JPH0667316B2 - Ｌ―フコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents
Ｌ―フコースデヒドロゲナーゼInfo
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- JPH0667316B2 JPH0667316B2 JP63234745A JP23474588A JPH0667316B2 JP H0667316 B2 JPH0667316 B2 JP H0667316B2 JP 63234745 A JP63234745 A JP 63234745A JP 23474588 A JP23474588 A JP 23474588A JP H0667316 B2 JPH0667316 B2 JP H0667316B2
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- fdh
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- nadp
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、Ｌ−フコースに作用してＬ−フコノラクトン
にすると共に、酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌ
クレオチドリン酸（NADP）を還元型ニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチドリン酸（NADPH）に還元する新
規なＬ−フコースデヒドロゲナーゼ（以下Ｌ−FDHとい
う）に関するものである。
にすると共に、酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌ
クレオチドリン酸（NADP）を還元型ニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチドリン酸（NADPH）に還元する新
規なＬ−フコースデヒドロゲナーゼ（以下Ｌ−FDHとい
う）に関するものである。
＜従来の技術＞ 蛋白質や脂質に結合している複合糖質が、生体の情報伝
達の一部を担っていることが指摘されて以来、これらの
糖質に関する知見が急速に増加している。それらの中
に、肺ガンの病態に呼応して、そのＬ−フコースが増減
するという報告〔Clin.Chem.Vol.22,No.9,1516〜1521,
（1976）〕がある。故にこの糖を測定することは、この
種の患者の病態に関して有用な情報を与えると思われ
る。
達の一部を担っていることが指摘されて以来、これらの
糖質に関する知見が急速に増加している。それらの中
に、肺ガンの病態に呼応して、そのＬ−フコースが増減
するという報告〔Clin.Chem.Vol.22,No.9,1516〜1521,
（1976）〕がある。故にこの糖を測定することは、この
種の患者の病態に関して有用な情報を与えると思われ
る。
その測定法は、酵素を用いた方法が精度と簡便性の上に
おいて優れている。Ｌ−フコース定量用の酵素として
は、ブタ肝臓由来のＬ−FDH〔J.Biol.Chem.,Vol.244,47
85〜4792,（1969）〕羊肝臓由来のＬ−FDH〔Arch.Bioch
em.Biophys.,Vol.186,184〜188,（1978）〕，ウサギ肝
臓由来のＬ−FDH〔J.Biochem.,Vol.86,1559〜1565,（19
79）〕，コリネバクテリウム属細菌由来のＬ−FDH（特
開昭62−155085），プルラリアプルランス由来のＬ−FD
H〔Arq.Biol.Tecnol.,Vol.30,361〜366,（1987）〕など
が知られているが、いずれも補酵素としてニコチンアミ
ド・アデニン・ジヌクレオチド（NAD）を利用するデヒ
ドロゲナーゼである。
おいて優れている。Ｌ−フコース定量用の酵素として
は、ブタ肝臓由来のＬ−FDH〔J.Biol.Chem.,Vol.244,47
85〜4792,（1969）〕羊肝臓由来のＬ−FDH〔Arch.Bioch
em.Biophys.,Vol.186,184〜188,（1978）〕，ウサギ肝
臓由来のＬ−FDH〔J.Biochem.,Vol.86,1559〜1565,（19
79）〕，コリネバクテリウム属細菌由来のＬ−FDH（特
開昭62−155085），プルラリアプルランス由来のＬ−FD
H〔Arq.Biol.Tecnol.,Vol.30,361〜366,（1987）〕など
が知られているが、いずれも補酵素としてニコチンアミ
ド・アデニン・ジヌクレオチド（NAD）を利用するデヒ
ドロゲナーゼである。
これらを利用してＬ−フコースを定量する試みも、また
いくつか提出されている。たとえば、特開昭62−175197
やAnal.Biochem,Vol.121,129〜134,（1982）やAnal.Bio
chem.,Vol.112,76〜81,（1981）およびMethods Enzym,
Anal.（3rd Ed.）,Vol.6,387〜398等である。
いくつか提出されている。たとえば、特開昭62−175197
やAnal.Biochem,Vol.121,129〜134,（1982）やAnal.Bio
chem.,Vol.112,76〜81,（1981）およびMethods Enzym,
Anal.（3rd Ed.）,Vol.6,387〜398等である。
＜発明が解決しようとする問題点＞ 生体の一部、たとえば血清などを試料としてその成分を
酵素的に測定する場合、当然のことながら、生体に本来
含有されている対謝系の酵素や対謝物の影響ができるだ
け少ない様に測定系を組み立てることが望ましい。
酵素的に測定する場合、当然のことながら、生体に本来
含有されている対謝系の酵素や対謝物の影響ができるだ
け少ない様に測定系を組み立てることが望ましい。
この観点から見て、NADPを補酵素として利用するデヒド
ロゲナーゼを測定に用いるのは、NADを補酵素として利
用するデヒドロゲナーゼを用いるのに比べて、優れてい
る。なぜならば、血清等には、NAD（またはNADH）を利
用する酵素（たとえば、ラクテート・デヒドロゲナーゼ
など）が比較的多く含まれており、また、その代謝物
（たとえば、ピルビン酸や、乳酸など）も常に含有され
ており、NADの定量系では、これらの影響を受け易いか
らである。
ロゲナーゼを測定に用いるのは、NADを補酵素として利
用するデヒドロゲナーゼを用いるのに比べて、優れてい
る。なぜならば、血清等には、NAD（またはNADH）を利
用する酵素（たとえば、ラクテート・デヒドロゲナーゼ
など）が比較的多く含まれており、また、その代謝物
（たとえば、ピルビン酸や、乳酸など）も常に含有され
ており、NADの定量系では、これらの影響を受け易いか
らである。
本発明者等は、操作が簡単で、しかも精度の高いＬ−フ
コースの測定法について検討したところ、土壌から分離
したシュードモナス属に属する一細菌が、Ｌ−フコース
に作用して、Ｌ−フコノラクトンにすると共にNADPをNA
DPHに還元する新規な酵素を生産し、この酵素がＬ−フ
コースの測定に有効に利用できることを見出し、本発明
を完成した。
コースの測定法について検討したところ、土壌から分離
したシュードモナス属に属する一細菌が、Ｌ−フコース
に作用して、Ｌ−フコノラクトンにすると共にNADPをNA
DPHに還元する新規な酵素を生産し、この酵素がＬ−フ
コースの測定に有効に利用できることを見出し、本発明
を完成した。
すなわち、本発明はＬ−フコースに作用して、Ｌ−フコ
ノラクトンにすると共にNADPをNADPHに還元する新規な
酵素Ｌ−FDHである。
ノラクトンにすると共にNADPをNADPHに還元する新規な
酵素Ｌ−FDHである。
＜問題点を解決するための手段＞ 以下、本発明を具体的に説明する。
本発明における新規酵素Ｌ−FDHの理化学的性質は下記
の通りである。
の通りである。
（１）作用及び基質特異性 次の反応式に示されるごとく、Ｌ−フコースとNADPの共
存下でＬ−フコースをＬ−フコノラクトンに酸化すると
共にNADPをNADPHに還元する。
存下でＬ−フコースをＬ−フコノラクトンに酸化すると
共にNADPをNADPHに還元する。
Ｌ−フコース＋NADP→Ｌ−フコノラクトン＋NADPH＋H+ 本酵素は、Ｌ−フコース（100％）に最も特異性が高い
が、Ｌ−ガラクトース（96％）,D−アラビノース（１
％）などにも作用する。しかし、他の通常存在する糖類
には、ほとんど、または全く作用しない。
が、Ｌ−ガラクトース（96％）,D−アラビノース（１
％）などにも作用する。しかし、他の通常存在する糖類
には、ほとんど、または全く作用しない。
また、本酵素は、補酵素としてNADP（100％）を要求
し、NAD（１％）に対しては、わずかしか作用を示さな
い。
し、NAD（１％）に対しては、わずかしか作用を示さな
い。
（２）至適pH及び安定pH範囲 トリス−イミダゾール−酢酸ナトリウム緩衝液を用いた
場合、第１図に示すとおり、9.0〜10.0である。安定pH
範囲は同じく第２図に示すごとく、8.0〜10.5である。
場合、第１図に示すとおり、9.0〜10.0である。安定pH
範囲は同じく第２図に示すごとく、8.0〜10.5である。
（３）作用適温の範囲 第３図に示すごとく、40〜60℃である。
（４）pH、温度等による失活の条件 第４図に示すごとく、10分間の熱処理では、40℃まで安
定であり、それ以上の温度では急速に失活する。30℃,6
0分間の熱処理ではpH8.0〜10.5で安定であり、pH6.0以
下では特に不安定である。
定であり、それ以上の温度では急速に失活する。30℃,6
0分間の熱処理ではpH8.0〜10.5で安定であり、pH6.0以
下では特に不安定である。
（５）阻害剤の影響及び安定化 上表は、各種金属塩及び阻害剤を2mMの濃度で含有する
反応液中での酵素活性を測定したものである。
反応液中での酵素活性を測定したものである。
その他、CaCl2,MgSO4,NiSO4,CuSO4,EDTA,O−フェナント
ロリン，α，α′−ジピリジル,KCN,NaN3等の阻害及び
活性化は観察されなかった。
ロリン，α，α′−ジピリジル,KCN,NaN3等の阻害及び
活性化は観察されなかった。
（６）精製方法 本酵素の単離精製は、常法に従って行うことができる。
たとえば、硫安沈殿、フェニルセファロースを用いたカ
ラムクロマトグラフィー,DEAEセファデックスを用いた
カラムクロマトグラフィー，セファデックスＧ−100に
よるゲル濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組合わせ
て使用する。
たとえば、硫安沈殿、フェニルセファロースを用いたカ
ラムクロマトグラフィー,DEAEセファデックスを用いた
カラムクロマトグラフィー，セファデックスＧ−100に
よるゲル濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組合わせ
て使用する。
（７）分子量 0.05Mリン酸カリウム緩衝液（0.1M NaCl含有）を用い
てセファデックスＧ−100カラムによるゲル濾過法によ
り測定した値は、 約32,000〜36,000である。
てセファデックスＧ−100カラムによるゲル濾過法によ
り測定した値は、 約32,000〜36,000である。
（８）ポリアクリルアミドゲル電気泳動 15％ポリアクリルアミドゲルを用いて、常法によって電
気泳動を行った結果、第５図に示すごとく、ほぼ単一の
バンドが認められた。ブロムフェノールブルーを指標と
した時の相対泳動距離は、7.5％ゲルの場合が0.79,10％
ゲルの場合が0.57,15％ゲルの場合が0.37であった。
気泳動を行った結果、第５図に示すごとく、ほぼ単一の
バンドが認められた。ブロムフェノールブルーを指標と
した時の相対泳動距離は、7.5％ゲルの場合が0.79,10％
ゲルの場合が0.57,15％ゲルの場合が0.37であった。
（９）等電点 アクリルアミド焦点電気泳動法によって測定した値は、
5.2である。
5.2である。
（10）活性の測定法 トリス−イミダゾール−酢酸ナトリウム緩衝液（各々0.
12M含有液を4N NaOHでpH9.5に調製する）2.5mlに15mM
NADP溶液0.2mlを加える。37℃に５分間保った後に酵
素液0.1mlを加え、更に150mM Ｌ−フコース溶液0.2ml
を加えて混合し、反応を始める。直ちに37℃に保った吸
光度測定用セル（1cm光路）に移し、340nmの波長で２分
または必要であれば、それ以上の時間にわたって吸光度
を測定する。１単位は、１分間に１μモルのNADPHを生
成させる酵素量である。
12M含有液を4N NaOHでpH9.5に調製する）2.5mlに15mM
NADP溶液0.2mlを加える。37℃に５分間保った後に酵
素液0.1mlを加え、更に150mM Ｌ−フコース溶液0.2ml
を加えて混合し、反応を始める。直ちに37℃に保った吸
光度測定用セル（1cm光路）に移し、340nmの波長で２分
または必要であれば、それ以上の時間にわたって吸光度
を測定する。１単位は、１分間に１μモルのNADPHを生
成させる酵素量である。
以上のように本酵素は、その補酵素にNADPを用いるとい
う点で従来知られていなかった新規なＬ−FDHである。
う点で従来知られていなかった新規なＬ−FDHである。
次に、本発明による新規な酵素Ｌ−FDHの製造法につい
て説明する。
て説明する。
使用される微生物は、シュードモナス属に属し、該Ｌ−
FDH生産能を有する菌株であって、その具体例として
は、シュードモナスsp.No.1143が挙げられ、該菌の変種
もしくは変異株も用いられる。シュードモナスsp.No.11
43は、本発明者等が土壌中より分離した菌株であり、そ
の菌学適性質は下記の通りである。
FDH生産能を有する菌株であって、その具体例として
は、シュードモナスsp.No.1143が挙げられ、該菌の変種
もしくは変異株も用いられる。シュードモナスsp.No.11
43は、本発明者等が土壌中より分離した菌株であり、そ
の菌学適性質は下記の通りである。
（ａ）形 態 顕微鏡的観察（24℃，肉汁寒天培地,16時間培養） 細胞の大きさ:0.4〜0.5×0.7〜1.0μｍの桿菌 細胞の多形性：均一な桿菌であり、末端で相互に連な
った短い連鎖状態も見られる。
った短い連鎖状態も見られる。
運動性：運動性あり（極毛）。２個連鎖したものは、
回転する。
回転する。
胞子の有無：形成しない。
グラム染色性：陰性 抗酸性：陰性 （ｂ）各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養:30℃２日間の培養で直径1mmで円
状、淡黄色油質様光沢を持つコロニーとなる。周縁はや
や波状であるが、更に時間がたつと、全縁となる。
状、淡黄色油質様光沢を持つコロニーとなる。周縁はや
や波状であるが、更に時間がたつと、全縁となる。
肉汁寒天斜面培養：生育は普通で淡黄色油質様光沢の
ある菌で表面は円滑である。培地の着色は見られない。
ある菌で表面は円滑である。培地の着色は見られない。
肉汁液体培養:30℃振盪培養では１日で良く生育し、
５日程で溶菌を始め、７日では完全に溶けて透明になっ
た。30℃静置培養では、表面にわずかの菌環と、少しの
白い沈澱を作り、全体がわずかに混濁した。
５日程で溶菌を始め、７日では完全に溶けて透明になっ
た。30℃静置培養では、表面にわずかの菌環と、少しの
白い沈澱を作り、全体がわずかに混濁した。
肉汁寒天穿刺培養：（30℃７日培養）刺条にそってわ
ずかに生育し、糸状になる。
ずかに生育し、糸状になる。
リトマスミルク：底部分がわずかに還元して脱色し、
わずかに酸性化する。
わずかに酸性化する。
BCPミルク：わずかに酸性化する。
ゼラチン穿刺培養:24℃７日間の培養によって、表面
が少し液化した。
が少し液化した。
（ｃ）生理的性質 硝酸塩の還元：陽性 脱窒反応：嫌気的生育は見られるが、ガスの生成はな
し。
し。
MRテスト：陰性 VPテスト：陰性 インドールの生成：陰性 硫化水素の生成：陽性（酢酸鉛試験紙法） デンプンの分解：陽性 クエン酸の利用：陰性 無機窒素源の利用：アンモニウム塩は利用するが、硝
酸塩は利用しない。
酸塩は利用しない。
色素の生成：黄色の非拡散性色素を生成する。
ウレアーゼ：陰性 オキシダーゼ：陰性 カタラーゼ：陽性 生育の範囲：温度16〜38℃ （至適27℃付近） pH5.0〜9.8 （至適pH7付近） 酸素に対する態度：好気的 Ｏ−Ｆテスト：変化なし 糖類から酸及びガスの生成 （ｄ）その他の性質 菌体内ポリハイドロキシブチレートの蓄積 陰性 蛍光性物質の生産 陽性 アルギニン・ジハイドロラーゼの生産 陰性 以上の新規なＬ−FDH生産能を有する本菌の分類学的諸
性質を、「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマ
チック・バクテリオロジー」（1984年）第１巻の分類と
対比すると、本菌は、グラム染色性が陰性、好気性の無
胞子桿菌で極毛を持つカタラーゼ陽性菌であることか
ら、シュードモナス属に属すると思われる。菌体内にポ
リハイドロキシブチレートを蓄積せず、蛍光性物質を生
産し、アルギニン・ジハイドロラーゼを生産しないオキ
シダーゼ陰性菌という事から、シュードモナス・シリン
ガエ（Pseudomonas syringae）またはシュードモナス
・ビリジフラバ（Pseudomonas viridiflava）に近縁と
思われるが、デンプンの分解性や脱窒反応、黄色色素の
生産等の点で異なっており、従来知られていない新規な
菌株と思われる。
性質を、「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマ
チック・バクテリオロジー」（1984年）第１巻の分類と
対比すると、本菌は、グラム染色性が陰性、好気性の無
胞子桿菌で極毛を持つカタラーゼ陽性菌であることか
ら、シュードモナス属に属すると思われる。菌体内にポ
リハイドロキシブチレートを蓄積せず、蛍光性物質を生
産し、アルギニン・ジハイドロラーゼを生産しないオキ
シダーゼ陰性菌という事から、シュードモナス・シリン
ガエ（Pseudomonas syringae）またはシュードモナス
・ビリジフラバ（Pseudomonas viridiflava）に近縁と
思われるが、デンプンの分解性や脱窒反応、黄色色素の
生産等の点で異なっており、従来知られていない新規な
菌株と思われる。
以上の理由により本菌をシュードモナスsp.No.1143と命
名した。なおシュードモナスsp.No.1143は、通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第2056号
（FERM BP−2056）として寄託されている。
名した。なおシュードモナスsp.No.1143は、通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第2056号
（FERM BP−2056）として寄託されている。
次に本発明で使用する培地としては、炭素源，窒素源，
無機物，その他の栄養素を適宜含有する培地ならば、合
成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。
無機物，その他の栄養素を適宜含有する培地ならば、合
成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。
炭素源としては、グルコース，ラクトース，フラクトー
ス，マルトース，グリセリン等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニウム塩の他にペプトン，カゼ
イン消化物，グルタミン酸ソーダ，酵母エキス等の窒素
性有機物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリ
ウム，カリウム，マグネシウム，マンガン，カルシウ
ム，鉄等の塩類が使用できる。
ス，マルトース，グリセリン等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニウム塩の他にペプトン，カゼ
イン消化物，グルタミン酸ソーダ，酵母エキス等の窒素
性有機物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリ
ウム，カリウム，マグネシウム，マンガン，カルシウ
ム，鉄等の塩類が使用できる。
本発明においては、該Ｌ−FDH生産能を有する菌株をＬ
−フコースを含有する培地で培養したときにＬ−FDHが
収率よく得られる。該培養培地の好適な例としては、Ｌ
−フコース0.3％，ペプトン0.1％，イーストエキス0.1
％，リン酸一カリウム0.09％，リン酸二カリウム0.11
％，硫酸マグネシムウ0.05％，硫酸第一鉄0.001％（pH
7.0）の培地例が挙げられる。そして該培地で30℃,24時
間好気的に培養した場合は、Ｌ−フコースを他の炭素源
におきかえた場合の10〜100倍の生産力価を得ることが
できる。
−フコースを含有する培地で培養したときにＬ−FDHが
収率よく得られる。該培養培地の好適な例としては、Ｌ
−フコース0.3％，ペプトン0.1％，イーストエキス0.1
％，リン酸一カリウム0.09％，リン酸二カリウム0.11
％，硫酸マグネシムウ0.05％，硫酸第一鉄0.001％（pH
7.0）の培地例が挙げられる。そして該培地で30℃,24時
間好気的に培養した場合は、Ｌ−フコースを他の炭素源
におきかえた場合の10〜100倍の生産力価を得ることが
できる。
培養温度は通常20〜35℃の範囲で、好適には30℃近辺で
行なわれる。培養開始のpHは通常６〜８の条件であり、
好適には７付近である。この様な条件下で、20〜40時
間、振盪または深部攪拌培養を行うと、該培養物にＬ−
FDHが生成蓄積する。
行なわれる。培養開始のpHは通常６〜８の条件であり、
好適には７付近である。この様な条件下で、20〜40時
間、振盪または深部攪拌培養を行うと、該培養物にＬ−
FDHが生成蓄積する。
Ｌ−FDHは、通常菌体中に存在するので、培養物を遠心
分離、あるいは濾過等の方法で、菌体だけを分離するの
が好ましい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素を可
溶化することによって溶液中へ放出させる。
分離、あるいは濾過等の方法で、菌体だけを分離するの
が好ましい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素を可
溶化することによって溶液中へ放出させる。
菌体の破壊方法は、ダイノミル，フレンチプレス，超音
波等の物理的なものや、トリトンＸ−100,ラウリル硫酸
ソーダ,EDTA等の化学的な方法，リゾチーム等の酵素的
な方法を単独、または併用して用いることができる。こ
のようにして得られた菌体破壊液から核酸を常法によっ
て除去し、濾過または遠心によって不溶物を除き、Ｌ−
FDHを得る。更に該Ｌ−FDHは必要により酵素の単離精製
の常法に従って、例えば、（１）硫安分画（２）フェニ
ルセファロースによるカラムクロマドグラフィー（３）
DEAEセファデックスによるカラムクロマトグラフィー
（４）セファデックスＧ−100によるゲル濾過等の方
法、またはその他の方法を必要に応じて組合わせて用い
ることにより、精製されたＬ−FDHを得ることができ
る。
波等の物理的なものや、トリトンＸ−100,ラウリル硫酸
ソーダ,EDTA等の化学的な方法，リゾチーム等の酵素的
な方法を単独、または併用して用いることができる。こ
のようにして得られた菌体破壊液から核酸を常法によっ
て除去し、濾過または遠心によって不溶物を除き、Ｌ−
FDHを得る。更に該Ｌ−FDHは必要により酵素の単離精製
の常法に従って、例えば、（１）硫安分画（２）フェニ
ルセファロースによるカラムクロマドグラフィー（３）
DEAEセファデックスによるカラムクロマトグラフィー
（４）セファデックスＧ−100によるゲル濾過等の方
法、またはその他の方法を必要に応じて組合わせて用い
ることにより、精製されたＬ−FDHを得ることができ
る。
次に本発明によるＬ−フコースの定量法及び定量用キッ
トについて具体的に説明する。
トについて具体的に説明する。
本発明の測定原理は下記に示す通りである。
試料中のＬ−フコースにＬ−FDHを作用させ、生成され
たNADPHを公知の測定方法、たとえば紫外部340nmの吸光
度を測定する方法等によって測定することができる。
たNADPHを公知の測定方法、たとえば紫外部340nmの吸光
度を測定する方法等によって測定することができる。
本発明に用いるＬ−FDHは、補酵素としてNADPを利用す
るものであれば、いかなる起源のものでも使用できる
が、たとえば、微生物、殊にシュードモナス属に属する
細菌から選ばれた菌を培養して得られるＬ−FDHを用い
ることが好ましい。
るものであれば、いかなる起源のものでも使用できる
が、たとえば、微生物、殊にシュードモナス属に属する
細菌から選ばれた菌を培養して得られるＬ−FDHを用い
ることが好ましい。
シュードモナス属に属する上記酵素生産菌としては、た
とえば、シュードモナスsp.No.1143（FERM BP−2056）
等が挙げられる。
とえば、シュードモナスsp.No.1143（FERM BP−2056）
等が挙げられる。
試料中のＬ−フコースに上記Ｌ−FDHを作用させる場合
には、pH7〜10及び温度60℃以下、好ましくはpH8〜10及
び温度35〜50℃の条件で、通常は２〜20分間程度反応さ
せる。pHの調整には、前記pH範囲を維持することがで
き、かつ酵素反応を阻害しない任意の緩衝液が用いら
れ、たとえば、リン酸カリウム緩衝液，トリス−塩酸緩
衝液，グリシン−苛性ソーダ緩衝液，炭酸ナトリウム緩
衝液等が好適に使用できる。
には、pH7〜10及び温度60℃以下、好ましくはpH8〜10及
び温度35〜50℃の条件で、通常は２〜20分間程度反応さ
せる。pHの調整には、前記pH範囲を維持することがで
き、かつ酵素反応を阻害しない任意の緩衝液が用いら
れ、たとえば、リン酸カリウム緩衝液，トリス−塩酸緩
衝液，グリシン−苛性ソーダ緩衝液，炭酸ナトリウム緩
衝液等が好適に使用できる。
Ｌ−FDHの作用により生成されるNADPHの定量は、いかな
る方法を用いても良いが、最も一般的に用いられている
方法は、紫外部340nmにおける吸光度を測定する方法で
ある。可視部に吸収を持つ色素に転換して定量する方法
は、 NADPHをフェナジンメトサルフェートとニトロブルーテ
トラゾリウムとで反応させて、生成したダイホルマザン
を570nmにおける吸光度で測定するものや、フェナジン
メトサルフェートまたは、それに類する作用をする電子
伝達体または金属イオンと反応させて生成した過酸化水
素をパーオキシダーゼと各種色源体と共に発色させて、
それぞれの好適な波長での吸光度を測定するものなどが
ある。過酸化水素に導かれたものは、ルミノールと共に
発光させて検出することもできる。また適当に選択した
複数の酸化還元指示薬と電子伝達体を共存させて、その
色調の特徴から半定量的に検出することも可能である。
る方法を用いても良いが、最も一般的に用いられている
方法は、紫外部340nmにおける吸光度を測定する方法で
ある。可視部に吸収を持つ色素に転換して定量する方法
は、 NADPHをフェナジンメトサルフェートとニトロブルーテ
トラゾリウムとで反応させて、生成したダイホルマザン
を570nmにおける吸光度で測定するものや、フェナジン
メトサルフェートまたは、それに類する作用をする電子
伝達体または金属イオンと反応させて生成した過酸化水
素をパーオキシダーゼと各種色源体と共に発色させて、
それぞれの好適な波長での吸光度を測定するものなどが
ある。過酸化水素に導かれたものは、ルミノールと共に
発光させて検出することもできる。また適当に選択した
複数の酸化還元指示薬と電子伝達体を共存させて、その
色調の特徴から半定量的に検出することも可能である。
これらの検出方法は、その特徴によって使いわければ良
い。
い。
またＬ−フコースの定量を実施する場合には、試料中の
Ｌ−フコースは遊離の状態にあることが必要であり、複
合糖質の一部として結合しているＬ−フコースを測定す
る場合には、α−Ｌ−フコシダーゼなどを作用させて遊
離状態にすることが必要である。この場合に使用するα
−Ｌ−フコシダーゼは、いかなる起源のものでも良い
が、複合糖質のα−Ｌ−フコシド結合を素早く切断でき
ることが必要である。この例としては、アスペルギルス
属由来のα−Ｌ−フコシダーゼ〔J.Biol.Chem.,Vol.24
5,299〜304,（1970）〕や海産巻貝由来のα−Ｌ−フコ
シダーゼ〔J.Biochem.,Vol.70,75〜78,（1971）〕や動
物由来（J.Biol.Chem.,Vol.247,23〜32,（1972）〕など
がある。
Ｌ−フコースは遊離の状態にあることが必要であり、複
合糖質の一部として結合しているＬ−フコースを測定す
る場合には、α−Ｌ−フコシダーゼなどを作用させて遊
離状態にすることが必要である。この場合に使用するα
−Ｌ−フコシダーゼは、いかなる起源のものでも良い
が、複合糖質のα−Ｌ−フコシド結合を素早く切断でき
ることが必要である。この例としては、アスペルギルス
属由来のα−Ｌ−フコシダーゼ〔J.Biol.Chem.,Vol.24
5,299〜304,（1970）〕や海産巻貝由来のα−Ｌ−フコ
シダーゼ〔J.Biochem.,Vol.70,75〜78,（1971）〕や動
物由来（J.Biol.Chem.,Vol.247,23〜32,（1972）〕など
がある。
本発明のＬ−フコース定量用キットは、Ｌ−FDH,NADPと
生成されるNADPHを定量するための酵素や試薬類、及び
これらの反応を円滑に進めるための緩衝用試薬からなっ
ている。この試薬類、酵素類は、液剤、固形剤もしくは
凍結乾燥製剤とし、必要に応じて使用前に緩衝液に溶解
混合して測定用試薬とする。
生成されるNADPHを定量するための酵素や試薬類、及び
これらの反応を円滑に進めるための緩衝用試薬からなっ
ている。この試薬類、酵素類は、液剤、固形剤もしくは
凍結乾燥製剤とし、必要に応じて使用前に緩衝液に溶解
混合して測定用試薬とする。
Ｌ−フコースの測定方法は、Ｌ−フコース含有試料に直
接作用させることによってNADPHを生成させる。そし
て、これをそのまま、あるいはNADPH定量用試薬を加え
ることによってNADPHを測定する。これらの測定方法
は、１試薬系でも２試薬系でも良く、さらに何試薬系で
測定しても良い。
接作用させることによってNADPHを生成させる。そし
て、これをそのまま、あるいはNADPH定量用試薬を加え
ることによってNADPHを測定する。これらの測定方法
は、１試薬系でも２試薬系でも良く、さらに何試薬系で
測定しても良い。
＜発明の効果＞ 本発明の新規なＬ−FDHを用いると、Ｌ−フコースの定
量を精度良く行うことができ、肺ガン等の病態診断に有
益な情報を得ることができる。また、本発明によれば、
操作が簡単でしかも共存するグルコースやピルビン酸，
乳酸，ラクテートデヒドロゲナーゼなどの影響を受けな
い正確性の高いＬ−フコース定量が可能となり、複合糖
質の研究分野において極めて有意義である。
量を精度良く行うことができ、肺ガン等の病態診断に有
益な情報を得ることができる。また、本発明によれば、
操作が簡単でしかも共存するグルコースやピルビン酸，
乳酸，ラクテートデヒドロゲナーゼなどの影響を受けな
い正確性の高いＬ−フコース定量が可能となり、複合糖
質の研究分野において極めて有意義である。
次に本発明を実施例により説明する。
＜実施例＞ 実施例１ シュードモナスsp.No.1143（FERM BP−2056）を150ml
の三角フラスコに入った30mlの減菌種培地（Ｌ−フコー
ス0.3％，ペプトン0.1％，酵母エキス0.1％，リン酸一
カリウム0.09％，リン酸二カリウム0.11％，硫酸マグネ
シウム0.05％，硫酸第１鉄0.001％,pH7.0）に植菌し、3
0℃にて振盪培養した。これを同じ組成をもった培地２
が入ったジャーファーメンター（株式会社いわしや生
物科学製）に10ml接種した。30℃,24時間，通気（２
／min），攪拌（400rpm）培養した。この培養液を8,000
rpmで20分間遠心分離して菌体を集めた。Ｌ−FDHは菌体
部分に蓄積されていた。
の三角フラスコに入った30mlの減菌種培地（Ｌ−フコー
ス0.3％，ペプトン0.1％，酵母エキス0.1％，リン酸一
カリウム0.09％，リン酸二カリウム0.11％，硫酸マグネ
シウム0.05％，硫酸第１鉄0.001％,pH7.0）に植菌し、3
0℃にて振盪培養した。これを同じ組成をもった培地２
が入ったジャーファーメンター（株式会社いわしや生
物科学製）に10ml接種した。30℃,24時間，通気（２
／min），攪拌（400rpm）培養した。この培養液を8,000
rpmで20分間遠心分離して菌体を集めた。Ｌ−FDHは菌体
部分に蓄積されていた。
実施例２ 実施例１のようにして培養した後集菌して、−20℃に凍
結保存してあった生菌体1.1kgを、0.02Mリン酸カリウム
緩衝液（pH8.0）（以下これを標準緩衝液という）50
に分間させて、リゾチーム（長瀬産業製）25gを加え、2
4℃に18時間放置した。これに硫安1.32kg,トリトンＸ−
100の10％水溶液500mlを添加して、均一に攪拌した。こ
れにエチレンイミンポリマー水溶液（10％,pH8.0）80ml
を少しづつ添加して、生じた沈殿を濾過して除いた。
結保存してあった生菌体1.1kgを、0.02Mリン酸カリウム
緩衝液（pH8.0）（以下これを標準緩衝液という）50
に分間させて、リゾチーム（長瀬産業製）25gを加え、2
4℃に18時間放置した。これに硫安1.32kg,トリトンＸ−
100の10％水溶液500mlを添加して、均一に攪拌した。こ
れにエチレンイミンポリマー水溶液（10％,pH8.0）80ml
を少しづつ添加して、生じた沈殿を濾過して除いた。
瀘液を、ホローファイバー限外濾過装置（AIL−2011、
旭化成工業株式会社製）によって５まで濃縮した。冷
却した後、硫安1.08kgを加えて溶かし、２時間放置して
生じた沈殿を8,000rpm,20分間遠心分離して除いた。得
られた上澄に更に硫安0.74kgを加えて再び２時間放置し
て生じた沈殿を8,000rpm,20分間遠心分離して集めた。
この沈殿を標準緩衝液１に溶かした。これに硫安140g
を加えて溶かし、あらかじめ硫安14％を含有した標準緩
衝液に平衡化したフェニルセファロースCL−4B（スウェ
ーデン，ファーマシア社製）のカラム（直径13.3cm,高
さ38cm）に通して、酵素を吸着させた。これをエチレン
グリコールの濃度勾配（０→30％）と硫安の逆濃度勾配
（14→０％）を持った標準緩衝液50で溶出した。
旭化成工業株式会社製）によって５まで濃縮した。冷
却した後、硫安1.08kgを加えて溶かし、２時間放置して
生じた沈殿を8,000rpm,20分間遠心分離して除いた。得
られた上澄に更に硫安0.74kgを加えて再び２時間放置し
て生じた沈殿を8,000rpm,20分間遠心分離して集めた。
この沈殿を標準緩衝液１に溶かした。これに硫安140g
を加えて溶かし、あらかじめ硫安14％を含有した標準緩
衝液に平衡化したフェニルセファロースCL−4B（スウェ
ーデン，ファーマシア社製）のカラム（直径13.3cm,高
さ38cm）に通して、酵素を吸着させた。これをエチレン
グリコールの濃度勾配（０→30％）と硫安の逆濃度勾配
（14→０％）を持った標準緩衝液50で溶出した。
活性部分をホローファイバー限外濾過装置で500mlまで
濃縮し、更に0.1Mの塩化カリウムを含有した標準緩衝液
３で透析濾過を行った。これをあらかじめ0.1M塩化カ
リウムを含有した標準緩衝液に平衡化させたDEAE→セフ
ァデックスＡ−50のカラム（直径6cm,高さ35cm）に通し
て酵素を吸着させ、塩化カリウムの濃度勾配（0.1→0.8
M）を持った標準緩衝液10で溶出した。活性部を限外
濾過装置（米国，アミコン社製）で15mlまで濃縮し、こ
のうち2mlをあらかじめ0.1M塩化カリウム含有の標準緩
衝液に平衡化したセファデックスＧ−100カラム（直径
2.5cm,高さ100cm）にかけて、ゲル濾過を行った。活性
部を集めて濃縮した。すべての酵素をゲル濾過した結
果、Ｌ−フコース脱水素酵素34,000単位を得た。これは
第５図に示す通りほとんど単一バンドを示す酵素標品で
あった。
濃縮し、更に0.1Mの塩化カリウムを含有した標準緩衝液
３で透析濾過を行った。これをあらかじめ0.1M塩化カ
リウムを含有した標準緩衝液に平衡化させたDEAE→セフ
ァデックスＡ−50のカラム（直径6cm,高さ35cm）に通し
て酵素を吸着させ、塩化カリウムの濃度勾配（0.1→0.8
M）を持った標準緩衝液10で溶出した。活性部を限外
濾過装置（米国，アミコン社製）で15mlまで濃縮し、こ
のうち2mlをあらかじめ0.1M塩化カリウム含有の標準緩
衝液に平衡化したセファデックスＧ−100カラム（直径
2.5cm,高さ100cm）にかけて、ゲル濾過を行った。活性
部を集めて濃縮した。すべての酵素をゲル濾過した結
果、Ｌ−フコース脱水素酵素34,000単位を得た。これは
第５図に示す通りほとんど単一バンドを示す酵素標品で
あった。
実施例３ 溶液中のＬ−フコースの濃度を下記試料を用いて下記方
法により定量した。
法により定量した。
1.試 薬 0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0） 1.57ml NADP（15mM） 0.065ml Ｌ−FDH（44単位／ml） 0.065ml 試料溶液 0.30ml 2.定量方法 各試薬をそれぞれ所定量試験管にとり、37℃で５分間反
応させ、340nmで吸光度を測定した。同様にして試料溶
液のかわりに水を同量加えて反応させた場合の吸光度を
差し引いて試料溶液の吸光度とした。
応させ、340nmで吸光度を測定した。同様にして試料溶
液のかわりに水を同量加えて反応させた場合の吸光度を
差し引いて試料溶液の吸光度とした。
別に、既知濃度のＬ−フコース溶液を同様にして得た検
量線から試料溶液中のＬ−フコースの濃度を求めた。第
６図にその検量線を示す。
量線から試料溶液中のＬ−フコースの濃度を求めた。第
６図にその検量線を示す。
実施例４ 溶液中のＬ−フコースの濃度を下記の試薬を用いて下記
方法により定量した。
方法により定量した。
1.試 薬 0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）（0.1％トリトンＸ
−100含有） 150μｌ フェナジンメトサルフェート（1mg／ml） ５μｌ ニトロブル−テトラゾリウム（10mg／ml） ５μｌ NADP（15mM） 15μｌ Ｌ−FDH（44単位／ml） 15μｌ 試料溶液 10μｌ 2.定量方法 上記試薬をおのおの所定量試験管にとり、37℃で10分間
反応させた。その後、0.3規定塩酸2.0mlを添加して良く
攪拌した。
−100含有） 150μｌ フェナジンメトサルフェート（1mg／ml） ５μｌ ニトロブル−テトラゾリウム（10mg／ml） ５μｌ NADP（15mM） 15μｌ Ｌ−FDH（44単位／ml） 15μｌ 試料溶液 10μｌ 2.定量方法 上記試薬をおのおの所定量試験管にとり、37℃で10分間
反応させた。その後、0.3規定塩酸2.0mlを添加して良く
攪拌した。
生成した色素を570nmで吸光度を測定した。試料溶液の
かわりに水を同量添加して同様に反応処理したものの吸
光度をブランクとして差し引いた。
かわりに水を同量添加して同様に反応処理したものの吸
光度をブランクとして差し引いた。
別に既知濃度のＬ−フコース溶液を同様にして得た検量
線から試料溶液中のＬ−フコースの濃度を求めた。
線から試料溶液中のＬ−フコースの濃度を求めた。
実施例５ ２′−フコシルラクトース中のＬ−フコースを下記の試
薬を用い、下記の方法により定量した。
薬を用い、下記の方法により定量した。
1.試 薬 0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0） 215μｌ NADP（15mM） 15μｌ Ｌ−FDH（44単位／ml） 60μｌ α−Ｌ−フコシダーゼ（牛上皮由来） （12単位／ml） 100μｌ 2.定量方法 上記試薬を所定量マイクロキュベットにとり、37℃で５
分間保った後、これに２′−フコシルラクトース（シグ
マ社製）の0.3,0.6,0.9および1.2mM溶液10μｌをそれぞ
れ添加した。37℃で15分間反応させた後、これらを340n
mで吸光度を測定した。２′−フコシルラクトース溶液
のかわりに水を同量添加した場合の吸光度をブランクと
して差し引いた結果、添加した２′−フコシルラクトー
スと、340nmの吸光度の増加量には、良好な直線関係が
得られた。
分間保った後、これに２′−フコシルラクトース（シグ
マ社製）の0.3,0.6,0.9および1.2mM溶液10μｌをそれぞ
れ添加した。37℃で15分間反応させた後、これらを340n
mで吸光度を測定した。２′−フコシルラクトース溶液
のかわりに水を同量添加した場合の吸光度をブランクと
して差し引いた結果、添加した２′−フコシルラクトー
スと、340nmの吸光度の増加量には、良好な直線関係が
得られた。
第１図は、本酵素の至適pHを示すグラフであり、第２図
は、安定pHを示すグラフである。 第３図は、本酵素の作用適温の範囲を示すグラフであ
り、第４図は、本酵素の熱安定性を示すグラフである。 第５図は、電気泳動によるバンドを示す図である。 第６図は、実施例３におけるＬ−フコースの検量線であ
る。
は、安定pHを示すグラフである。 第３図は、本酵素の作用適温の範囲を示すグラフであ
り、第４図は、本酵素の熱安定性を示すグラフである。 第５図は、電気泳動によるバンドを示す図である。 第６図は、実施例３におけるＬ−フコースの検量線であ
る。
Claims (1)
- 【請求項１】下記（１）〜（３）の理化学的性質を有す
るＬ−フコースデヒドロゲナーゼ。 （１）作用及び基質特異性 Ｌ−フコースから水素を奪ってＬ−フコノラクトンにす
ると共に補酵素NADPをNADPHに還元する。Ｌ−フコース
（100％）に最も特異性が高く、Ｄ−アラビノース（１
％）にはわずかしか作用せず、また補酵素としてNADP
（100％）を要求し、NAD（１％）に対しては、わずかし
か作用を示さない。 （２）至適pH及び安定pH範囲 トリスーイミダゾール−酢酸ナトリウム緩衝液を用いた
場合、至適pHは9.0〜10.0であり、安定pH範囲は8.0〜1
0.5である。 （３）分子量 0.05Mリン酸カリウム緩衝液（0.1MNaCl含有）を用いて
セファデックスＧ−100カラムによるゲル濾過法により
測定した値は約32,000〜36,000である。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63234745A JPH0667316B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | Ｌ―フコースデヒドロゲナーゼ |
| US07/407,148 US5260197A (en) | 1988-09-21 | 1989-09-14 | L-fucose dehydrogenase, a process for production thereof, quantitative assay for L-fucose using said enzyme and a kit for quantitative assay |
| DE3931377A DE3931377C2 (de) | 1988-09-21 | 1989-09-20 | L-Fucose-Dehydrogenase, Verfahren zu ihrer Herstellung, quantitative Bestimmung von L-Fucose unter Verwendung des genannten Enzyms, sowie Kit für die quantitative Bestimmung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63234745A JPH0667316B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | Ｌ―フコースデヒドロゲナーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0284177A JPH0284177A (ja) | 1990-03-26 |
| JPH0667316B2 true JPH0667316B2 (ja) | 1994-08-31 |
Family
ID=16975692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63234745A Expired - Fee Related JPH0667316B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | Ｌ―フコースデヒドロゲナーゼ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5260197A (ja) |
| JP (1) | JPH0667316B2 (ja) |
| DE (1) | DE3931377C2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7355621B1 (en) | 1998-06-10 | 2008-04-08 | Fernandez Dennis S | Digital television with subscriber conference overlay |
| US6339842B1 (en) | 1998-06-10 | 2002-01-15 | Dennis Sunga Fernandez | Digital television with subscriber conference overlay |
| JP4526654B2 (ja) * | 1999-11-10 | 2010-08-18 | 積水メディカル株式会社 | マンノースの定量法及び定量用試薬 |
| KR101744341B1 (ko) * | 2010-06-15 | 2017-06-09 | 삼성전자주식회사 | ３,６-ｌ-ａｈｇ 전환효소의 활성측정용 조성물, 이를 이용한 ３,６-ｌ-ａｈｇ 전환효소의 활성 측정방법 및 ３,６-ｌ-ａｈｇ의 정량분석용 조성물 |
| CN114739936A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-07-12 | 芝诺(苏州)生物科技有限公司 | 一种酶法快速检测2’-岩藻糖基乳糖的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH064038B2 (ja) * | 1986-01-29 | 1994-01-19 | 宝酒造株式会社 | Ｌ−フコ−スの定量方法 |
-
1988
- 1988-09-21 JP JP63234745A patent/JPH0667316B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-09-14 US US07/407,148 patent/US5260197A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-20 DE DE3931377A patent/DE3931377C2/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９（１１）（１９７５）Ｐ．２２２７−２２３４ |
| Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，５７１（１９７９）Ｐ．１２０−１２６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5260197A (en) | 1993-11-09 |
| JPH0284177A (ja) | 1990-03-26 |
| DE3931377A1 (de) | 1990-03-29 |
| DE3931377C2 (de) | 1997-06-12 |
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