２ｍｍ角のさいの目に切り、蒸留水でよく洗
浄して固定化菌体を得た。得られた固定化菌体２ｇづつ
を用いて実施例５と同様にして反応させたのち、グルコ
ースから生成されたフルクトースの量を測定し、トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）の条件で生成されたフルクト
ース量を１００％とした相対生成量を表６に示した。フ
ルクトースの相対生成量はｐＨ４．０とｐＨ８．５とで
は実質的に差はなかった。 【００５３】 【表６】 【００５４】実施例７　　新規なグルコースイソメラー
ゼに対する有機酸の影響 日本酒中の主要成分である有機酸に注目して、本発明の
新規なグルコースイソメラーゼの有機酸による活性阻害
について検討し、その結果を前記の表２に示した。１ｍ
Ｍの酢酸、コハク酸、クエン酸および乳酸のそれぞれに
よってＳＰＥＺＹＭＥ　ＧＩは８０％以上も活性が阻害
されていたが、本発明酵素は阻害されず９９．５％以上
の活性を保持していた。本実施例で使用された反応液の
組成は下記のとおりであった。 　　反応液組成　　　　　　５０ｍＭ　　　　　　グリ
シン塩酸緩衝液（ｐＨ４．３）　　　　　　　　　　　
　　　　　１００ｍＭ　　　　　　グルコース　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２０重量％　　エタノー
ル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍＭ　
　　　　　ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１ｍＭ　　　　　　有機酸【００５５】実
施例８　　日本酒中における安定性の検討０．５ｕ／ｍ
ｌに調整したＳＰＥＺＹＭＥ　ＧＩおよび本発明酵素の
それぞれ２ｍｌづつを日本酒１０ｍｌに添加して、５０
℃で２４時間インキュベイトした後の残存活性を測定し
たところＳＰＥＺＹＭＥ　ＧＩは完全に失活していたが
、本発明酵素は１００％活性が残存していた。 【００５６】実施例９　　日本酒中における活性発現に
ついて 対照品としてＳＰＥＺＹＭＥ　ＧＩを用いて、日本酒中
における活性発現について検討を行った。富久娘（商品
名　　東洋醸造株式会社製）に、前記の酵素をそれぞれ
０．１ｕ／ｍｌになるように添加し、１５℃で１２時間
インキュベイトした後に生成されたフルクトース量を測
定した。その結果、ＳＰＥＺＹＭＥ　ＧＩが０．１ｍＭ
であるのに対して、本発明酵素は４６ｍＭであってＳＰ
ＥＺＹＭＥ　ＧＩに対して４００倍以上の生成量を示し
た。本発明酵素を使用した場合のフルクトース生成量は
日本酒中のグルコースの約半量に相当し、本発明酵素は
日本酒中のグルコースをほぼ異性化し終わっていること
が判った。 【００５７】 【発明の効果】本発明の新規なグルコースイソメラーゼ
は酸性においてさえも高い活性を示し、この新規なグル
コースイソメラーゼは、たとえば、シュードモナス・エ
スピーＮｏ．　１−４のようなシュードモナス属に属す
る新規なイソメラーゼの生産菌を使用することにより効
率よく得られる。本願の新規なグルコースイソメラーゼ
を使用することにより、異性化糖を容易に、しかも、効
率よく製造することができ、また、日本酒中のグルコー
スを容易にフルクトースに異性化することにより風味の
変った日本酒が得られる。 【００５８】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の新規なグルコースイソメラーゼの至適
ｐＨおよび作用ｐＨを示すグラフである。

【図２】本発明の新規なグルコースイソメラーゼのｐＨ
安定性を示すグラフである。

【図３】本発明の新規なグルコースイソメラーゼのｐＨ
熱定性を示すグラフである。

【図４】本発明の新規なグルコースイソメラーゼ至適温
度を示すグラフである。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　少なくとも、下記の理化学的性質を有
   することを特徴とするグルコースイソメラーゼ。 （１）　酵素作用：少なくとも、下記の反応を触媒する
   。 Ｄ−グルコース　　→　　Ｄ−フルクトース（２）　基
   質特異性：少なくともＤ−グルコースを基質とする。 （３）　作用ｐＨ：ｐＨ３．３〜５．０における活性が
   、ｐＨに関する最大活性に対する相対比として７０％以
   上であり、かつ、ｐＨ５．０〜１０．０における活性が
   、相対比として８０％以上である。
2. 【請求項２】　　グルコースイソメラーゼが、ゲルろ化
   法による分子量が６０，０００±７，０００　であり、
   至適ｐＨが７〜９であることを特徴とする「請求項１」
   記載のグルコースイソメラーゼ。
3. 【請求項３】　　シュードモナス属に属するグルコース
   イソメラーゼ生産菌を培地にて培養し、得られた培養物
   からグルコースイソメラーゼを採取することを特徴とす
   るグルコースイソメラーゼの製造法。
4. 【請求項４】　　グルコースイソメラーゼが、少なくと
   も下記の理化学的性質を有するグルコースイソメラーゼ
   である「請求項３」記載の製造法。 （１）　酵素作用：少なくとも、下記の反応を触媒する
   。 Ｄ−グルコース　　→　　Ｄ−フルクトース（２）　基
   質特異性：少なくともＤ−グルコースを基質とする。 （３）　作用ｐＨ：ｐＨ３．３〜５．０における活性が
   、ｐＨに関する最大活性に対する相対比として７０％以
   上であり、かつ、ｐＨ５．０〜１０．０における活性が
   、相対比として８０％以上である。
5. 【請求項５】　　グルコースイソメラーゼが、ゲルろ過
   法による分子量が６０，０００±７，０００　であり、
   至適ｐＨが７〜９であることを特徴とする「請求項４」
   記載の製造法。
6. 【請求項６】　　シュードモナス属に属するグルコース
   イソメラーゼの生産菌がシュードモナス・エスピーＮｏ
   ．　１−４（微工研条寄第３３４８号；ＦＥＲＭＢＰ−
   ３３４８）である「請求項３」または「請求項４」記載
   の製造法。
7. 【請求項７】　　シュードモナス属に属する、少なくと
   も下記の理化学的性質を有するグルコースイソメラーゼ
   生産菌を培地にて培養して得られることを特徴とする該
   酵素を含有する培養物またはその処理物の製造法。 （１）　酵素作用：少なくとも、下記の反応を触媒する
   。 Ｄ−グルコース　　→　　Ｄ−フルクトース（２）　基
   質特異性：少なくともＤ−グルコースを基質とする。 （３）　作用ｐＨ：ｐＨ３．３〜５．０における活性が
   、ｐＨに関する最大活性に対する相対比として７０％以
   上であり、かつ、ｐＨ５．０〜１０．０における活性が
   、相対比として８０％以上である。
8. 【請求項８】　　グルコースイソメラーゼが、ゲルろ過
   法による分子量が６０，０００±７，０００　であり、
   至適ｐＨが７〜９であることを特徴とする「請求項７」
   記載の製造法。
9. 【請求項９】　　シュードモナス属に属するグルコース
   イソメラーゼ生産菌が、シュードモナス・エスピーＮｏ
   ．　１−４（微工研条寄第３３４８号；ＦＥＲＭＢＰ−
   ３３４８）である「請求項７」記載の製造法。
10. 【請求項１０】　　グルコースまたは糖化液を糖原料と
    して異性化糖を製造するに当たって、少なくとも下記の
    理化学的性質を有するグルコースイソメラーゼ、または
    該酵素を含有する培養物もしくはそれらの処理物を糖原
    料に作用せしめることを特徴とする異性化糖の製造法。 （１）　酵素作用：少なくとも、下記の反応を触媒する
    。 Ｄ−グルコース　　→　　Ｄ−フルクトース（２）　基
    質特異性：少なくともＤ−グルコースを基質とする。 （３）　作用ｐＨ：ｐＨ３．３〜５．０における活性が
    、ｐＨに関する最大活性に対する相対比として７０％以
    上であり、かつ、ｐＨ５．０〜１０．０における活性が
    、相対比として８０％以上である。
11. 【請求項１１】　　グルコースイソメラーゼが、ゲルろ
    過法による分子量が６０，０００±７，０００　であり
    、至適ｐＨが７〜９であることを特徴とする「請求項１
    ０」記載の製造法。
12. 【請求項１２】　　糖原料が、デンプン類を加水分解酵
    素または該酵素を含有する培養物もしくはそれらの処理
    物で処理することにより得られたグルコースを含有する
    糖化液であり、かつ、該加水分解酵素、または該酵素を
    含有する培養物もしくはそれらの処理物と、該グルコー
    スイソメラーゼまたは該酵素を含有する培養物もしくは
    それらの処理物とを、酸性条件下で逐次または同時に該
    糖原料に作用せしめることを特徴とする「請求項１０」
    記載の製造法。