JPH07322898A - アンモニア測定用試薬組成物 - Google Patents
アンモニア測定用試薬組成物Info
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- JPH07322898A JPH07322898A JP7167555A JP16755595A JPH07322898A JP H07322898 A JPH07322898 A JP H07322898A JP 7167555 A JP7167555 A JP 7167555A JP 16755595 A JP16755595 A JP 16755595A JP H07322898 A JPH07322898 A JP H07322898A
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- glutamate dehydrogenase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】活性化剤として必要であったＡＤＰを必要とし
ない、安定性に優れたアンモニア測定用試薬を提供す
る。 【構成】ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡＤＨ依
存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグ
ルタル酸またはその塩、およびＮＡＤＨを含有すること
を特徴とするアンモニア測定用試薬組成物および該試薬
組成物を使用して試料中のアンモニアを測定する方法な
らびに該試薬組成物中にさらにウレアーゼまたはクレア
チニンデイミナーゼを添加した試薬組成物ならびに該試
薬組成物を使用する尿素態窒素またはクレアチニンの測
定方法。 【効果】高価なＮＡＤを必要としない安定性に優れた試
薬組成物が得られる。
ない、安定性に優れたアンモニア測定用試薬を提供す
る。 【構成】ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡＤＨ依
存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグ
ルタル酸またはその塩、およびＮＡＤＨを含有すること
を特徴とするアンモニア測定用試薬組成物および該試薬
組成物を使用して試料中のアンモニアを測定する方法な
らびに該試薬組成物中にさらにウレアーゼまたはクレア
チニンデイミナーゼを添加した試薬組成物ならびに該試
薬組成物を使用する尿素態窒素またはクレアチニンの測
定方法。 【効果】高価なＮＡＤを必要としない安定性に優れた試
薬組成物が得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼを使用する試料中のアンモニアまたは尿素
態窒素ならびにクレアチニンを測定する試薬組成物およ
び該試薬組成物を使用する、これらの測定法に関するも
のである。
ドロゲナーゼを使用する試料中のアンモニアまたは尿素
態窒素ならびにクレアチニンを測定する試薬組成物およ
び該試薬組成物を使用する、これらの測定法に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】グルタミン酸デヒドロゲナーゼは動物、
植物、微生物等に広く存在するが、補酵素特異性により
３種類に分類されている。補酵素としてＮＡＤ+ を要求
する酵素（EC1.4.1.2)は高等植物、細菌、カビ、酵母に
存在し、グルタミン酸の分解に関与している。補酵素と
してＮＡＤ+ とＮＡＤＰ+ を要求する酵素（EC1.4.1.3)
は動物、細菌、カビに存在するがウシ肝由来のものが最
も有名である。また補酵素としてＮＡＤＰ+ を要求する
酵素（EC1.4.1.4)は細菌、酵母、カビに存在し、グルタ
ミン酸の生合成に関与している。
植物、微生物等に広く存在するが、補酵素特異性により
３種類に分類されている。補酵素としてＮＡＤ+ を要求
する酵素（EC1.4.1.2)は高等植物、細菌、カビ、酵母に
存在し、グルタミン酸の分解に関与している。補酵素と
してＮＡＤ+ とＮＡＤＰ+ を要求する酵素（EC1.4.1.3)
は動物、細菌、カビに存在するがウシ肝由来のものが最
も有名である。また補酵素としてＮＡＤＰ+ を要求する
酵素（EC1.4.1.4)は細菌、酵母、カビに存在し、グルタ
ミン酸の生合成に関与している。
【０００３】グルタミン酸デヒドロゲナーゼは酸化的脱
アミノ反応及び還元的アミノ化反応を利用してグルタミ
ン酸、アンモニアの測定に利用できる。また各種の酵素
と共役して尿素態窒素、クレアチニン、ロイシンアミノ
ペプチダーゼ、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミ
ナーゼの測定に使用することが出来る。
アミノ反応及び還元的アミノ化反応を利用してグルタミ
ン酸、アンモニアの測定に利用できる。また各種の酵素
と共役して尿素態窒素、クレアチニン、ロイシンアミノ
ペプチダーゼ、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミ
ナーゼの測定に使用することが出来る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】汎用されているグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼとしてはウシ肝由来のものが挙
げられる。該酵素はＮＡＤ+ とＮＡＤＰ+ が利用できる
酵素(EC1.4.1.3) であるが、活性化剤としてＡＤＰを必
要としている。更に安定性に乏しいことも知られてい
る。またプロテウス（Proteus)属の酵素、酵母由来の酵
素も市販されている。これらはＮＡＤＰ+ 依存性のグル
タミン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.4.1.4) であり、ＮＡＤ
Ｐ+ を利用するため生体試料中のアンモニア等を測定す
る際、夾雑反応が少ない利点がある。しかし、その一
方、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ+ ) はＮＡＤＨ（ＮＡＤ+ ）
に比して高価であるという欠点を持つ。また近年、調製
の手間が不必要な液状試薬が流通しつつあるが、ＮＡＤ
ＰＨは、ＮＡＤＨに比べ液状での安定性が著しく劣るこ
とが知られている。
ミン酸デヒドロゲナーゼとしてはウシ肝由来のものが挙
げられる。該酵素はＮＡＤ+ とＮＡＤＰ+ が利用できる
酵素(EC1.4.1.3) であるが、活性化剤としてＡＤＰを必
要としている。更に安定性に乏しいことも知られてい
る。またプロテウス（Proteus)属の酵素、酵母由来の酵
素も市販されている。これらはＮＡＤＰ+ 依存性のグル
タミン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.4.1.4) であり、ＮＡＤ
Ｐ+ を利用するため生体試料中のアンモニア等を測定す
る際、夾雑反応が少ない利点がある。しかし、その一
方、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ+ ) はＮＡＤＨ（ＮＡＤ+ ）
に比して高価であるという欠点を持つ。また近年、調製
の手間が不必要な液状試薬が流通しつつあるが、ＮＡＤ
ＰＨは、ＮＡＤＨに比べ液状での安定性が著しく劣るこ
とが知られている。
【０００５】上記背景より、ＮＡＤ+ （ＮＡＤＨ）を補
酵素として使用でき、熱安定であり、また試薬溶液中で
安定性が高く、かつ活性化にＡＤＰを必要としないグル
タミン酸デヒドロゲナーゼの開発が望まれていた。
酵素として使用でき、熱安定であり、また試薬溶液中で
安定性が高く、かつ活性化にＡＤＰを必要としないグル
タミン酸デヒドロゲナーゼの開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは従来のグル
タミン酸デヒドロゲナーゼの問題点を解決するため鋭意
研究を重ねた結果、シュードモナス（Pseudomonas)に属
する細菌より新規なグルタミン酸デヒドロゲナーゼを見
い出し、本発明を完成するに至った。
タミン酸デヒドロゲナーゼの問題点を解決するため鋭意
研究を重ねた結果、シュードモナス（Pseudomonas)に属
する細菌より新規なグルタミン酸デヒドロゲナーゼを見
い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち本発明はＡＤＰによる活性化を受
けず、かつＮＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およびＮ
ＡＤＨを含有することを特徴とするアンモニア測定用試
薬組成物である。
けず、かつＮＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およびＮ
ＡＤＨを含有することを特徴とするアンモニア測定用試
薬組成物である。
【０００８】また本発明は試料にＡＤＰによる活性化を
受けず、かつＮＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩およびＮ
ＡＤＨを反応させ、消費されるＮＡＤＨ量を測定するこ
とを特徴とする試料中のアンモニアを測定する方法であ
る。
受けず、かつＮＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩およびＮ
ＡＤＨを反応させ、消費されるＮＡＤＨ量を測定するこ
とを特徴とする試料中のアンモニアを測定する方法であ
る。
【０００９】本発明はウレアーゼ、ＡＤＰによる活性化
を受けず、かつＮＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およ
びＮＡＤＨを含有することを特徴とする尿素態窒素測定
用試薬組成物である。
を受けず、かつＮＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およ
びＮＡＤＨを含有することを特徴とする尿素態窒素測定
用試薬組成物である。
【００１０】また本発明は試料にウレアーゼ、ＡＤＰに
よる活性化を受けず、かつＮＡＤＨ依存性であるグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはそ
の塩およびＮＡＤＨを反応させ、消費されるＮＡＤＨ量
を測定することを特徴とする試料中の尿素態窒素を測定
する方法である。
よる活性化を受けず、かつＮＡＤＨ依存性であるグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはそ
の塩およびＮＡＤＨを反応させ、消費されるＮＡＤＨ量
を測定することを特徴とする試料中の尿素態窒素を測定
する方法である。
【００１１】さらに本発明はクレアチニンデイミナー
ゼ、ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡＤＨ依存性
であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタ
ル酸またはその塩、およびＮＡＤＨを含有することを特
徴とするクレアチニン測定用試薬組成物である。
ゼ、ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡＤＨ依存性
であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタ
ル酸またはその塩、およびＮＡＤＨを含有することを特
徴とするクレアチニン測定用試薬組成物である。
【００１２】また本発明は試料にクレアチニンデイミナ
ーゼ、ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡＤＨ依存
性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグル
タル酸またはその塩およびＮＡＤＨを反応させ、消費さ
れるＮＡＤＨ量を測定することを特徴とする試料中のク
レアチニンを測定する方法である。
ーゼ、ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡＤＨ依存
性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグル
タル酸またはその塩およびＮＡＤＨを反応させ、消費さ
れるＮＡＤＨ量を測定することを特徴とする試料中のク
レアチニンを測定する方法である。
【００１３】本発明に使用するグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼは、下記理化学的性質を有するものである。 （１）次の反応を触媒する
ナーゼは、下記理化学的性質を有するものである。 （１）次の反応を触媒する
【化１３】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分間） （４）ＡＤＰで活性化されない。
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分間） （４）ＡＤＰで活性化されない。
【００１４】本発明に使用する酵素の一例は、下記理化
学的性質を有する。 （１）次の反応を触媒する
学的性質を有する。 （１）次の反応を触媒する
【化１４】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分間） （４）ＡＤＰで活性化されない。 （５）比活性：３００Ｕ／ｍｇ以上 （６）界面活性剤 Ｂｒｉｊで阻害されない。
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分間） （４）ＡＤＰで活性化されない。 （５）比活性：３００Ｕ／ｍｇ以上 （６）界面活性剤 Ｂｒｉｊで阻害されない。
【００１５】本発明に使用する酵素の一例は、下記理化
学的性質を有する。 （１）次の反応を触媒する
学的性質を有する。 （１）次の反応を触媒する
【化１５】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分） （７）分子量：約２８０，０００（ゲル濾過法） 約 ４１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）ＡＤＰで活性化されない。
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分） （７）分子量：約２８０，０００（ゲル濾過法） 約 ４１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）ＡＤＰで活性化されない。
【００１６】本発明に使用する酵素の一例は、下記理化
学的性質を有する。 （１）次の反応を触媒する
学的性質を有する。 （１）次の反応を触媒する
【化１６】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対し特異的であ
る。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、Ｎ
ＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分） （７）分子量：約２８０，０００（ゲル濾過法） 約 ４１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）ＡＤＰで活性化されない。 （９）比活性：３００Ｕ／ｍｇ以上 （１０）界面活性剤 Ｂｒｉｊで阻害されない。
る。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、Ｎ
ＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分） （７）分子量：約２８０，０００（ゲル濾過法） 約 ４１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）ＡＤＰで活性化されない。 （９）比活性：３００Ｕ／ｍｇ以上 （１０）界面活性剤 Ｂｒｉｊで阻害されない。
【００１７】また本発明に使用するグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼは、シュードモナス(Pseudomonas) 属に属
し、上記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ生産能を有する菌株を栄養培地にて培養し、該培
養物からグルタミン酸デヒドロゲナーゼを採取する。
ロゲナーゼは、シュードモナス(Pseudomonas) 属に属
し、上記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ生産能を有する菌株を栄養培地にて培養し、該培
養物からグルタミン酸デヒドロゲナーゼを採取する。
【００１８】本発明に使用するグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼの起源は、上記性質を有するグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼを産生しうるものであれば、動物、植物、微
生物など如何なる起源のものを用いてもよい。好ましく
は上記性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼを産
生しうるシュードモナス(Pseudomonas) 属細菌であっ
て、さらに好適な例としてシュードモナス・エスピー
（Pseudomonas sp.)433-3が挙げられる。
ナーゼの起源は、上記性質を有するグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼを産生しうるものであれば、動物、植物、微
生物など如何なる起源のものを用いてもよい。好ましく
は上記性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼを産
生しうるシュードモナス(Pseudomonas) 属細菌であっ
て、さらに好適な例としてシュードモナス・エスピー
（Pseudomonas sp.)433-3が挙げられる。
【００１９】本発明において使用したシュードモナス・
エスピー（Pseudomonas sp.)433-3は、本発明者らが岐
阜県不破郡関ヶ原町の土壌より分離した株であり、その
菌学的性質は以下の通りである。 （ａ）形態 （１）菌形：短かん菌 （２）細胞の大きさ：０．７〜１．０ × ０．３μｍ （３）細胞の多形性：なし （４）運動性：有り、極鞭毛を有する。 （５）胞子の有無：なし （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天培地：３０℃、４８時間培養で黄色から
オレンジ色のコロニーを形成するコロニーの周縁は破片
状（Labarlobulate)で有り、凸状（Convex）である表面
は粗面（rough)でロウ質状光沢を有し透明である。 （２）肉汁液体培養：生育は良好で一様に混濁する沈さ
が少しある。 （３）肉汁ゼラチン培養：生育は良好で上部のみ糸状
（Filiform）に生育する。ゼラチンは、液化しない。 （４）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは分解
される。 （５）マッコンキー寒天培地：生育しない。 （６）フェニルエチルアルコール寒天培地：生育しな
い。
エスピー（Pseudomonas sp.)433-3は、本発明者らが岐
阜県不破郡関ヶ原町の土壌より分離した株であり、その
菌学的性質は以下の通りである。 （ａ）形態 （１）菌形：短かん菌 （２）細胞の大きさ：０．７〜１．０ × ０．３μｍ （３）細胞の多形性：なし （４）運動性：有り、極鞭毛を有する。 （５）胞子の有無：なし （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天培地：３０℃、４８時間培養で黄色から
オレンジ色のコロニーを形成するコロニーの周縁は破片
状（Labarlobulate)で有り、凸状（Convex）である表面
は粗面（rough)でロウ質状光沢を有し透明である。 （２）肉汁液体培養：生育は良好で一様に混濁する沈さ
が少しある。 （３）肉汁ゼラチン培養：生育は良好で上部のみ糸状
（Filiform）に生育する。ゼラチンは、液化しない。 （４）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは分解
される。 （５）マッコンキー寒天培地：生育しない。 （６）フェニルエチルアルコール寒天培地：生育しな
い。
【００２０】（ｃ）生理学的性質 （１）グラム染色性 − （２）硝酸縁の還元 − （３）脱窒反応 − （４）ＭＲテスト − （５）ＶＰテスト − （６）インドールの生成 − （７）硫化水素の生成 − （８）デンプンの加水分解 ＋ （９）Tween ８０の分解 − （１０）クエン酸の利用 Koserの培地 − Christe
nsenの培地 − （１１）色素の生成 細胞内に黄色色素生成。 （１２）ウレアーゼ − （１３）オキシダーゼ − （１４）カタラーゼ ＋ （１５）βーガラクトシラーゼ ＋ （１６）アルギニンジヒドロラーゼ − （１７）リジンカルボキシラーゼ − （１８）オルニチンカルボキシラーゼ − （１９）トリプトファンデアミナーゼ − （２０）βーグルコシラーゼ ＋ （２１）プロテアーゼ − （２２）デオキシリボヌクレアーゼ −
nsenの培地 − （１１）色素の生成 細胞内に黄色色素生成。 （１２）ウレアーゼ − （１３）オキシダーゼ − （１４）カタラーゼ ＋ （１５）βーガラクトシラーゼ ＋ （１６）アルギニンジヒドロラーゼ − （１７）リジンカルボキシラーゼ − （１８）オルニチンカルボキシラーゼ − （１９）トリプトファンデアミナーゼ − （２０）βーグルコシラーゼ ＋ （２１）プロテアーゼ − （２２）デオキシリボヌクレアーゼ −
【００２１】 （２４）無機Ｎ源の利用（Ｃ源グルコース） グルタミン酸 ＋ 硝酸ナトリウム ＋ 硫酸アンモニウム ＋ （２５）酸素に対する態度 好気性 （２６）Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法） Ｏ（酸化）
【００２２】（２８）有機化合物の利用 Ｄ−グルコース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄーマンニトール − ＮーアセチルーＤーグルコサミン ＋ マルトース ＋ グルコン酸カリウム − Ｎーカプリン酸塩 − アジピン酸 − ＤＬ−リンゴ酸 − クエン酸ナトリウム − 酢酸フェニル −
【００２３】上記菌学的性質同定のための実験法は、主
として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」
学会出版センター（1985年）によって行った。また分類
同定の基準として「バージエーズ・マニュアル・オブ・
システマチック・バクテリオロジー」(1984)および「イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・システマチック
・バクテリオロジー」Vol.27(2)p133-146(1977) を参考
にした。
として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」
学会出版センター（1985年）によって行った。また分類
同定の基準として「バージエーズ・マニュアル・オブ・
システマチック・バクテリオロジー」(1984)および「イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・システマチック
・バクテリオロジー」Vol.27(2)p133-146(1977) を参考
にした。
【００２４】上記文献および菌学的性質から、本菌はシ
ュードモナス属に属するとみなされた。更にシュードモ
ナス属菌中ではPseudomonas paucimobilisの性質と一致
した点が多かったが、デオキシリボヌクレアーゼ産生お
よびTween80 の分解が観察されず、上記菌とは異なり、
シュードモナス・エスピー（Psuedomonas sp.)433-3と
命名した（ＦＥＲＭＰ−１４０９２）。
ュードモナス属に属するとみなされた。更にシュードモ
ナス属菌中ではPseudomonas paucimobilisの性質と一致
した点が多かったが、デオキシリボヌクレアーゼ産生お
よびTween80 の分解が観察されず、上記菌とは異なり、
シュードモナス・エスピー（Psuedomonas sp.)433-3と
命名した（ＦＥＲＭＰ−１４０９２）。
【００２５】本発明に使用するグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼを製造するにあたっては、上記性質を有するグル
タミン酸デヒドロゲナーゼの生産菌を栄養培地にて培養
し、該培養物から該酵素を採取する。
ナーゼを製造するにあたっては、上記性質を有するグル
タミン酸デヒドロゲナーゼの生産菌を栄養培地にて培養
し、該培養物から該酵素を採取する。
【００２６】グルタミン酸デヒドロゲナーゼ生産菌の培
養に当たって使用する培地としては、使用菌株が資化し
うる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適
量含有するもであれば、合成培地、天然培地いずれも使
用できる。炭素源としては例えばグルコース、グリセロ
ール等が使用される。窒素源としては例えばペプトン
類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化
アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有
化合物が使用される。無機物としてはリン酸カリウム、
リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。
養に当たって使用する培地としては、使用菌株が資化し
うる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適
量含有するもであれば、合成培地、天然培地いずれも使
用できる。炭素源としては例えばグルコース、グリセロ
ール等が使用される。窒素源としては例えばペプトン
類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化
アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有
化合物が使用される。無機物としてはリン酸カリウム、
リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。
【００２７】またグルタミン酸デヒドロゲナーゼの生産
誘導物質として、グルタミン酸ナトリウムを培地に添加
しておくことが望ましい。培養は通常、振盪培養あるい
は通気撹拌培養で行う。培養温度は２０〜３０℃、好ま
しくは２５〜３０℃、培養ｐＨは６〜９の範囲で、好ま
しくはｐＨ７〜８に制御するのが良い。培養期間は通常
１〜３日で生育し、菌体内にグルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼが生産蓄積される。
誘導物質として、グルタミン酸ナトリウムを培地に添加
しておくことが望ましい。培養は通常、振盪培養あるい
は通気撹拌培養で行う。培養温度は２０〜３０℃、好ま
しくは２５〜３０℃、培養ｐＨは６〜９の範囲で、好ま
しくはｐＨ７〜８に制御するのが良い。培養期間は通常
１〜３日で生育し、菌体内にグルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼが生産蓄積される。
【００２８】本発明に使用する酵素の精製法は一般に使
用される精製法を用いれば良い。例えば、抽出法には超
音波破砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレン
チプレスなどいずれを用いても良い。さらに抽出液につ
いては、硫安などの塩析法、ポリエチレンイミンなどの
凝集法、さらにはＤＥＡＥ−セファロース、ＣＭ（カル
ボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマ
ト法などにより精製することができる。またこれらの方
法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えばスプレー
ドライや凍結乾燥により粉末化できる。
用される精製法を用いれば良い。例えば、抽出法には超
音波破砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレン
チプレスなどいずれを用いても良い。さらに抽出液につ
いては、硫安などの塩析法、ポリエチレンイミンなどの
凝集法、さらにはＤＥＡＥ−セファロース、ＣＭ（カル
ボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマ
ト法などにより精製することができる。またこれらの方
法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えばスプレー
ドライや凍結乾燥により粉末化できる。
【００２９】次に本発明のグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼの活性測定法（還元的アミノ化反応）を示す。下記の
反応混液を調製する。 ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３） ２５ｍｌ ３．３Ｍ ＮＨ4 Ｃｌ溶液 ２ｍｌ ０．２２５Ｍ αーケトグルタル酸溶液 １ｍｌ ７．５ｍＭ ＮＡＤＨ溶液 １ｍｌ 上記反応混液２．９ｍｌをキュベットにとり、３０℃で
約５分間予備加温する。次いで酵素溶液０．１ｍｌを加
えて反応を開始し、３７℃に制御された分光光度計で３
４０ｎｍの吸光度変化を３〜４分間記録し、その直線部
分から１分間当りの吸光度変化を求める。盲検は酵素液
の代わりに、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．３）を加え、上記同様に操作を行う。グルタミン酸
デヒドロゲナーゼの活性の表示は、上記条件下で１分間
に１μモルのＮＡＤＨが酸化される酵素量を１単位
（Ｕ）とする。
ゼの活性測定法（還元的アミノ化反応）を示す。下記の
反応混液を調製する。 ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３） ２５ｍｌ ３．３Ｍ ＮＨ4 Ｃｌ溶液 ２ｍｌ ０．２２５Ｍ αーケトグルタル酸溶液 １ｍｌ ７．５ｍＭ ＮＡＤＨ溶液 １ｍｌ 上記反応混液２．９ｍｌをキュベットにとり、３０℃で
約５分間予備加温する。次いで酵素溶液０．１ｍｌを加
えて反応を開始し、３７℃に制御された分光光度計で３
４０ｎｍの吸光度変化を３〜４分間記録し、その直線部
分から１分間当りの吸光度変化を求める。盲検は酵素液
の代わりに、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．３）を加え、上記同様に操作を行う。グルタミン酸
デヒドロゲナーゼの活性の表示は、上記条件下で１分間
に１μモルのＮＡＤＨが酸化される酵素量を１単位
（Ｕ）とする。
【００３０】本発明のアンモニア測定用試薬組成物中、
各成分の好ましい量はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ約
０．５〜１００Ｕ／ｍｌ、α−ケトグルタル酸１〜５０
ｍＭ、ＮＡＤＨ０．１〜１ｍＭである。
各成分の好ましい量はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ約
０．５〜１００Ｕ／ｍｌ、α−ケトグルタル酸１〜５０
ｍＭ、ＮＡＤＨ０．１〜１ｍＭである。
【００３１】試料中のアンモニアは、該試料に上記グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸、ＮＡ
ＤＨを含む試薬組成物を作用させ、消費されるＮＡＤＨ
の吸光度を測定することにより測定する。
タミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸、ＮＡ
ＤＨを含む試薬組成物を作用させ、消費されるＮＡＤＨ
の吸光度を測定することにより測定する。
【００３２】本発明の試料中の尿素態窒素の測定法は、
試料にウレアーゼを作用させ、生成するアンモニアに上
記グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル
酸、ＮＡＤＨを作用させ、消費されるＮＡＤＨを測定す
る。
試料にウレアーゼを作用させ、生成するアンモニアに上
記グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル
酸、ＮＡＤＨを作用させ、消費されるＮＡＤＨを測定す
る。
【００３３】本発明の尿素態窒素測定用試薬組成物は、
ウレアーゼ、ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡＤ
Ｈ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケ
トグルタル酸またはその塩、およびＮＡＤＨを含有す
る。
ウレアーゼ、ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡＤ
Ｈ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケ
トグルタル酸またはその塩、およびＮＡＤＨを含有す
る。
【００３４】本発明に使用するウレアーゼとしては、ナ
タマメ起源の酵素が一般的であり、市販されている。
タマメ起源の酵素が一般的であり、市販されている。
【００３５】本発明の尿素態窒素測定用試薬組成物中、
各成分の好ましい量はウレアーゼ約１〜３０Ｕ／ｍｌ、
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ約０．５〜１００Ｕ／ｍ
ｌ、α−ケトグルタル酸１〜５０ｍＭ、ＮＡＤＨ約０．
１〜１ｍＭである。
各成分の好ましい量はウレアーゼ約１〜３０Ｕ／ｍｌ、
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ約０．５〜１００Ｕ／ｍ
ｌ、α−ケトグルタル酸１〜５０ｍＭ、ＮＡＤＨ約０．
１〜１ｍＭである。
【００３６】また本発明のクレアチニン定量法は、試料
にクレアチニンデイミナーゼを作用させ、生成するアン
モニアにグルタル酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタ
ル酸、ＮＡＤＨを作用させ、消費されるＮＡＤＨを測定
する。
にクレアチニンデイミナーゼを作用させ、生成するアン
モニアにグルタル酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタ
ル酸、ＮＡＤＨを作用させ、消費されるＮＡＤＨを測定
する。
【００３７】本発明に使用するクレアチニンデイミナー
ゼとしては、バチルス属、コリネバクテリウム属の微生
物から生産されるものがある。
ゼとしては、バチルス属、コリネバクテリウム属の微生
物から生産されるものがある。
【００３８】本発明のクレアチニン測定用試薬中、各成
分の好ましい量はクレアチニンデイミナーゼ約０．５〜
１０Ｕ／ｍｌ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ約０．５
〜１００Ｕ／ｍｌ、α−ケトグルタル酸約１〜５０ｍ
Ｍ、ＮＡＤＨ約０．１〜１ｍＭである。
分の好ましい量はクレアチニンデイミナーゼ約０．５〜
１０Ｕ／ｍｌ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ約０．５
〜１００Ｕ／ｍｌ、α−ケトグルタル酸約１〜５０ｍ
Ｍ、ＮＡＤＨ約０．１〜１ｍＭである。
【００３９】本発明のアンモニア測定用試薬組成物また
は尿素態窒素測定用試薬組成物またはクレアチニン測定
用試薬組成物は、通常、ｐＨ約７〜１０の緩衝液ととも
に使用する。例えばトリス塩酸緩衝液、トリスエタノー
ルアミン塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
は尿素態窒素測定用試薬組成物またはクレアチニン測定
用試薬組成物は、通常、ｐＨ約７〜１０の緩衝液ととも
に使用する。例えばトリス塩酸緩衝液、トリスエタノー
ルアミン塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
【００４０】本発明の尿素態窒素測定用試薬組成物およ
びクレアチニン測定用試薬組成物には必要によりアンモ
ニア消去用試薬を添加しても良い。このような試薬とし
てイソクエン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼまたは
ＡＴＰ、グルタミン酸、グルタミン酸合成酵素等が挙げ
られる。更に本発明の試薬組成物には酵素反応を円滑に
行わせるために他の化合物を添加しても良い。このよう
な化合物として例えば安定化剤、界面活性化剤、賦形剤
等が挙げられる。
びクレアチニン測定用試薬組成物には必要によりアンモ
ニア消去用試薬を添加しても良い。このような試薬とし
てイソクエン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼまたは
ＡＴＰ、グルタミン酸、グルタミン酸合成酵素等が挙げ
られる。更に本発明の試薬組成物には酵素反応を円滑に
行わせるために他の化合物を添加しても良い。このよう
な化合物として例えば安定化剤、界面活性化剤、賦形剤
等が挙げられる。
【００４１】ＮＡＤＨの測定は、通常、３４０ｎｍの波
長で吸光度測定で行うが、副波長を用いても良い。更に
は３４０ｎｍを含む２波長で測定しても良い。アンモニ
ア測定、尿素態窒素およびクレアチニン測定ともに、エ
ンド法およびレート法のいずれかで行われる。本発明の
アンモニア測定法は、生体試料中の尿素態窒素またはク
レアチニンに限らず、他の成分に由来するアンモニアを
測定する方法も包含する。
長で吸光度測定で行うが、副波長を用いても良い。更に
は３４０ｎｍを含む２波長で測定しても良い。アンモニ
ア測定、尿素態窒素およびクレアチニン測定ともに、エ
ンド法およびレート法のいずれかで行われる。本発明の
アンモニア測定法は、生体試料中の尿素態窒素またはク
レアチニンに限らず、他の成分に由来するアンモニアを
測定する方法も包含する。
【００４２】
【発明の効果】本発明の試薬組成物は従来のグルタミン
酸デヒドロゲナーゼが必要であったＡＤＰを必要とせ
ず、しかも高価なＮＡＤをも必要としない。しかも長期
保存安定性に優れたアンモニア測定用試薬組成物、尿素
態窒素測定用試薬組成物およびクレアチニン測定用試薬
組成物が得られる。液状化試薬が広まりつつある現在、
このように液状で安定な試薬は非常に有用である。
酸デヒドロゲナーゼが必要であったＡＤＰを必要とせ
ず、しかも高価なＮＡＤをも必要としない。しかも長期
保存安定性に優れたアンモニア測定用試薬組成物、尿素
態窒素測定用試薬組成物およびクレアチニン測定用試薬
組成物が得られる。液状化試薬が広まりつつある現在、
このように液状で安定な試薬は非常に有用である。
【００４３】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示
す。参考例１ グルタミン酸ナトリウム０．６％、ポリペプトン１％、
酵母エキス１％、グリセロール１％を含む培地（ｐＨ
７．０）を６０ｍｌ分注し、殺菌（１２１℃、１５ｍｉ
ｎ）した５００ｍｌ容坂口フラスコに、Pseudomonas s
p.433-3(FERMP-14092) を接種し、３０℃で１日培養し
たものを種培養液とした。次に同培地６リットルを１０
リットル容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で１
５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液６０ｍ
ｌを移し、３００ｒｐｍ、通気量２リットル／分、３０
℃で２４時間培養した。培養終了後、培養液を集菌し、
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁
した。
す。参考例１ グルタミン酸ナトリウム０．６％、ポリペプトン１％、
酵母エキス１％、グリセロール１％を含む培地（ｐＨ
７．０）を６０ｍｌ分注し、殺菌（１２１℃、１５ｍｉ
ｎ）した５００ｍｌ容坂口フラスコに、Pseudomonas s
p.433-3(FERMP-14092) を接種し、３０℃で１日培養し
たものを種培養液とした。次に同培地６リットルを１０
リットル容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で１
５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液６０ｍ
ｌを移し、３００ｒｐｍ、通気量２リットル／分、３０
℃で２４時間培養した。培養終了後、培養液を集菌し、
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁
した。
【００４４】懸濁液をフレンチプレスで処理し、遠心分
離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分
画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー、フェ
ニルセファロースクロマトグラフィー、セファデックス
Ｇ−２００によるゲル濾過により比活性３００Ｕ／ｍｇ
にまで精製した。
離を行い、上清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分
画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー、フェ
ニルセファロースクロマトグラフィー、セファデックス
Ｇ−２００によるゲル濾過により比活性３００Ｕ／ｍｇ
にまで精製した。
【００４５】得られたグルタミン酸デヒドロゲナーゼは
下記特性を有していた。 （１）下記の反応を触媒した。
下記特性を有していた。 （１）下記の反応を触媒した。
【００４６】
【化１７】
【００４７】（２）基質特異性 各種のアミノ酸を基質とした時の酵素活性を測定した。
Ｌ−グルタミン酸に対する活性値を１００として表１に
記載した。活性測定は以下の方法により行った。下記反
応溶液を調製した。 ０．２Ｍ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０） １３ｍｌ ０．５Ｍ 各種アミノ酸 ６ｍｌ ９ｍＭ ＮＡＤ+ ２ｍｌ Ｈ2 ０ ８ｍｌ 上記反応溶液２．９ｍｌをキュベットにとり、３０℃で
約５分間予備加温した。酵素溶液０．１ｍｌを加え反応
を開始し、３７℃に制御された分光光度計で３４０ｎｍ
の吸光度変化を３〜４分間記録し、その直線部分から１
分間当りの吸光度変化を求めた。盲検は酵素液の代わり
に、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を
加え、上記同様に操作を行った。
Ｌ−グルタミン酸に対する活性値を１００として表１に
記載した。活性測定は以下の方法により行った。下記反
応溶液を調製した。 ０．２Ｍ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０） １３ｍｌ ０．５Ｍ 各種アミノ酸 ６ｍｌ ９ｍＭ ＮＡＤ+ ２ｍｌ Ｈ2 ０ ８ｍｌ 上記反応溶液２．９ｍｌをキュベットにとり、３０℃で
約５分間予備加温した。酵素溶液０．１ｍｌを加え反応
を開始し、３７℃に制御された分光光度計で３４０ｎｍ
の吸光度変化を３〜４分間記録し、その直線部分から１
分間当りの吸光度変化を求めた。盲検は酵素液の代わり
に、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を
加え、上記同様に操作を行った。
【００４８】
【表１】
【００４９】（３）Ｋｍ値 アンモニアに対するＫｍ値は、8.5mM であった。またＮ
ＡＤＨ、L-グルタミン酸、ＮＡＤ+ に対するＫｍ値は：
それぞれ0.19mM、17mM、0.10mMであった。
ＡＤＨ、L-グルタミン酸、ＮＡＤ+ に対するＫｍ値は：
それぞれ0.19mM、17mM、0.10mMであった。
【００５０】（４）至適作用ｐＨ 本発明の酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を図１示
す。図１は０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、
０．１ＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５〜１２．
５）中での酵素活性を測定した結果である。図中、○−
○は酸化的脱アミノ反応、●−●は還元的アミノ化反応
を示す。酸化的脱アミノ反応の至適ｐＨは１０．５〜１
１．５であり、還元的アミノ化反応の至適ｐＨは８．０
〜８．５であった。
す。図１は０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、
０．１ＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５〜１２．
５）中での酵素活性を測定した結果である。図中、○−
○は酸化的脱アミノ反応、●−●は還元的アミノ化反応
を示す。酸化的脱アミノ反応の至適ｐＨは１０．５〜１
１．５であり、還元的アミノ化反応の至適ｐＨは８．０
〜８．５であった。
【００５１】（５）ｐＨ安定性 本発明の酵素のｐＨ安定性を図２に示す。図２は０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、０．１ＭＫ−リン酸緩衝
液（ｐＨ６〜８）、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８
〜１０）で２５℃、２０時間保存しての残存活性を測定
した結果である。安定ｐＨはｐＨ５〜１０であった。
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、０．１ＭＫ−リン酸緩衝
液（ｐＨ６〜８）、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８
〜１０）で２５℃、２０時間保存しての残存活性を測定
した結果である。安定ｐＨはｐＨ５〜１０であった。
【００５２】（６）至適作用温度 本発明の酵素の反応温度と相対活性との関係を図３に示
す。図３は各温度における酵素活性を測定した結果であ
る。図中、○−○酸化的脱アミノ反応、●−●は還元的
アミノ化反応を示す。酸化的脱アミノ反応の至適温度は
約６０℃であり、還元的アミノ化反応の至適温度は約４
５℃であった。
す。図３は各温度における酵素活性を測定した結果であ
る。図中、○−○酸化的脱アミノ反応、●−●は還元的
アミノ化反応を示す。酸化的脱アミノ反応の至適温度は
約６０℃であり、還元的アミノ化反応の至適温度は約４
５℃であった。
【００５３】（７）熱安定性 本発明の酵素の熱安定性を図４に示す。図４は本発明の
酵素を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）中で１
０分間保温した後、残存活性を測定した結果であり、約
６０℃まで安定であった。
酵素を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）中で１
０分間保温した後、残存活性を測定した結果であり、約
６０℃まで安定であった。
【００５４】 （８）分子量 約２８０，０００（ゲルろ過法） サブユニット 約４０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００５５】 （９）等電点 ５．６ （等電点電気泳動）
【００５６】（１０）ＡＤＰによる活性化 本発明のグルタミンデヒドロゲナーゼの活性測定試薬
（還元的アミノ化反応）にＡＤＰを２．５ｍＭになるよ
うに添加し、無添加のものと活性を比較した。
（還元的アミノ化反応）にＡＤＰを２．５ｍＭになるよ
うに添加し、無添加のものと活性を比較した。
【００５７】
【表２】
【００５８】（１１）既知酵素との比較 本発明酵素と既知のＮＡＤ+ 依存性グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ（EC.1.4.1.2）の性質を比較した。
ロゲナーゼ（EC.1.4.1.2）の性質を比較した。
【００５９】
【表３】
【００６０】実施例１ 下記組成を有する試液を調製した。 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Pseudomonas sp.433-3） ０．３Ｕ／ｍｌ ウレアーゼ（東洋紡製） １０Ｕ／ｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＨ ０．３ｍｍｏｌ／ｌ トリトンＸ−１００ ０．１％ トリス塩酸緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ８．５ 上記試液３ｍｌを３７℃、５分間予備加温後、尿素態窒
素１００ｍｇ／ｄｌを１０系列に希釈した試料を０．０
５ｍｌ添加し、３７℃で３分間反応させ３４０ｎｍにお
ける１分間あたりの吸光度の減少を測定した。その結果
は図５に示す通りであり、尿素態窒素１００ｍｇ／ｄｌ
まで直線性を有していた。
素１００ｍｇ／ｄｌを１０系列に希釈した試料を０．０
５ｍｌ添加し、３７℃で３分間反応させ３４０ｎｍにお
ける１分間あたりの吸光度の減少を測定した。その結果
は図５に示す通りであり、尿素態窒素１００ｍｇ／ｄｌ
まで直線性を有していた。
【００６１】実施例２ 実施例１の組成の試液を２５℃、１週間保存して１０系
列に希釈した試料を測定した。その結果は図６に示す通
りであり、２５℃、１週間保存後も尿素態窒素１００ｍ
ｇ／ｄｌまで直線性を有していた。
列に希釈した試料を測定した。その結果は図６に示す通
りであり、２５℃、１週間保存後も尿素態窒素１００ｍ
ｇ／ｄｌまで直線性を有していた。
【００６２】実施例３ 下記組成を有する試液を調製した。 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Pseudomonas sp.433-3由来） ２０Ｕ／ｍｌ クレアチニンデイミナーゼ（東洋紡製） １０Ｕ／ｍｌ α−ケトグルタル酸 １２ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＨ ０．４ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ８．３ 上記試液３ｍｌを３０℃、５分間予備加温後、クレアチ
ン５０ｍｇ／ｄｌを１０系列に希釈した試料を０．１ｍ
ｌ添加し、３０℃で反応させ、３分後の３４０ｎｍにお
ける吸光度より１分後の３４０ｎｍにおける吸光度を減
少した値を求めた。その結果は図７に示す通りであっ
て、クレアチニン５０ｍｇ／ｄｌまで比例関係が成立し
た。
ン５０ｍｇ／ｄｌを１０系列に希釈した試料を０．１ｍ
ｌ添加し、３０℃で反応させ、３分後の３４０ｎｍにお
ける吸光度より１分後の３４０ｎｍにおける吸光度を減
少した値を求めた。その結果は図７に示す通りであっ
て、クレアチニン５０ｍｇ／ｄｌまで比例関係が成立し
た。
【００６３】比較例１ 下記組成を有する試液を調製した。 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（牛肝臓由来） ０．３Ｕ／ｍｌ ウレアーゼ（東洋紡製） １０Ｕ／ｌ α−ケトグルタル酸 １０ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＨ ０．３ｍｍｏｌ／ｌ トリトンＸ−１００ ０．１％ トリス塩酸緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ８．５ 上記試液３ｍｌを３７℃、５分間予備加温後、尿素態窒
素１００ｍｇ／ｄｌを１０系列に希釈した試料を０．０
５ｍｌ添加し、３７℃で３分間反応させ３４０ｎｍにお
ける１分間あたりの吸光度の減少を測定した。その結果
は図８に示す通りであり、尿素態窒素１００ｍｇ／ｄｌ
まで直線性を有していた。
素１００ｍｇ／ｄｌを１０系列に希釈した試料を０．０
５ｍｌ添加し、３７℃で３分間反応させ３４０ｎｍにお
ける１分間あたりの吸光度の減少を測定した。その結果
は図８に示す通りであり、尿素態窒素１００ｍｇ／ｄｌ
まで直線性を有していた。
【００６４】上記の組成の試液を２５℃、１週間保存し
て１０系列に希釈した試料を測定した。その結果は図９
に示す通りであり、２５℃、１週間保存後の直線性は尿
素態窒素６０ｍｇ／ｄｌまでであり、牛肝臓由来の酵素
はＡＤＰなしでは不安定であるためそれ以上で定量性を
有さなかった。
て１０系列に希釈した試料を測定した。その結果は図９
に示す通りであり、２５℃、１週間保存後の直線性は尿
素態窒素６０ｍｇ／ｄｌまでであり、牛肝臓由来の酵素
はＡＤＰなしでは不安定であるためそれ以上で定量性を
有さなかった。
【００６５】実施例４ 下記組成を有する試液を調製した。 α−ケトグルタル酸 ７．６ｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＨ ０．２５ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ ０．８５ｍｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．３ ８５ｍｍｏｌ／ｌ ＮＨ4 Ｃｌ ０．２２Ｍ Ｂｒｉｊ３５ ０．０５％ または Ｂｒｉｊ５８ ０．１％
【００６６】上記試液２．９ｍｌを３０℃、５分間予備
加温後、本発明のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（０．
６Ｕ／ｍｌ）を０．０５ｍｌ添加し、３０℃で３分間反
応させ、３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度の減
少を測定した。その結果を図１０に示す通りであって、
Ｂｒｉｊ３５または５８が影響を及ぼさなかった。
加温後、本発明のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（０．
６Ｕ／ｍｌ）を０．０５ｍｌ添加し、３０℃で３分間反
応させ、３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度の減
少を測定した。その結果を図１０に示す通りであって、
Ｂｒｉｊ３５または５８が影響を及ぼさなかった。
【００６７】比較例として、上記試液（ただしＡＤＰを
１０ｍｍｏｌ／ｌとなるよう添加）２．９ｍｌを３０
℃、５分間予備加温後、牛肝臓由来のグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼを（０．６Ｕ／ｍｌ）０．０５ｍｌ添加
し、３０℃で３分間反応させ、３４０ｎｍにおける１分
間当たりの吸光度変化を測定した。その結果は図１０に
示す通りであって、Ｂｒｉｊ３５で約５０％、Ｂｒｉｊ
５８で４０％活性が阻害された。
１０ｍｍｏｌ／ｌとなるよう添加）２．９ｍｌを３０
℃、５分間予備加温後、牛肝臓由来のグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼを（０．６Ｕ／ｍｌ）０．０５ｍｌ添加
し、３０℃で３分間反応させ、３４０ｎｍにおける１分
間当たりの吸光度変化を測定した。その結果は図１０に
示す通りであって、Ｂｒｉｊ３５で約５０％、Ｂｒｉｊ
５８で４０％活性が阻害された。
【図１】本発明の酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図２】本発明の酵素のｐＨ安定性を示すグラフであ
る。
る。
【図３】本発明の酵素の反応温度と相対活性との関係を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図４】本発明の酵素の熱安定性を示すグラフである。
【図５】尿素態窒素測定用試薬組成物（本発明の酵素を
含む）を使用した尿素態窒素希釈直線性を表すグラフで
ある。
含む）を使用した尿素態窒素希釈直線性を表すグラフで
ある。
【図６】尿素態窒素測定用試薬組成物（本発明の酵素を
含む）を２５℃で１週間保存後に、尿素態窒素希釈直線
性を調べたグラフである。
含む）を２５℃で１週間保存後に、尿素態窒素希釈直線
性を調べたグラフである。
【図７】クレアチニン測定用試薬組成物（本発明の酵素
を含む）を使用したクレアチニン希釈直線性を表すグラ
フである。
を含む）を使用したクレアチニン希釈直線性を表すグラ
フである。
【図８】尿素態窒素測定用試薬組成物（比較酵素を含
む）を使用した尿素態窒素希釈直線性を表すグラフであ
る。
む）を使用した尿素態窒素希釈直線性を表すグラフであ
る。
【図９】尿素態窒素測定用試薬組成物（比較酵素を含
む）を２５℃で１週間保存後に、尿素態窒素希釈直線性
を調べたグラフである。
む）を２５℃で１週間保存後に、尿素態窒素希釈直線性
を調べたグラフである。
【図１０】本発明の酵素に対する界面活性剤 Ｂｒｉｊ
の効果を示すグラフである。
の効果を示すグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内
Claims (24)
- 【請求項１】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡ
ＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−
ケトグルタル酸またはその塩、およびＮＡＤＨを含有す
ることを特徴とするアンモニア測定用試薬組成物。 - 【請求項２】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡ
ＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、下
記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ
である請求項１記載のアンモニア測定用試薬組成物。 （１）次の反応を触媒する 【化１】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分間） （４）ＡＤＰで活性化されない。 - 【請求項３】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡ
ＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、下
記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ
である請求項１記載のアンモニア測定用試薬組成物。 （１）次の反応を触媒する 【化２】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分間） （４）ＡＤＰで活性化されない。 （５）比活性：３００Ｕ／ｍｇ以上 （６）界面活性剤 Ｂｒｉｊで阻害されない。 - 【請求項４】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡ
ＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、下
記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ
である請求項１記載のアンモニア測定用試薬組成物。 （１）次の反応を触媒する 【化３】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分） （７）分子量：約２８０，０００（ゲル濾過法） 約 ４１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）ＡＤＰで活性化されない。 - 【請求項５】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡ
ＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、下
記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ
である請求項１記載のアンモニア測定用試薬組成物。 （１）次の反応を触媒する 【化４】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分） （７）分子量：約２８０，０００（ゲル濾過法） 約 ４１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）ＡＤＰで活性化されない。 （９）比活性：３００Ｕ／ｍｇ以上 （１０）界面活性剤 Ｂｒｉｊで阻害されない。 - 【請求項６】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡ
ＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、シ
ュードモナス属に属する菌株によって生産される酵素で
あることを特徴とする請求項１記載のアンモニア測定用
試薬組成物。 - 【請求項７】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡ
ＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、シ
ュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.）４３３─３
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０９２）によって生産される酵素
であることを特徴とする請求項１記載のアンモニア測定
用試薬組成物。 - 【請求項８】 試料にＡＤＰによる活性化を受けず、か
つＮＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩およびＮＡＤＨを
反応させ、消費されるＮＡＤＨ量を測定することを特徴
とする試料中のアンモニアを測定する方法。 - 【請求項９】 ウレアーゼ、ＡＤＰによる活性化を受け
ず、かつＮＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩、およびＮＡ
ＤＨを含有することを特徴とする尿素態窒素測定用試薬
組成物。 - 【請求項１０】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
下記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼである請求項９記載の試料中の尿素態窒素測定用試薬
組成物。 （１）次の反応を触媒する 【化５】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分間） （４）ＡＤＰで活性化されない。 - 【請求項１１】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
下記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼである請求項９記載の試料中の尿素態窒素測定用試薬
組成物。 （１）次の反応を触媒する 【化６】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分間） （４）ＡＤＰで活性化されない。 （５）比活性：３００Ｕ／ｍｇ以上 （６）界面活性剤 Ｂｒｉｊで阻害されない。 - 【請求項１２】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
下記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼである請求項９記載の尿素態窒素測定用試薬組成物。 （１）次の反応を触媒する 【化７】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分） （７）分子量：約２８０，０００（ゲル濾過法） 約 ４１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）ＡＤＰで活性化されない。 - 【請求項１３】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
下記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼである請求項９記載の尿素態窒素測定用試薬組成物。 （１）次の反応を触媒する 【化８】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分） （７）分子量：約２８０，０００（ゲル濾過法） 約 ４１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）ＡＤＰで活性化されない。 （９）比活性：３００Ｕ／ｍｇ以上 （１０）界面活性剤 Ｂｒｉｊで阻害されない。 - 【請求項１４】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
シュードモナス属に属する菌株によって生産される酵素
であることを特徴とする請求項９記載の尿素態窒素測定
用試薬組成物。 - 【請求項１５】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.）４３３─
３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０９２）によって生産される酵
素であることを特徴とする請求項９記載の尿素態窒素測
定用試薬組成物。 - 【請求項１６】 試料にウレアーゼ、ＡＤＰによる活性
化を受けず、かつＮＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはその塩およ
びＮＡＤＨを反応させ、消費されるＮＡＤＨ量を測定す
ることを特徴とする試料中の尿素態窒素を測定する方
法。 - 【請求項１７】 クレアチニンデイミナーゼ、ＡＤＰに
よる活性化を受けず、かつＮＡＤＨ依存性であるグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸またはそ
の塩、およびＮＡＤＨを含有することを特徴とするクレ
アチニン測定用試薬組成物。 - 【請求項１８】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
下記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼである請求項１７記載のクレアチニン測定用試薬組成
物。 （１）次の反応を触媒する 【化９】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分間） （４）ＡＤＰで活性化されない。 - 【請求項１９】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
下記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼである請求項１７記載のクレアチニン測定用試薬組成
物。 （１）次の反応を触媒する 【化１０】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分間） （４）ＡＤＰで活性化されない。 （５）比活性：３００Ｕ／ｍｇ以上 （６）界面活性剤 Ｂｒｉｊで阻害されない。 - 【請求項２０】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
下記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼである請求項１７記載のクレアチニン測定用試薬組成
物。 （１）次の反応を触媒する 【化１１】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分） （７）分子量：約２８０，０００（ゲル濾過法） 約 ４１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）ＡＤＰで活性化されない。 - 【請求項２１】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
下記理化学的性質を有するグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼである請求項１７記載のクレアチニン測定用試薬組成
物。 （１）次の反応を触媒する 【化１２】 （２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対して特異的で
ある。補酵素としてＮＡＤ+ およびＮＡＤＨを要求し、
ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨには作用しない。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３、１０
分） （７）分子量：約２８０，０００（ゲル濾過法） 約 ４１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （８）ＡＤＰで活性化されない。 （９）比活性：３００Ｕ／ｍｇ以上 （１０）界面活性剤 Ｂｒｉｊで阻害されない。 - 【請求項２２】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
シュードモナス属に属する菌株によって生産される酵素
であることを特徴とする請求項１７記載のクレアチニン
測定用試薬組成物。 - 【請求項２３】 ＡＤＰによる活性化を受けず、かつＮ
ＡＤＨ依存性であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼが、
シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.）４３３─
３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０９２）によって生産される酵
素であることを特徴とする請求項１７記載のクレアチニ
ン測定用試薬組成物。 - 【請求項２４】 試料にクレアチニンデイミナーゼ、Ａ
ＤＰによる活性化を受けず、かつＮＡＤＨ依存性である
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸ま
たはその塩およびＮＡＤＨを反応させ、消費されるＮＡ
ＤＨ量を測定することを特徴とする試料中のクレアチニ
ンを測定する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16755595A JP3156832B2 (ja) | 1994-02-16 | 1995-07-03 | アンモニア測定用試薬組成物 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1944894 | 1994-02-16 | ||
| JP6-19448 | 1994-02-16 | ||
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|---|---|---|---|---|
| CN104807995A (zh) * | 2015-05-13 | 2015-07-29 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种灵敏度高的连续检测法gldh检测试剂 |
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| JP6100627B2 (ja) * | 2013-06-24 | 2017-03-22 | 株式会社パイロットコーポレーション | 熱消色性筆記具インキ組成物及びそれを内蔵した筆記具 |
-
1995
- 1995-07-03 JP JP16755595A patent/JP3156832B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP3156832B2 (ja) | 2001-04-16 |
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