JP2678155B2 - 新規なｎａｄ合成酵素を用いた測定法 - Google Patents
新規なｎａｄ合成酵素を用いた測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なＮＡＤ合成
酵素を用いる測定法に関する。更に詳しく言えば、本発
明は、被検液中のＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよびアン
モニアまたはアンモニウムイオンのいずれか１つを測定
するに当たり、少なくともＭｇ++イオンまたはＭｎ++イ
オンの存在下、下記の式（ａ）の酵素反応を触媒し、Ｍ
ｇ++イオンの存在下、下記の式（ｂ）の酵素反応を触媒
せず、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオンを
基質として利用し、かつ少なくともグルタミンおよびア
スパラギンを基質として利用しないＮＡＤ合成酵素（以
下、本発明ＮＡＤ合成酵素ということがある）を、被検
液に作用せしめ、次いで反応において消費された成分ま
たは生成された成分を測定することを特徴とするＡＴ
Ｐ、デアミド−ＮＡＤおよびアンモニアまたはアンモニ
ウムイオンのいずれか１つの成分を測定する被検液中の
成分の測定法に関する。 【０００２】 【化２】 【０００３】 【従来の技術】従来、ＮＡＤ合成酵素（ＮＡＤ+ ｓｙｎ
ｔｈｅｔａｓｅ）は、ラツト肝臓〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２３３，４９３〜５００（１９５８）〕、ブタ
肝臓〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３６，５２５〜５
３０（１９６１）〕、酵母〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４７，４７９４〜４８０２（１９７２）〕、
Ｅ．ｃｏｌｉ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３６，１
４９４〜１４９７（１９６１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４２，３８５〜３９２（１９６７）〕に夫々そ
の存在が知られている。そして、酵素分類上、 【０００４】 【化３】 【０００５】の反応を触媒するＮＡＤ合成酵素（Ｅ．
Ｃ．６．３．１．５）と 【０００６】 【 】 【０００７】 【化４】 【０００８】の反応を触媒するＮＡＤ合成酵素（Ｅ．
Ｃ．６．８．５．１）に分類されているが、両酵素とも
アミノ供与体としてアンモニア（アンモニウムイオンを
含む）およびＬ−グルタミンを基質として作用し、ＮＡ
Ｄ合成酵素（Ｅ．Ｃ．６．３．１．５）について、
〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３６，１４９４〜１４
９７（１９６１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４
２，３８５〜３９２（１９６７）〕によると、ＮＨ4 +
に対するＫｍ値は６．５×１０-5Ｍ、Ｌ−グルタミンに
対するＫｍ値は１．６×１０-2Ｍと報告されている。 【０００９】また、ＮＡＤ合成酵素（Ｅ．Ｃ．６．３．
５．１）について〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４
７，４７９４〜４８０２（１９７２）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２３３，４９３〜５００（１９５８）〕に
よると、ＮＨ4 + に対するＫｍ値は６．４×１０3 Ｍ、
Ｌ−グルタミンに対するＫｍ値は５×１０-3Ｍと報告さ
れている。両酵素の相違はアザセリンによつて阻害され
るか、否かによつて区別されている。 【００１０】従来より知られたＮＡＤ合成酵素の活性測
定法は、反応により生じたＮＡＤをアルコールデヒドロ
ゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１）で還元し、生じた還元
型ＮＡＤを３４０ｎｍにおける吸光度測定する方法また
は生じたＮＡＤを蛍光法で測定する方法が報告されてい
る。また、本発明者らは、先に従来のＮＡＤ合成酵素
（Ｅ．Ｃ．６．３．１．５およびＥ．Ｃ．６．３．５．
１）を用いて被検液中のＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよ
び、ＮＨ3 、ＧｌｎまたはＡｓｎアミド供与体のいずれ
か１つを測定するに当たり、被検液にＡＴＰ、デアミド
−ＮＡＤ、アミド供与体およびＭｇ++の存在下ＮＡＤ合
成酵素を作用させる主反応を行い、主反応により生じた
ＮＡＤを、ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系と還元
型ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系との組合せによ
る補酵素サイクリング反応を行い、そのサイクリング反
応により消費または生成された成分を定量するとこを特
徴とするＡＴＰ、アミド−ＮＡＤおよびアミド供与体の
いすれか１つを含有する被検液中の成分の測定法を報告
している（特開昭５９−１９８９９５号公報）。 【００１１】 【発明が解決しようとする課題】前述のように従来のＮ
ＡＤ合成酵素は、アミノ供与体としてＬ−グルタミンを
基質として利用するものであり、少なくともＭｇ++イオ
ンまたはＭｎ++イオンの存在下、下記の式（ａ）の酵素
反応を触媒し、Ｍｇ++イオンの存在下、下記の式（ｂ）
の酵素反応を触媒せず、アンモニアおよび／またはアン
モニウムイオンを基質として利用し、かつ少なくともグ
ルタミンおよびアスパラギンを基質として利用しないＮ
ＡＤ合成酵素は知られていなかった。 【００１２】 【化５】 【００１３】また、従来のＮＡＤ合成酵素は前述の如
く、Ｌ−グルタミンにも基質特異性を有するため、Ｌ−
グルタミン共存下でのＮＨ3 の測定が出来ないものであ
った。 【００１４】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述の課
題に鑑み、鋭意研究の結果、大分県別府市田ノ湯町の温
泉水から分離したバチルス属に属する菌株Ｈ−８０４株
が、新規な、少なくともＭｇ++イオンまたはＭｎ++イオ
ンの存在下、下記の式９（ａ）の酵素反応を触媒し、Ｍ
ｇ++イオンの存在下、下記の式９（ｂ）の酵素反応を触
媒せず、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオン
を基質として利用し、かつ少なくともグルタミンおよび
アスパラギンを基質として利用しないＮＡＤ合成酵素を
産生することを見出した。 【００１５】 【化６】 【００１６】すなわち、本発明は、少なくともＭｇ++イ
オンまたはＭｎ++イオンの存在下、下記の式（ａ）の酵
素反応を触媒し、Ｍｇ++イオンの存在下、下記の式
（ｂ）の酵素反応を触媒せず、アンモニアおよび／また
はアンモニウムイオンを基質として利用し、かつ少なく
ともグルタミンおよびアスパラギンを基質として利用し
ないＮＡＤ合成酵素（以下本発明ＮＡＤ合成酵素と云う
ことがある） 【００１７】 【化７】 【００１８】に関し、被検液中のＡＴＰ、デアミド−Ｎ
ＡＤおよびアンモニアまたはアンモニウムイオンのいず
れか１つを測定するに当たり、本発明ＮＡＤ合成酵素を
被検液に作用せしめ、次いで反応において消費された成
分または生成された成分を測定することを特徴とする、
ＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよびアンモニアまたはアン
モニウムイオンのいずれか１つの成分を測定する被検液
中の成分の測定法である。 【００１９】この新規な本発明ＮＡＤ合成酵素生産菌の
菌学的性状は以下の通りである。 ａ．形態的特徴 普通寒天斜面培地を用いて、５０℃で１〜３日間培養し
て顕微鏡観察を行った。 （１）形および配列；端は丸く、まつすぐ又はやや曲つ
た桿菌で単独又は二連鎖を形成する。 （２）大きさ；０．５〜１．０×１．６〜５．５μｍ （３）運動性；周毛で運動する。 （４）芽胞；中央又は端に近いところに形成する。大き
さは０．８〜１．０×１．０×１．５μｍで細胞は膨張
する。 ｂ．各培地における生育状態（５０℃） （１）普通寒天平板培地 灰白色〜淡黄灰白色で半透明であり、線状に生育し、生
育はやや弱く、可溶性色素は産生しない。 （２）普通寒天斜面培地 灰白色〜淡黄灰白色で半透明であり、円形で平らな集落
を形成する。可溶性色素は産生しない。 （３）液体培地 生育良好で一様に混濁し、２〜３日後一部沈澱する。 （４）ＢＣＰミルク 不変である。 ｃ．生理的性質（＋；陽性、−；陰性） グラム染色 ＋ ＫＯＨ反応 − 抗酸性染色 − カプセル形成 − ＯＦテスト（Ｈｕｇｈ＋Ｌｅｉｆｓｏｎ培地） 変化なし ＯＦテスト（変法培地）※※ ０（酸化） 嫌気での生育 − カタラーゼ産生 ＋（弱） オキシダーゼ産生 ＋（弱） ウレアーゼ産生（ＳＳＲ培地） − 〃 （Ｃｈｒｉｓ培地） − レシチナーゼ産生 生育しない ゼラチン分解 ＋ デンプン分解 ＋ カゼイン分解 ＋ エスクリン分解 ＋ アルギニン分解 − セルロース分解 − インドール産生 − 硫化水素産生 ＋（酢酸鉛紙） アセトイン産生 − ＭＲテスト − 硝酸塩の還元 − ＮａＣｌ無添加培地での生育 ＋ ０．１％ＮａＣｌ添加培地での生育 ＋ ０．２５％ＮａＣｌ添加培地での生育 − ６５℃での生育 ＋ ５０℃での生育 ＋ ３７℃での生育 − ｐＨ９．０での生育 − ｐＨ８．０での生育 ＋ ｐＨ５．６での生育 ＋ ｐＨ４．８での生育 − 糖より酸の産生※（ガス非産生） アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース ＋ セロビオース ＋ ヅルシトール − ｍｅｓｏ−エリスリトール − Ｄフラクトース − フコース − Ｄガラクトース ＋ Ｄグルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール − イヌリン − ラクトース ＋ マルトース − Ｄマンニトール ＋ Ｄマンノース ＋ メレジトース ＋ メリビオース ＋ ラフイノース ＋ ラムノース − Ｄリボース ＋ サリシン − Ｌソルボース − ソルビトール − デンプン ＋ サツカロース ＋ トレハロース ＋ Ｄキシロース ※基礎培地 糖加アンモニウム培地（ＡＳＳ） （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 １．０ｇ ＫＣｌ ０．２ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ 酵母抽出物 １．０ｇ アガロース ３．０ｇ ＢＴＢ ０．０２ｇ 蒸留水 １０００ｍｌ ｐＨ ７．０ ※※変法培地 上記基礎培地に１０．０ｇグルコースを添加した培地 利用性テスト（Ｓｉｍｍｏｎｓ培地） クエン酸塩 − マロン酸塩 − グルコン酸塩 − プロピオン酸塩 − マレイン酸塩 − コハク酸塩 − リンゴ酸塩 ＋ 利用性テスト（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｅｓｅｎ培地） クエン酸塩 − マロン酸塩 − グルコン酸塩 ＋ プロピオン酸塩 − マレイン酸塩 − コハク酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ 上記の菌学的性質から、本Ｈ−８０４菌株は、端の丸
い、まっすぐまたはやや曲がつた桿菌で、グラム陽性、
大きさは０．５〜１．０×１．６×５．５μｍで芽胞を
形成する高温性細菌で、カタラーゼ及びオキシダーゼ産
生能が弱陽性で、非運動性、糖（グルコース）を酸化的
に分解する細菌であるとの特徴を有する。このような諸
性状を有する本菌の分類学上の位置をＢｅｒｇｙ’ｓ・
Ｍａｎｕａｌ ８版、１９７４、医学細菌同定の手引き
２版、１９７４およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｈａｎ
ｄ ｂｏｏｋ、４２７、Ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓを参照して検討すると、本菌は芽胞を形成し、
好気条件で生育できることからバチルス属に属するもの
と判定される。 【００２０】そこで、バチルス属に属する高（好）温性
・耐温性の菌種として、バチルス・ズブチリス、バチル
ス・コアギユランス、バチルス・リケニホルミス、バチ
ルス・ブレビスおよびバチルス・ステアロサーモフイラ
スが挙げられるが、本菌の最低生育温度が３０℃以上で
あることから、（Ａ）バチルス・ステアロサーモフイラ
スおよび（Ｂ）バチルス・ブレビスが挙げられる。これ
らの性状を比較対比すると次の通りである。〔＋；陽
性、−；陰性、ｄ；菌株によつて異なる〕。 【００２１】 本菌 （Ａ） （Ｂ） 菌の大きさ（μｍ） 巾 ０．５〜１．０ ０．５〜０．１ ０．６〜０．９ 長さ １．６〜５．５ ２．０〜３．５ １．５〜４．０ グラム染色 ＋（易脱色） 不定 不定 胞子形成 ＋ ＋ ＋ 胞子による菌体の膨張 ＋ ＋ ＋ 運動性 − ＋ ＋ カタラーゼ産生 （＋） ＋ ＋ 嫌気下での生育 − − − アセトイン産生 − − − 生育温度 最高（℃） ６５以上 ６５〜７５ ４０〜６０ 最低（℃） ３７以上 ３０〜４５ １０〜３５ ｐＨ５．７での生育 ＋ − ｄ ５％ＮａＣｌ添加培地 − ｄ − での生育 糖よりの産生 グルコース ＋ ＋ ＋ アラビノース ＋ ｄ − キシロース ＋ ｄ − マンニツト ＋ ｄ ｄ 糖よりのガスの産生 − − − デンプン分解 ＋ ＋ ｄ クエン酸塩の利用 − − ｄ 硝酸塩の還元 − ｄ ｄ インドール産生 − − − カゼイン分解 ＋ ｄ ＋ 以上の比較対比から、本菌株はバチルス・ステアロサー
モフイラスとよく一致しており、運動性について容易に
非運動性の株が得られることが報告されており、その他
の諸性状について比較検討した結果でもバチルス・ステ
アロサーモフイラスとよく一致した。よって本Ｈ−８０
４菌株をバチルス・ステアロサーモフイラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｈ
−８０４と同定命名した。なお、本菌株は工業技術院微
生物生命工学工業技術院研究所に「微工研菌寄第８８３
９号（ＦＥＲＭ Ｐ−８８３９）、微工研菌寄第１４０
８号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４０８）」として寄託されて
いる。 【００２２】本発明においては、バチルス属に属する本
発明ＮＡＤ合成酵素生産菌としては、上記のバチルス・
ステアロサーモフイラスＨ−８０４はその一例であつ
て、この菌株に限らず、本発明ＮＡＤ合成酵素を生産す
る菌はすべて本発明において使用できる。また、本発明
ＮＡＤ合成酵素を産生する菌より遺伝子操作により本発
明ＮＡＤ合成酵素の遺伝情報を担うＤＮＡを分離し、本
発明ＮＡＤ合成酵素非産生菌にそのＤＮＡを組み込み、
本発明ＮＡＤ合成酵素生産能を発現せしめるように変異
された変異株を得ることが出来、該変異株より産生され
た本発明ＮＡＤ合成酵素、及び該酵素を用いた被検液中
の成分の測定法も本発明に含まれるものである。 【００２３】本発明は、本発明ＮＡＤ合成酵素生産菌を
生産する通常の方法で培養される。培養の形態は、液体
培養でも固体培養でもよいが、工業的には深部通気攪拌
培養を行うのが望ましい。培地の栄養源とては微生物の
培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源
としては同化可能な炭素化合物であればよく、例えばブ
ドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、スターチ、デキストリ
ン、糖密、廃糖密、グリセリンなどが挙げられる。窒素
源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例え
ばコーンスチープリカー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテ
ン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分
解物、硫酸アンモニウムなどが使用される。その他リン
酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウ
ム、亜鉛、鉄、マンガン、ハロゲンなどの塩類が必要に
応じて使用される。、バチルス・ステアロサーモフイラ
アスＨ−８０４においては培養温度は、本発明ＮＡＤ合
成酵素生産菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適宜
変更し得るが、４８〜７０℃、特に５５〜６０℃が好ま
しい。培養時間は培養条件によつて異なるが、本酵素が
最高力価に達する時期を見計らつて適当な時期に培養を
終了すればよく、１０〜２０時間が好ましかつた。通気
攪拌する場合には、２００〜４００ｒ．ｐ．ｍ．の条件
下で充分である。 【００２４】このようにして得られたＮＡＤ合成酵素生
産菌の培養物から本発明ＮＡＤ合成酵素を採取するので
あるが、本酵素は主にその菌体内に含有されるので、得
られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により集
菌し、この菌体を超音波処理、フレンチプレス処理やガ
ラスビース処理などの機械的破壊処理手段やリゾチーム
などの酵素的破壊手段にて破壊し、また必要に応じてト
リトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００：商品
名）、アデカトールＳＯ−１２０（商品名）などの界面
活性剤を添加してもよい。こうして得られたＮＡＤ合成
酵素含有液は、濃縮するか、または濃縮することなく可
溶性塩類、例えば硫安などを用いて塩析するするか、親
水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセト
ン、イソプロパノールなどを用いて本酵素を沈澱させれ
よい。 【００２５】この沈澱物は、水または緩衝液に溶解後、
必要に応じて半透膜にて透析し、さらにＤＥＡＥ−セフ
アデツクス、ＤＥＡＥ−セフアロースやＤＥＡＥ−セル
ロースなどやカルボキメチル−セルロース、カルボキシ
メチル−セフアロース、カルボキシメチル−セフアデツ
クスなどのイオン交換樹脂を用いるクロマトグラフイー
やセフアデツクスＧ２００、セフアロースＣＬ−６Ｂ、
セフアクリルＳ−２００などの分子篩剤などのゲル濾過
剤を用いるクロマトグラフイーにて精製せしめ、その後
必要に応じて安定化剤を添加し、凍結乾燥などの処理に
より精製された本酵素を得ることができる。 【００２６】次に、本発明で得た本発明ＮＡＤ合成酵素
の性質について述べる。 （１）分子量；約５００００〔ポリビニルゲル（商品
名：ＧＰＣ３０００ＳＷ；東洋曹達社製）のカラム
（７．５ｍｍＩＤ×６０ｃｍ）を用い、標準蛋白質とし
て、アルドラーゼ（ウサギ筋肉、Ｎ．Ｗ．１５０，００
０）、牛血清アルブミン（Ｍ．Ｗ．６７，０００）、オ
ボアルブミン（ニワトリ卵：Ｍ．Ｗ．４５，０００）、
シトクロムＣ（ウマ心臓、Ｍ．Ｗ．１３，０００）を用
いた分子篩による。〕 （２）等電点；ｐＨ５．３付近〔等電点電気泳動用カラ
ム（ＬＫＢ社製）、キャリアーアンフオラインｐＨ３．
５〜１０．０（ＬＫＢ社製）を用い、７００Ｖ、４８時
間通電した後、カラム（２．４×３０ｃｍ）から２ｍｌ
づつ分画し、各々の画分のｐＨと活性を測定することに
よる。〕 （３）作用； 【００２７】 【化８】【００２８】（４）基質特異製；アンモニア（アンモニ
ウムイオンを含む）に基質特異性を有する。または後記
に示す酵素測定法の反応液Ｉの２５ｍＭ（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 の代わりに、２５ｍＭのＬ−バリン、Ｌ−ホモセリ
ン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−
チロシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロ
イシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−
ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミンをそれ
ぞれ添加し、後記の酵素活性測定法に従つて活性を測定
した結果、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の活性を１００とした場
合の相対活性は、Ｌ−バリン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−セ
リン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−チロシン、
Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ
−アルギニン、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−ヒスチジ
ン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミンは共に０．
０である。 【００２９】本酵素は、アンモニア（アンモニウムイオ
ンを含む）を利用し、少なくとも、Ｌ−バリン、Ｌ−ホ
モセリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニ
ン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ
−イソロイシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−フエニルアラニ
ン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミ
ンを利用しない。 （５）至適ｐＨ；後記の酵素活性測定法の反応液の緩衝
液をジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５．０〜７．０）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．５〜
９．０）、グルシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．５〜１０．０）に加えて酵素反応を行つた後、１０
０℃で１０分間加熱して反応を停止せしめ、生成したＮ
ＡＤの量を測定した結果は、図１の通りである。ｐＨ
８．５〜１０．０付近に至適ｐＨを有する。 （６）ｐＨ安定性；本酵素を５０ｍＭのジメチルグルタ
ル酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜７．
０）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．５〜９．０）、グリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．
０）に溶解し、６０℃で１５分間処理した後、その残存
活性を後記の酵素活性測定法に従つて測定した結果は、
図２の通りである。ｐＨ７．５〜９．０の範囲で安定で
ある。 （７）熱安定性；５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）の本酵素を溶解し、各温度で１５分間加熱処理し
後、その残存活性を後記の酵素活性測定法に従つて測定
した結果は、図３の通りである。少なくとも６０℃以下
では安定である。 （８）至適温度；５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７
０℃の各温度において後記の酵素活性測定法の反応液Ｉ
で１０分間反応せしめ、その後直ちに冷却し、３７℃で
反応液IIを加え、後記の酵素活性測定法に従つて測定し
た結果は、図４の通りである。６０℃付近に至適温度を
有する。 【００３０】さらに、至適温度について、５０ｍＭ ト
リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に本酵素を溶解した
ものを用いて、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０
℃および７５℃の各温度において後記の酵素活性測定法
（なお、後記の場合にはシグマ社製の純度９０％デアミ
ド−ＮＡＤを用いたが、本測定ではオリエンタル酵母社
製の純度９９％デアミド−ＮＡＤを用いた）の反応液Ｉ
で１０分間反応せしめ、その後直ちに冷却し、３７℃で
反応液ＩＩ（なおＥＤＴＡは５０ｍＭとした。またジア
ホラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼは同一社製
のものを用いたが、ロットは異なる）を加え、後記の酵
素活性測定法に従って活性測定した結果、７０℃の場合
の活性を１００％としたときの相対活性は、５０℃のと
きに４３％、５５℃のときに６２％、６０℃のときに７
８％、６５℃のときに９４％および７５℃のときに８１
％であり、このことから、至適温度は７０℃付近と判断
された。以上のことから、本酵素の活性測定法は、用い
るデアミド−ＮＡＤの純度やジアホラーゼおよびアルコ
ールデヒドロゲナーゼのロット差によって影響を受け、
さらにはＥＤＴＡの濃度によって影響を受けたものと推
定され、酵素自体の性質の差異のものとは認められな
い。 （９）活性化及び活性阻害物質；後記の酵素活性測定法
の反応液Ｉに表１に記載の金属イオンの場合は５ｍＭ、
ＥＤＴＡの場合は２０ｍＭ、界面活性剤の場合は０．１
％となるように添加し、酵素活性測定法に従つて測定し
た。その結果は表１の通りである。Ｎｉ++イオンとし
て、ＮｉＣｌ2 （５ｍＭ）で強い阻害を受け、２０ｍＭ
ＥＤＴＡでは全く活性が出現しない。 【００３１】また、後記の酵素活性測定法に用いる試薬
の中で、Ｍｇ++イオンとしてＭｇＣｌ2 （５ｍＭ）を含
有せしめない条件下、ＭｎＣｌ2 （３ｍＭ）添加せし
め、後記酵素活性測定法に準じて活性を行つた結果、Ｍ
ｇＣｌ2 （５ｍＭ）添加反応液を用いる場合と比較し
て、ＭｎＣｌ2 （３ｍＭ）添加反応液を用いた場合は、
１５０％の相対活性を示す。 【００３２】 【表１】【００３３】※無添加区：Ｍｇ++イオンとしてＭｇＣｌ
2 （５ｍＭ）を含有せしめた条件である。 以下はこれに、各金属イオン及び界面活性剤を添加した
ものである。 （１０）酵素活性測定法 活性測定法 反応液Ｉ ５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．０５％ 牛血清アルブミン ２ｍＭ ＡＴＰ ０．５ｍＭ デアミド−ＮＡＤ ２５ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 反応液ＩＩ ５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ 緩衝液 ｐＨ８．０ １０Ｕ ジアホラーゼ／ｍｌ（旭化成社製、バチルス属
生産菌由来） ３％ エタノール １０Ｕ アルコールデヒドロゲナーゼ／ｍｌ（東洋紡社
製、イースト菌由来） ０．０２５％ ＮＴＢ（ニトロテトラゾリウムブルー） ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名） １０ｍＭ ＥＤＴＡ 反応液Ｉ ０．３ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温
後酵素液５０μｌを添加し、３７℃で正確に１０分間反
応を行い、０．７ｍｌの反応液IIを添加し、反応液を停
止するとともにサイクリング反応を開始した。サイクリ
ング反応は３７℃で正確に５分間行い、０．１Ｎ ＨＣ
ｌ ２．０ｍｌを添加によりサイクリング反応を停止後
５５０ｎｍにおける吸光度を測定してそのときの値より
酵素活性を求めた。なお活性の計算式は次の式に順じ
た。 【００３４】 【数１】 【００３５】ΔＡ５５０：検体の吸光度 ΔＳ５５０：標準液の吸光度（０．１ｍＭ ＮＡＤ） ０．００５：検体量（ｍｌ） １０ ：反応時間 ｆ ：希釈倍率 本発明における反応系を要約すると次の通りである。 【００３６】 【化９】 【００３７】本発明の被検液としては、少なくとも前記
の反応系のＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよびアンモニア
（アンモニウムイオンも含む）のいずれか１つの被検成
分を含有するものであればよく、例えば被検成分のうち
の１つの成分を予め含有してなる被検液や、他の酵素反
応系により生成または消費された被検成分を含有する被
検液が挙げられる。 【００３８】上記の酵素反応系の好ましい例としてはＡ
ＴＰ、デアミド−ＮＡＤ、ＮＨ3 （アンモニウムイオン
も含む）を消費または生成し、ＮＡＤ、還元型ＮＡＤ等
の補酵素の関係しない酵素反応系のもの、例えば下記の
酵素反応系が例示されるが、何ら本発明の対象を限定す
るものではない。 （１）ＡＴＰを生成する酵素反応系 クレアチンキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．３．２） 還元剤；β−メルカプトエタノール、還元型グルタチオ
ン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオスレ
イトールなど。 【００３９】ピルベートキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．
１．４０） アセテートキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．１） カルバメートキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．２） アスパルテートキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．４） ホスホグリセレイトキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．
３） アルギニンキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．３．３） 【００４０】（２）ＮＨ3 を放出し得る水溶性アンモニ
ウム塩またはＮＨ3 を利用する酵素反応系 a)水溶性アンモニウム塩としては、塩化アンモニウム、
アンモニア水、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどのアンモ
ニウムイオンを放出できる無機または有機アンモニウム
塩が例示される。 b)ニコチンアミダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１９） ニコチンアミド＋Ｈ2 Ｏ→ニコチン酸＋ＮＨ3 ＋Ｈ+ c)グルタミル−ペプチド−グルタミナーゼ（Ｅ．Ｃ．
３．５．１．４４） Ｌ−グルタミニル−ペプチド＋Ｈ2 Ｏ→Ｌ−グルタミニ
ル−ペプチド＋ＮＨ3 d)アルギニンデアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．６） Ｌ−アルギニン＋Ｈ2 Ｏ→シトサリン＋ＮＨ3 ＋Ｈ+ e)グアニンデアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．４．３） グアニン＋Ｈ2 Ｏ→キサンチン＋ＮＨ3 ＋Ｈ+ f)アデノシンデアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．４．４） アデノシン＋Ｈ2 Ｏ→イノシン＋ＮＨ3 ＋Ｈ+ g)クレアチニンデアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．４．２
１） クレアチニン＋Ｈ2 Ｏ→Ｎ−メチルヒダントイン＋ＮＨ
3 ＋Ｈ+ h)スレオニンデヒドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１
６） Ｌ−スレオニン＋Ｈ2 Ｏ→２−オキソ酪酸＋ＣＯ2 ＋Ｎ
Ｈ3 ＋Ｈ+ i)アスパラギン酸アンモニア−リアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．
３．１．１） Ｌ−アスパラギン酸→フマル酸＋ＮＨ3 ＋Ｈ+ j)Ｌ−メチオニンγ−リアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．４．１．
１１） Ｌ−メチオニン＋Ｈ2 Ｏ→２−オキソ酪酸＋メタンチオ
ール＋ＮＨ3＋Ｈ+ k)メチルアミノグルタミン酸メチルトランスフエラーゼ
（Ｅ．Ｃ．２．１．１．２１） 【００４１】 【化１０】 【００４２】（３）本酵素反応で生成したＡＭＰの測定
を特徴とする被検液中のデアミノ−ＮＡＤ、ＮＨ3 （ア
ンモニウムイオンを含む）の測定は例えば下記の酵素反
応系が例示される。 アデニレトキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．４．３） 【００４３】 【化１１】 【００４４】ピルビン酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．
１．４０） 【００４５】 【化１２】 【００４６】ピルビン酸オキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．
２．３．３） 【００４７】 【化１３】 【００４８】生成したＨ2 Ｏ2 をペルオキシダーゼの存
在下に測定することによる被検液中のＮＨ3 （アンモニ
ウムイオンも含む）デアミノ−ＮＡＤの測定 乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７） ピルビン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+ →Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ 過剰の乳酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤＨ共存下でＮＡＤ
Ｈの酸化によるＡ340の減少を測定 本発明においては、上記の例示した酵素反応系で消費あ
るいは生成されたＡＴＰ、ＮＨ3 を含有する反応系に限
らず、上記酵素反応系で用いた酵素活性測定、消費され
た基質または生成された生成物を定量するための反応液
も被検液として使用し得る。 【００４９】これらの酵素反応系におけるＡＴＰ、ＮＨ
3 の定量目的は酵素反応系における酵素の活性測定や用
いられる他の成分のいずれか１つの成分の測定のために
行われるものである。この酵素反応系においては、測定
すべき成分以外は試薬として一定量用いればよい。この
場合における測定されるべき被検液や試薬の量は測定す
べき目的や選択する条件によつて適宜設定変更すればよ
く、特に限定されるものではない。 【００５０】さらに本発明のＮＡＤ合成酵素を用いて生
成されたＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系として
は、例えばＮＡＤを消費して還元型ＮＡＤを生成する反
応を形成するデヒドロゲナーゼ（Ｅ1 ）およびその基質
（Ｓ1 ）による反応系や、ＮＡＤとＮＡＤＰの両方を補
酵素とすることのできるデヒドロゲナーゼ（Ｅ1 ）およ
びその基質（Ｓ1 ）による反応系を用いることができ
る。上記のデヒドロゲナーゼは特に限定されることはな
いが、少なくともＮＡＤを補酵素として消費するもので
あればよく、かつ過剰量用いる特定の基質に作用して還
元型ＮＡＤを生成すればデヒドロゲナーゼであればいか
なる起源の酵素であってもよい。 【００５１】これらの酵素およびその基質の例としては
「酵素ハンドブツク」に記載れている。例えば、ラクテ
ートデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７）お
よびＬ−ラクテート、グリセロールデヒドロゲナーゼ
（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）およびグリセロール、グリ
セロール−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ（Ｅ．
Ｃ．１．１．１．８）およびグリセロール−３−ホスフ
エート、グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．
１．４７）およびグルコース、マレートデヒドロゲナー
ゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）およびＬ−マレート、
グルタメイトデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．
２）およびＬ−グルタメイト、３−α−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．５０）
および３−α−ヒドロキシステロイドが挙げられる。 【００５２】これらの酸化還元反応に使用する酵素量
は、酵素力価、基質の種類および補酵素サイクリング率
によつて異なる。基質量は、１サイクル毎に１モル比の
基質を消費してなるもので、サイクリングする補酵素よ
り比較にならない程はるかに多いモル量が使用されるの
で、通常単位時間当たりのサイクル数および反応時間に
基いて決定すればよい。また、その酸化還元酵素の反応
速度が最大を示すような濃度以上であればよい。通常は
０．１ｍＭないし１００ｍＭ濃度範囲で存在し得る。 【００５３】還元型ＮＡＤを補酵素とする反応系として
は、少なくとも還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成す
る作用物質（Ｅ2 ）およびその基質（Ｓ2 ）の反応系が
挙げられ、その作用物質の反応系としては、少なくとも
還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成する酸化還元酵素
およびその基質の反応系や、電子伝達物質およびテトラ
ゾリウム塩の反応系が挙げられる。 【００５４】補酵素サイクリング反応系 （ａ）ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系； （ｂ）ＮＡＤＨを補酵素とする転移反応系； ＮＨ3 ：アンモニアの正１価のアンモニウムイオンをふ
がんする。 【００５５】Ｅ1 ：ＮＡＤおよびＳ1 を基質として消
費して、還元型ＮＡＤおよびＰ1を生成する反応を触媒
するデヒロゲナーゼ Ｅ2 ：還元型ＮＡＤおよびＳ2 を消費して、ＮＡＤお
よびＰ2 を生成する反応を触媒する作用物質 Ｓ1 ：Ｅ1 の還元型基質 Ｓ2 ：Ｅ2 の酸化型基質 Ｐ1 ：Ｓ1 の酸化生成物 Ｐ2 ：Ｓ2 の還元生成物 ＮＨ3 を利用する場合の反応系を式で示すと以下の通り
である。 【００５６】 【化１４】 【００５７】還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成する
酸化還元酵素としては、少なくとも還元型ＮＡＤを補酵
素とし、過剰量用いる特定の基質（Ｓ2 ）に作用してＮ
ＡＤおよびＳ2 の還元型生成物（Ｐ2 ）を生成するデヒ
ロゲナーゼ、または少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素と
し、チトクローム、ジスルフイド化合物、キノンおよび
その類縁体等を受容体とする還元型ＮＡＤ：受容体酸化
還元酵素であればそのいずれでも良く、その起源も限定
されることはない。これらの酵素およびその基質または
受容体の例としては、「酵素ハンドブツク」に記載され
ている。 【００５８】デヒドロゲナーゼおよびその基質の例とし
ては、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．
１．２７）およびピルビン酸、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ．１．１．１）およびアセトアルデヒド、グ
リセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．６）
およびジヒドロキシアセトンが挙げられる。またＮＡＤ
Ｈ：受容体酸化還元酵素としては、チトクロームｂ5 レ
ダクターゼ（ＥＣ．１．６．２．２）、ジアホラーゼ
（ＥＣ．１．６．４．３）などが挙げられる。受容体と
しては、メチレン・ブルー、フラビン類、キノン類、
２，６−ジクロロフエノールインドフエノールなどが挙
げられる。 【００５９】還元型ＮＡＤ：受容体酸化還元酵素および
受容体の組合せは、還元型ＮＡＤを補酵素としてなる酵
素および電子受容体となり得るものであれば特に限定さ
れない。好ましい組合せとしては、ジアホラーゼ（Ｅ
Ｃ．１．６．４．３）およびテトラゾリウム塩、および
メチレン・ブルー、ＮＡＤデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．
１．６．９９．３）およびチトクロームＣ等が挙げられ
る、使用濃度は通常０．０５〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で
存在し得る。テトラゾリウム塩の使用濃度は、テトラゾ
リウム塩および究極的に形成されるホルマザンの双方の
水溶性がむしろ限定されるが、通常は試薬１ｍｌ当たり
１μｇから１００μｇの温度範囲で存在し得る。 【００６０】電子伝達物質としては、還元型ＮＡＤをＮ
ＡＤに酸化する能力を有し、しかも補酵素サイクリング
反応に悪影響を及ぼさないような物質、例えばフエナシ
ンメタルサルフエート、メルドーラ・ブルー、ピロシア
ニン等が挙げられる。使用濃度は、サイクリング率に応
じて設定すればよいが、通常反応液Ｉ １ｍｌ当たり５
μｇ〜０．５ｍｌ濃度範囲で存在し得る。 【００６１】上記のサイクリング反応は、通常室温ない
し３７℃付近の温度、好ましくは３０〜３７℃の温度で
行われる。反応時間は、特に限定されるものでなく、通
常１分以上、好ましくは５分以上行えばよい。予定され
た時間の終わりで反応を迅速に停止するには、酸例えば
塩酸、リン酸などを添加することにより行われる。サイ
クリング反応を行つた後、このサイクリング反応におい
て消費または生成される部分を定量するのであるが、生
成する部分としてはＥ1 の還元型基質（Ｓ 1 ）の酸化生
成物（Ｐ1 ）またはＥ2 の酸化型基質（Ｓ2 ）の還元生
成物（Ｐ2）を対象とすればよく、消費される部分とし
てはＥ1 の還元型基質（Ｓ1 ）またはＥ2 の酸化型基質
（Ｓ2 ）を対象とすればよく、これらのＰ1 、Ｐ2 、Ｓ
1 、Ｓ2 のいずれか１つの成分の量を定量すればよい。
簡単には、基質の状態では無色であり、生成物の状態に
て呈色または蛍光を呈する吸光波長を変化する場合の生
成物の定量手段を用いることである。例えばテトラゾリ
ウム塩を基質（Ｓ2 ）として、生成するホルマザンを還
元生成物（Ｐ2 ）とせしめて、このホルマリンを比色定
量してなるものである。さらにフラビン類やキノン類を
基質（Ｓ2 ）として用いた場合には、それらの基質（Ｓ
2 ）の消費量をその特有の吸光波長に基いて吸光度測定
して定量すればよい。 【００６２】上記反応において、テトラゾリウム塩から
形成されるホルマザンの沈澱の防止を助けるために界面
活性剤を添加することが好ましい。界面活性剤として
は、トリトンＸ−１００、アデカトールＳＯ−１４５な
どの非イオン界面活性剤が挙げられる。使用濃度は試薬
に対し、０．０１〜３％の濃度範囲で存在し得る。この
界面活性剤の添加により、測定値の上昇とホルマザンの
色素の安定化をはかることができる。 【００６３】生じたホルマザン色素の比色定量は、ホル
マザンの特異的吸光波長にて吸光度（ＯＤ）を測定すれ
ばよく、例えば５００〜５５０ｎｍの波長により吸光度
を測定して、被測定物質の定量を行うことができる。本
発明によれば、エンド・ポイント法だけでなく、レイト
法、ドライケミカル法（フイルム法、固定化法）も可能
である。 【００６４】 【発明の実施態様】次いで、本発明の実施例を挙げて具
体的に述べるが、本発明はこれによつて何ら限定される
ものではない。 【００６５】 【参考例１】 製法 ５０リットル容ジャーにペプトン１％、グルコース０．
５％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．０５％、ＮａＣｌ ０．０５
％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％を含む液体培地
（ｐＨ７．６）４０リットルを仕込み、１２０℃、２０
分間滅菌後、上記と同一組成の培地で予備培養したバチ
ルス・ステアロサーモフイラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｈ−８０４の種
菌２００ｍｌを接種し、６０℃で１０時間、通気量４０
リットル／ｍｉｎ、攪拌速度１５０ｒ．ｐ．ｍ．で通気
培養した。培養後遠心分離にて集菌し、菌体を０．１％
リゾチームを含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）５００ｍｌに分散させ、３７℃で３０分間反応
を行い、溶菌した。 【００６６】この液を５０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間
遠心し、上清液４５０ｍｌを得た。この上清液に硫安を
添加し硫安分画（０．５〜０．７１飽和）を行い、この
沈澱を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液５０ｍｌに溶解（２／
Ｕ）し、この緩衝液５リットルに対して透析した。この
透析物中に生じた不溶物を遠心分離（１５０００ｒ．
ｐ．ｍ．、１０分間）にて除去した。上清液（２０Ｕ）
を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＤ
ＥＡＥ−セフアロースＣＬ−６Ｂカラム（２５×５ｃ
ｍ）にチャージし、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配
法にて溶出した。０．２５〜０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出
される画分を集め（８０ｍｌ、１６．５Ｕ）アミコン社
製セントリフローメンブランコーンＣＦ２５を用い濃縮
した後、セフアデツクスＧ−１００（３．６×８０ｃ
ｍ）にて精製を行い、その活性画分を集め、精製標品
（５０ｍｌ、１４Ｕ）とした。 【００６７】 【実施例１】 検体中のＡＴＰの測定 反応液Ｉ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．０５％ 牛血清アルブミン １ｍＭ デアミノ−ＮＡＤ ５０ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １００ｍＵ 本発明ＮＡＤ合成酵素／ｍｌ 反応液ＩＩ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０Ｕ ジアホラーゼ（旭化成社製、バチルス菌由来） ３％ エタノール １０Ｕ アルコールデヒドロゲナーゼ（東洋紡績社製、
イースト菌由来） ０．０２５％ ニトロテトラゾリウムブルー ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １５ｍＭ ＥＤＴＡ 反応液Ｉ ０．３ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温
後０、１０、２０、３０、４０μＭのＡＴＰ溶液をそれ
ぞれ５μｌ添加し、３７℃で１０分間反応した後、反応
液ＩＩを０．７ｍｌ添加し、３７℃で正確に５分間反応
したのち、０．１Ｎ ＨＣｌ ２．０ｍｌを加えて反応
を停止し、５５０ｎｍで吸光度測定した。その結果は、
図５に示す通りで良好な直線性が得られた。 【００６８】 【実施例２】 アンモニウムイオンの測定 実施例１に示した反応系Ｉ中の５０ｍＭ（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 の代わりに５ｍＭＡＴＰを添加した反応液に０、
５、１０、１５、２０μＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ 4 溶液を
５μｌ添加し、実施例２と同様の操作を行った。その結
果は、図６に示す通りで良好な直線性が得られた。 【００６９】 【実施例３】クレアチニンの測定 反応液Ｉ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＡＴＰ ０．０５％ 牛血清アルブミン １ｍＭ デアミノ−ＮＡＤ ２０Ｕ／ｍｌ クレアチニンデイミナーゼ（コダック社
製） １００ｍＵ／ｍｌ 本発明ＮＡＤ合成酵素 反応液Ｉ ０．３ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温
後１、２、３、４ｍｇ／ｄｌのクレアチニン溶液を１０
μｌ添加し、実施例２と同様の操作を行った。その結果
は、図７に示す通りで良好な直線性が得られた。 【００７０】 【実施例４】 アンモニウムイオンの測定法 ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＡＴＰ ０．０５％ 牛血清アルブミン １ｍＭ デアミノ−ＮＡＤ １００ｍＵ／ｍｌ 本発明ＮＡＤ合成酵素 上記反応液１ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温後
０、２５、５０、１００ｍＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 溶液
をそれぞれ１０μｌ添加し、３７℃で２０分間反応した
後に３４０ｎｍで吸光度測定した。その結果は、図８に
示す通りで良好な直線性が得られた。 【００７１】 【実施例５】 生成したＡＭＰの測定 反応液Ｉ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＡＴＰ ０．０５％ 牛血清アルブミン ０．０５％ トリトンＸ−１００ １ｍＭ デアミド−ＮＡＤ １０Ｕ／ｍｌ ミオキナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製 バチル
ス菌由来） １０Ｕ／ｍｌ ピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製
バチルス菌由来） １０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸 １００ｍＵ／ｍｌ 本発明ＮＡＤ合成酵素 反応液ＩＩ ５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ８．０ １００ｍＵ／ｍｌ ピルビン酸オキシダーゼ（Ｓｉｇｍ
ａ社製 ベデイオコツカス菌由来） １００ｍＵ／ｍｌ ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社
製） ０．２％ フエノール ０．３％ ４−アミノアンチピリン 上記反応液Ｉ １ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温
後０、０．５、１．０、１．５、２０ｍＭの（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 溶液をそれぞれ１０μｌ添加し、３７℃で３０
分間反応した後に反応液ＩＩを０．１ｍｌ添加し、３７
℃、３０分間反応した後に５００ｎｍで吸光度測定し
た。その結果は、図９に示す通りで良好な直線性が得ら
れた。 【００７２】 【実施例６】 デアミド−ＮＡＤの測定法 反応液 ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．０５％ 牛血清アルブミン ５０ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｍＭ ＡＴＰ １００ｍＵ／ｍｌ 本発明ＮＡＤ合成酵素 ３％ エタノール １０Ｕ アルコールデヒドロゲナーゼ ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ 反応液１ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温後０、
２．５、５、１０ｍＭのデアミド−ＮＡＤ溶液をそれぞ
れ１０μｌ添加し、３７℃で３０分間反応した後に３４
０ｎｍで吸光度測定した。その結果は、図１０に示す通
りで良好な直線性が得られた。 【００７３】 【実施例７】 金属イオンの至適濃度 反応液Ｉ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ０．０５％ 牛血清アルブミン ２ｍＭ ＡＴＰ ０．５ｍＭ デアミド−ＮＡＤ ２５ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 反応液ＩＩ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０Ｕ ジアホラーゼ１ｍｌ（旭化成社製 バチルス属
生産菌由来） ３％ エタノール １０Ｕ アルコールデヒドロゲナーゼ／ｍｌ（東洋紡績
社製 イースト菌由来） ０．０２５％ ＮＴＢ（ニトロテトラゾリウムブルー） ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名） １０ｍＭ ＥＤＴＡ 反応液ＩにそれぞれＭｇＣｌ2 ０．２５ｍＭ、０．５０
ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍ
Ｍ、ＭｎＣｌ2 ０．２５ｍＭ、０．５０ｍＭ、０．７５
ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ添加し、それぞ
れ、酵素活性測定法に従って活性を測定し、その相対活
性を、ＭｇＣｌ2 添加区を図１１、ＭｎＣｌ2 添加区を
図１２に示す。その結果、ＭｎＣｌ2 添加区においては
３ｍＭで至適濃度を示した。 【００７４】 【発明の効果】本発明は、本発明ＮＡＤ合成酵素を用い
て被検液中のＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよびアンモニ
アまたはアンモニウムイオンのいずれか１つの成分の定
量に利用できるもので、特に被検液中のアミノ酸の影響
を受けることなくアンモニア（アンモニウムイオンも含
む）の測定を可能ならしめるものである。かつ好ましい
態様としての本発明ＮＡＤ合成酵素の熱安定性において
６０℃まで安定であるとの耐熱性酵素である点からも前
記の各種の分析において有用なものである。
酵素を用いる測定法に関する。更に詳しく言えば、本発
明は、被検液中のＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよびアン
モニアまたはアンモニウムイオンのいずれか１つを測定
するに当たり、少なくともＭｇ++イオンまたはＭｎ++イ
オンの存在下、下記の式（ａ）の酵素反応を触媒し、Ｍ
ｇ++イオンの存在下、下記の式（ｂ）の酵素反応を触媒
せず、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオンを
基質として利用し、かつ少なくともグルタミンおよびア
スパラギンを基質として利用しないＮＡＤ合成酵素（以
下、本発明ＮＡＤ合成酵素ということがある）を、被検
液に作用せしめ、次いで反応において消費された成分ま
たは生成された成分を測定することを特徴とするＡＴ
Ｐ、デアミド−ＮＡＤおよびアンモニアまたはアンモニ
ウムイオンのいずれか１つの成分を測定する被検液中の
成分の測定法に関する。 【０００２】 【化２】 【０００３】 【従来の技術】従来、ＮＡＤ合成酵素（ＮＡＤ+ ｓｙｎ
ｔｈｅｔａｓｅ）は、ラツト肝臓〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２３３，４９３〜５００（１９５８）〕、ブタ
肝臓〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３６，５２５〜５
３０（１９６１）〕、酵母〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４７，４７９４〜４８０２（１９７２）〕、
Ｅ．ｃｏｌｉ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３６，１
４９４〜１４９７（１９６１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４２，３８５〜３９２（１９６７）〕に夫々そ
の存在が知られている。そして、酵素分類上、 【０００４】 【化３】 【０００５】の反応を触媒するＮＡＤ合成酵素（Ｅ．
Ｃ．６．３．１．５）と 【０００６】 【 】 【０００７】 【化４】 【０００８】の反応を触媒するＮＡＤ合成酵素（Ｅ．
Ｃ．６．８．５．１）に分類されているが、両酵素とも
アミノ供与体としてアンモニア（アンモニウムイオンを
含む）およびＬ−グルタミンを基質として作用し、ＮＡ
Ｄ合成酵素（Ｅ．Ｃ．６．３．１．５）について、
〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３６，１４９４〜１４
９７（１９６１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４
２，３８５〜３９２（１９６７）〕によると、ＮＨ4 +
に対するＫｍ値は６．５×１０-5Ｍ、Ｌ−グルタミンに
対するＫｍ値は１．６×１０-2Ｍと報告されている。 【０００９】また、ＮＡＤ合成酵素（Ｅ．Ｃ．６．３．
５．１）について〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４
７，４７９４〜４８０２（１９７２）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２３３，４９３〜５００（１９５８）〕に
よると、ＮＨ4 + に対するＫｍ値は６．４×１０3 Ｍ、
Ｌ−グルタミンに対するＫｍ値は５×１０-3Ｍと報告さ
れている。両酵素の相違はアザセリンによつて阻害され
るか、否かによつて区別されている。 【００１０】従来より知られたＮＡＤ合成酵素の活性測
定法は、反応により生じたＮＡＤをアルコールデヒドロ
ゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１）で還元し、生じた還元
型ＮＡＤを３４０ｎｍにおける吸光度測定する方法また
は生じたＮＡＤを蛍光法で測定する方法が報告されてい
る。また、本発明者らは、先に従来のＮＡＤ合成酵素
（Ｅ．Ｃ．６．３．１．５およびＥ．Ｃ．６．３．５．
１）を用いて被検液中のＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよ
び、ＮＨ3 、ＧｌｎまたはＡｓｎアミド供与体のいずれ
か１つを測定するに当たり、被検液にＡＴＰ、デアミド
−ＮＡＤ、アミド供与体およびＭｇ++の存在下ＮＡＤ合
成酵素を作用させる主反応を行い、主反応により生じた
ＮＡＤを、ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系と還元
型ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系との組合せによ
る補酵素サイクリング反応を行い、そのサイクリング反
応により消費または生成された成分を定量するとこを特
徴とするＡＴＰ、アミド−ＮＡＤおよびアミド供与体の
いすれか１つを含有する被検液中の成分の測定法を報告
している（特開昭５９−１９８９９５号公報）。 【００１１】 【発明が解決しようとする課題】前述のように従来のＮ
ＡＤ合成酵素は、アミノ供与体としてＬ−グルタミンを
基質として利用するものであり、少なくともＭｇ++イオ
ンまたはＭｎ++イオンの存在下、下記の式（ａ）の酵素
反応を触媒し、Ｍｇ++イオンの存在下、下記の式（ｂ）
の酵素反応を触媒せず、アンモニアおよび／またはアン
モニウムイオンを基質として利用し、かつ少なくともグ
ルタミンおよびアスパラギンを基質として利用しないＮ
ＡＤ合成酵素は知られていなかった。 【００１２】 【化５】 【００１３】また、従来のＮＡＤ合成酵素は前述の如
く、Ｌ−グルタミンにも基質特異性を有するため、Ｌ−
グルタミン共存下でのＮＨ3 の測定が出来ないものであ
った。 【００１４】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述の課
題に鑑み、鋭意研究の結果、大分県別府市田ノ湯町の温
泉水から分離したバチルス属に属する菌株Ｈ−８０４株
が、新規な、少なくともＭｇ++イオンまたはＭｎ++イオ
ンの存在下、下記の式９（ａ）の酵素反応を触媒し、Ｍ
ｇ++イオンの存在下、下記の式９（ｂ）の酵素反応を触
媒せず、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオン
を基質として利用し、かつ少なくともグルタミンおよび
アスパラギンを基質として利用しないＮＡＤ合成酵素を
産生することを見出した。 【００１５】 【化６】 【００１６】すなわち、本発明は、少なくともＭｇ++イ
オンまたはＭｎ++イオンの存在下、下記の式（ａ）の酵
素反応を触媒し、Ｍｇ++イオンの存在下、下記の式
（ｂ）の酵素反応を触媒せず、アンモニアおよび／また
はアンモニウムイオンを基質として利用し、かつ少なく
ともグルタミンおよびアスパラギンを基質として利用し
ないＮＡＤ合成酵素（以下本発明ＮＡＤ合成酵素と云う
ことがある） 【００１７】 【化７】 【００１８】に関し、被検液中のＡＴＰ、デアミド−Ｎ
ＡＤおよびアンモニアまたはアンモニウムイオンのいず
れか１つを測定するに当たり、本発明ＮＡＤ合成酵素を
被検液に作用せしめ、次いで反応において消費された成
分または生成された成分を測定することを特徴とする、
ＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよびアンモニアまたはアン
モニウムイオンのいずれか１つの成分を測定する被検液
中の成分の測定法である。 【００１９】この新規な本発明ＮＡＤ合成酵素生産菌の
菌学的性状は以下の通りである。 ａ．形態的特徴 普通寒天斜面培地を用いて、５０℃で１〜３日間培養し
て顕微鏡観察を行った。 （１）形および配列；端は丸く、まつすぐ又はやや曲つ
た桿菌で単独又は二連鎖を形成する。 （２）大きさ；０．５〜１．０×１．６〜５．５μｍ （３）運動性；周毛で運動する。 （４）芽胞；中央又は端に近いところに形成する。大き
さは０．８〜１．０×１．０×１．５μｍで細胞は膨張
する。 ｂ．各培地における生育状態（５０℃） （１）普通寒天平板培地 灰白色〜淡黄灰白色で半透明であり、線状に生育し、生
育はやや弱く、可溶性色素は産生しない。 （２）普通寒天斜面培地 灰白色〜淡黄灰白色で半透明であり、円形で平らな集落
を形成する。可溶性色素は産生しない。 （３）液体培地 生育良好で一様に混濁し、２〜３日後一部沈澱する。 （４）ＢＣＰミルク 不変である。 ｃ．生理的性質（＋；陽性、−；陰性） グラム染色 ＋ ＫＯＨ反応 − 抗酸性染色 − カプセル形成 − ＯＦテスト（Ｈｕｇｈ＋Ｌｅｉｆｓｏｎ培地） 変化なし ＯＦテスト（変法培地）※※ ０（酸化） 嫌気での生育 − カタラーゼ産生 ＋（弱） オキシダーゼ産生 ＋（弱） ウレアーゼ産生（ＳＳＲ培地） − 〃 （Ｃｈｒｉｓ培地） − レシチナーゼ産生 生育しない ゼラチン分解 ＋ デンプン分解 ＋ カゼイン分解 ＋ エスクリン分解 ＋ アルギニン分解 − セルロース分解 − インドール産生 − 硫化水素産生 ＋（酢酸鉛紙） アセトイン産生 − ＭＲテスト − 硝酸塩の還元 − ＮａＣｌ無添加培地での生育 ＋ ０．１％ＮａＣｌ添加培地での生育 ＋ ０．２５％ＮａＣｌ添加培地での生育 − ６５℃での生育 ＋ ５０℃での生育 ＋ ３７℃での生育 − ｐＨ９．０での生育 − ｐＨ８．０での生育 ＋ ｐＨ５．６での生育 ＋ ｐＨ４．８での生育 − 糖より酸の産生※（ガス非産生） アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース ＋ セロビオース ＋ ヅルシトール − ｍｅｓｏ−エリスリトール − Ｄフラクトース − フコース − Ｄガラクトース ＋ Ｄグルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール − イヌリン − ラクトース ＋ マルトース − Ｄマンニトール ＋ Ｄマンノース ＋ メレジトース ＋ メリビオース ＋ ラフイノース ＋ ラムノース − Ｄリボース ＋ サリシン − Ｌソルボース − ソルビトール − デンプン ＋ サツカロース ＋ トレハロース ＋ Ｄキシロース ※基礎培地 糖加アンモニウム培地（ＡＳＳ） （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 １．０ｇ ＫＣｌ ０．２ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ 酵母抽出物 １．０ｇ アガロース ３．０ｇ ＢＴＢ ０．０２ｇ 蒸留水 １０００ｍｌ ｐＨ ７．０ ※※変法培地 上記基礎培地に１０．０ｇグルコースを添加した培地 利用性テスト（Ｓｉｍｍｏｎｓ培地） クエン酸塩 − マロン酸塩 − グルコン酸塩 − プロピオン酸塩 − マレイン酸塩 − コハク酸塩 − リンゴ酸塩 ＋ 利用性テスト（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｅｓｅｎ培地） クエン酸塩 − マロン酸塩 − グルコン酸塩 ＋ プロピオン酸塩 − マレイン酸塩 − コハク酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ 上記の菌学的性質から、本Ｈ−８０４菌株は、端の丸
い、まっすぐまたはやや曲がつた桿菌で、グラム陽性、
大きさは０．５〜１．０×１．６×５．５μｍで芽胞を
形成する高温性細菌で、カタラーゼ及びオキシダーゼ産
生能が弱陽性で、非運動性、糖（グルコース）を酸化的
に分解する細菌であるとの特徴を有する。このような諸
性状を有する本菌の分類学上の位置をＢｅｒｇｙ’ｓ・
Ｍａｎｕａｌ ８版、１９７４、医学細菌同定の手引き
２版、１９７４およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｈａｎ
ｄ ｂｏｏｋ、４２７、Ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓを参照して検討すると、本菌は芽胞を形成し、
好気条件で生育できることからバチルス属に属するもの
と判定される。 【００２０】そこで、バチルス属に属する高（好）温性
・耐温性の菌種として、バチルス・ズブチリス、バチル
ス・コアギユランス、バチルス・リケニホルミス、バチ
ルス・ブレビスおよびバチルス・ステアロサーモフイラ
スが挙げられるが、本菌の最低生育温度が３０℃以上で
あることから、（Ａ）バチルス・ステアロサーモフイラ
スおよび（Ｂ）バチルス・ブレビスが挙げられる。これ
らの性状を比較対比すると次の通りである。〔＋；陽
性、−；陰性、ｄ；菌株によつて異なる〕。 【００２１】 本菌 （Ａ） （Ｂ） 菌の大きさ（μｍ） 巾 ０．５〜１．０ ０．５〜０．１ ０．６〜０．９ 長さ １．６〜５．５ ２．０〜３．５ １．５〜４．０ グラム染色 ＋（易脱色） 不定 不定 胞子形成 ＋ ＋ ＋ 胞子による菌体の膨張 ＋ ＋ ＋ 運動性 − ＋ ＋ カタラーゼ産生 （＋） ＋ ＋ 嫌気下での生育 − − − アセトイン産生 − − − 生育温度 最高（℃） ６５以上 ６５〜７５ ４０〜６０ 最低（℃） ３７以上 ３０〜４５ １０〜３５ ｐＨ５．７での生育 ＋ − ｄ ５％ＮａＣｌ添加培地 − ｄ − での生育 糖よりの産生 グルコース ＋ ＋ ＋ アラビノース ＋ ｄ − キシロース ＋ ｄ − マンニツト ＋ ｄ ｄ 糖よりのガスの産生 − − − デンプン分解 ＋ ＋ ｄ クエン酸塩の利用 − − ｄ 硝酸塩の還元 − ｄ ｄ インドール産生 − − − カゼイン分解 ＋ ｄ ＋ 以上の比較対比から、本菌株はバチルス・ステアロサー
モフイラスとよく一致しており、運動性について容易に
非運動性の株が得られることが報告されており、その他
の諸性状について比較検討した結果でもバチルス・ステ
アロサーモフイラスとよく一致した。よって本Ｈ−８０
４菌株をバチルス・ステアロサーモフイラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｉｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｈ
−８０４と同定命名した。なお、本菌株は工業技術院微
生物生命工学工業技術院研究所に「微工研菌寄第８８３
９号（ＦＥＲＭ Ｐ−８８３９）、微工研菌寄第１４０
８号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４０８）」として寄託されて
いる。 【００２２】本発明においては、バチルス属に属する本
発明ＮＡＤ合成酵素生産菌としては、上記のバチルス・
ステアロサーモフイラスＨ−８０４はその一例であつ
て、この菌株に限らず、本発明ＮＡＤ合成酵素を生産す
る菌はすべて本発明において使用できる。また、本発明
ＮＡＤ合成酵素を産生する菌より遺伝子操作により本発
明ＮＡＤ合成酵素の遺伝情報を担うＤＮＡを分離し、本
発明ＮＡＤ合成酵素非産生菌にそのＤＮＡを組み込み、
本発明ＮＡＤ合成酵素生産能を発現せしめるように変異
された変異株を得ることが出来、該変異株より産生され
た本発明ＮＡＤ合成酵素、及び該酵素を用いた被検液中
の成分の測定法も本発明に含まれるものである。 【００２３】本発明は、本発明ＮＡＤ合成酵素生産菌を
生産する通常の方法で培養される。培養の形態は、液体
培養でも固体培養でもよいが、工業的には深部通気攪拌
培養を行うのが望ましい。培地の栄養源とては微生物の
培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源
としては同化可能な炭素化合物であればよく、例えばブ
ドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、スターチ、デキストリ
ン、糖密、廃糖密、グリセリンなどが挙げられる。窒素
源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例え
ばコーンスチープリカー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテ
ン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分
解物、硫酸アンモニウムなどが使用される。その他リン
酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウ
ム、亜鉛、鉄、マンガン、ハロゲンなどの塩類が必要に
応じて使用される。、バチルス・ステアロサーモフイラ
アスＨ−８０４においては培養温度は、本発明ＮＡＤ合
成酵素生産菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適宜
変更し得るが、４８〜７０℃、特に５５〜６０℃が好ま
しい。培養時間は培養条件によつて異なるが、本酵素が
最高力価に達する時期を見計らつて適当な時期に培養を
終了すればよく、１０〜２０時間が好ましかつた。通気
攪拌する場合には、２００〜４００ｒ．ｐ．ｍ．の条件
下で充分である。 【００２４】このようにして得られたＮＡＤ合成酵素生
産菌の培養物から本発明ＮＡＤ合成酵素を採取するので
あるが、本酵素は主にその菌体内に含有されるので、得
られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により集
菌し、この菌体を超音波処理、フレンチプレス処理やガ
ラスビース処理などの機械的破壊処理手段やリゾチーム
などの酵素的破壊手段にて破壊し、また必要に応じてト
リトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００：商品
名）、アデカトールＳＯ−１２０（商品名）などの界面
活性剤を添加してもよい。こうして得られたＮＡＤ合成
酵素含有液は、濃縮するか、または濃縮することなく可
溶性塩類、例えば硫安などを用いて塩析するするか、親
水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセト
ン、イソプロパノールなどを用いて本酵素を沈澱させれ
よい。 【００２５】この沈澱物は、水または緩衝液に溶解後、
必要に応じて半透膜にて透析し、さらにＤＥＡＥ−セフ
アデツクス、ＤＥＡＥ−セフアロースやＤＥＡＥ−セル
ロースなどやカルボキメチル−セルロース、カルボキシ
メチル−セフアロース、カルボキシメチル−セフアデツ
クスなどのイオン交換樹脂を用いるクロマトグラフイー
やセフアデツクスＧ２００、セフアロースＣＬ−６Ｂ、
セフアクリルＳ−２００などの分子篩剤などのゲル濾過
剤を用いるクロマトグラフイーにて精製せしめ、その後
必要に応じて安定化剤を添加し、凍結乾燥などの処理に
より精製された本酵素を得ることができる。 【００２６】次に、本発明で得た本発明ＮＡＤ合成酵素
の性質について述べる。 （１）分子量；約５００００〔ポリビニルゲル（商品
名：ＧＰＣ３０００ＳＷ；東洋曹達社製）のカラム
（７．５ｍｍＩＤ×６０ｃｍ）を用い、標準蛋白質とし
て、アルドラーゼ（ウサギ筋肉、Ｎ．Ｗ．１５０，００
０）、牛血清アルブミン（Ｍ．Ｗ．６７，０００）、オ
ボアルブミン（ニワトリ卵：Ｍ．Ｗ．４５，０００）、
シトクロムＣ（ウマ心臓、Ｍ．Ｗ．１３，０００）を用
いた分子篩による。〕 （２）等電点；ｐＨ５．３付近〔等電点電気泳動用カラ
ム（ＬＫＢ社製）、キャリアーアンフオラインｐＨ３．
５〜１０．０（ＬＫＢ社製）を用い、７００Ｖ、４８時
間通電した後、カラム（２．４×３０ｃｍ）から２ｍｌ
づつ分画し、各々の画分のｐＨと活性を測定することに
よる。〕 （３）作用； 【００２７】 【化８】【００２８】（４）基質特異製；アンモニア（アンモニ
ウムイオンを含む）に基質特異性を有する。または後記
に示す酵素測定法の反応液Ｉの２５ｍＭ（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 の代わりに、２５ｍＭのＬ−バリン、Ｌ−ホモセリ
ン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−
チロシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロ
イシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−
ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミンをそれ
ぞれ添加し、後記の酵素活性測定法に従つて活性を測定
した結果、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の活性を１００とした場
合の相対活性は、Ｌ−バリン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−セ
リン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−チロシン、
Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ
−アルギニン、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−ヒスチジ
ン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミンは共に０．
０である。 【００２９】本酵素は、アンモニア（アンモニウムイオ
ンを含む）を利用し、少なくとも、Ｌ−バリン、Ｌ−ホ
モセリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニ
ン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ
−イソロイシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−フエニルアラニ
ン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミ
ンを利用しない。 （５）至適ｐＨ；後記の酵素活性測定法の反応液の緩衝
液をジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５．０〜７．０）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．５〜
９．０）、グルシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．５〜１０．０）に加えて酵素反応を行つた後、１０
０℃で１０分間加熱して反応を停止せしめ、生成したＮ
ＡＤの量を測定した結果は、図１の通りである。ｐＨ
８．５〜１０．０付近に至適ｐＨを有する。 （６）ｐＨ安定性；本酵素を５０ｍＭのジメチルグルタ
ル酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜７．
０）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．５〜９．０）、グリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．
０）に溶解し、６０℃で１５分間処理した後、その残存
活性を後記の酵素活性測定法に従つて測定した結果は、
図２の通りである。ｐＨ７．５〜９．０の範囲で安定で
ある。 （７）熱安定性；５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）の本酵素を溶解し、各温度で１５分間加熱処理し
後、その残存活性を後記の酵素活性測定法に従つて測定
した結果は、図３の通りである。少なくとも６０℃以下
では安定である。 （８）至適温度；５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７
０℃の各温度において後記の酵素活性測定法の反応液Ｉ
で１０分間反応せしめ、その後直ちに冷却し、３７℃で
反応液IIを加え、後記の酵素活性測定法に従つて測定し
た結果は、図４の通りである。６０℃付近に至適温度を
有する。 【００３０】さらに、至適温度について、５０ｍＭ ト
リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に本酵素を溶解した
ものを用いて、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０
℃および７５℃の各温度において後記の酵素活性測定法
（なお、後記の場合にはシグマ社製の純度９０％デアミ
ド−ＮＡＤを用いたが、本測定ではオリエンタル酵母社
製の純度９９％デアミド−ＮＡＤを用いた）の反応液Ｉ
で１０分間反応せしめ、その後直ちに冷却し、３７℃で
反応液ＩＩ（なおＥＤＴＡは５０ｍＭとした。またジア
ホラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼは同一社製
のものを用いたが、ロットは異なる）を加え、後記の酵
素活性測定法に従って活性測定した結果、７０℃の場合
の活性を１００％としたときの相対活性は、５０℃のと
きに４３％、５５℃のときに６２％、６０℃のときに７
８％、６５℃のときに９４％および７５℃のときに８１
％であり、このことから、至適温度は７０℃付近と判断
された。以上のことから、本酵素の活性測定法は、用い
るデアミド−ＮＡＤの純度やジアホラーゼおよびアルコ
ールデヒドロゲナーゼのロット差によって影響を受け、
さらにはＥＤＴＡの濃度によって影響を受けたものと推
定され、酵素自体の性質の差異のものとは認められな
い。 （９）活性化及び活性阻害物質；後記の酵素活性測定法
の反応液Ｉに表１に記載の金属イオンの場合は５ｍＭ、
ＥＤＴＡの場合は２０ｍＭ、界面活性剤の場合は０．１
％となるように添加し、酵素活性測定法に従つて測定し
た。その結果は表１の通りである。Ｎｉ++イオンとし
て、ＮｉＣｌ2 （５ｍＭ）で強い阻害を受け、２０ｍＭ
ＥＤＴＡでは全く活性が出現しない。 【００３１】また、後記の酵素活性測定法に用いる試薬
の中で、Ｍｇ++イオンとしてＭｇＣｌ2 （５ｍＭ）を含
有せしめない条件下、ＭｎＣｌ2 （３ｍＭ）添加せし
め、後記酵素活性測定法に準じて活性を行つた結果、Ｍ
ｇＣｌ2 （５ｍＭ）添加反応液を用いる場合と比較し
て、ＭｎＣｌ2 （３ｍＭ）添加反応液を用いた場合は、
１５０％の相対活性を示す。 【００３２】 【表１】【００３３】※無添加区：Ｍｇ++イオンとしてＭｇＣｌ
2 （５ｍＭ）を含有せしめた条件である。 以下はこれに、各金属イオン及び界面活性剤を添加した
ものである。 （１０）酵素活性測定法 活性測定法 反応液Ｉ ５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．０５％ 牛血清アルブミン ２ｍＭ ＡＴＰ ０．５ｍＭ デアミド−ＮＡＤ ２５ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 反応液ＩＩ ５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ 緩衝液 ｐＨ８．０ １０Ｕ ジアホラーゼ／ｍｌ（旭化成社製、バチルス属
生産菌由来） ３％ エタノール １０Ｕ アルコールデヒドロゲナーゼ／ｍｌ（東洋紡社
製、イースト菌由来） ０．０２５％ ＮＴＢ（ニトロテトラゾリウムブルー） ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名） １０ｍＭ ＥＤＴＡ 反応液Ｉ ０．３ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温
後酵素液５０μｌを添加し、３７℃で正確に１０分間反
応を行い、０．７ｍｌの反応液IIを添加し、反応液を停
止するとともにサイクリング反応を開始した。サイクリ
ング反応は３７℃で正確に５分間行い、０．１Ｎ ＨＣ
ｌ ２．０ｍｌを添加によりサイクリング反応を停止後
５５０ｎｍにおける吸光度を測定してそのときの値より
酵素活性を求めた。なお活性の計算式は次の式に順じ
た。 【００３４】 【数１】 【００３５】ΔＡ５５０：検体の吸光度 ΔＳ５５０：標準液の吸光度（０．１ｍＭ ＮＡＤ） ０．００５：検体量（ｍｌ） １０ ：反応時間 ｆ ：希釈倍率 本発明における反応系を要約すると次の通りである。 【００３６】 【化９】 【００３７】本発明の被検液としては、少なくとも前記
の反応系のＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよびアンモニア
（アンモニウムイオンも含む）のいずれか１つの被検成
分を含有するものであればよく、例えば被検成分のうち
の１つの成分を予め含有してなる被検液や、他の酵素反
応系により生成または消費された被検成分を含有する被
検液が挙げられる。 【００３８】上記の酵素反応系の好ましい例としてはＡ
ＴＰ、デアミド−ＮＡＤ、ＮＨ3 （アンモニウムイオン
も含む）を消費または生成し、ＮＡＤ、還元型ＮＡＤ等
の補酵素の関係しない酵素反応系のもの、例えば下記の
酵素反応系が例示されるが、何ら本発明の対象を限定す
るものではない。 （１）ＡＴＰを生成する酵素反応系 クレアチンキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．３．２） 還元剤；β−メルカプトエタノール、還元型グルタチオ
ン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオスレ
イトールなど。 【００３９】ピルベートキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．
１．４０） アセテートキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．１） カルバメートキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．２） アスパルテートキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．４） ホスホグリセレイトキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．
３） アルギニンキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．３．３） 【００４０】（２）ＮＨ3 を放出し得る水溶性アンモニ
ウム塩またはＮＨ3 を利用する酵素反応系 a)水溶性アンモニウム塩としては、塩化アンモニウム、
アンモニア水、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどのアンモ
ニウムイオンを放出できる無機または有機アンモニウム
塩が例示される。 b)ニコチンアミダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１９） ニコチンアミド＋Ｈ2 Ｏ→ニコチン酸＋ＮＨ3 ＋Ｈ+ c)グルタミル−ペプチド−グルタミナーゼ（Ｅ．Ｃ．
３．５．１．４４） Ｌ−グルタミニル−ペプチド＋Ｈ2 Ｏ→Ｌ−グルタミニ
ル−ペプチド＋ＮＨ3 d)アルギニンデアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．６） Ｌ−アルギニン＋Ｈ2 Ｏ→シトサリン＋ＮＨ3 ＋Ｈ+ e)グアニンデアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．４．３） グアニン＋Ｈ2 Ｏ→キサンチン＋ＮＨ3 ＋Ｈ+ f)アデノシンデアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．４．４） アデノシン＋Ｈ2 Ｏ→イノシン＋ＮＨ3 ＋Ｈ+ g)クレアチニンデアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．４．２
１） クレアチニン＋Ｈ2 Ｏ→Ｎ−メチルヒダントイン＋ＮＨ
3 ＋Ｈ+ h)スレオニンデヒドラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１
６） Ｌ−スレオニン＋Ｈ2 Ｏ→２−オキソ酪酸＋ＣＯ2 ＋Ｎ
Ｈ3 ＋Ｈ+ i)アスパラギン酸アンモニア−リアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．
３．１．１） Ｌ−アスパラギン酸→フマル酸＋ＮＨ3 ＋Ｈ+ j)Ｌ−メチオニンγ−リアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．４．１．
１１） Ｌ−メチオニン＋Ｈ2 Ｏ→２−オキソ酪酸＋メタンチオ
ール＋ＮＨ3＋Ｈ+ k)メチルアミノグルタミン酸メチルトランスフエラーゼ
（Ｅ．Ｃ．２．１．１．２１） 【００４１】 【化１０】 【００４２】（３）本酵素反応で生成したＡＭＰの測定
を特徴とする被検液中のデアミノ−ＮＡＤ、ＮＨ3 （ア
ンモニウムイオンを含む）の測定は例えば下記の酵素反
応系が例示される。 アデニレトキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．４．３） 【００４３】 【化１１】 【００４４】ピルビン酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．
１．４０） 【００４５】 【化１２】 【００４６】ピルビン酸オキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．
２．３．３） 【００４７】 【化１３】 【００４８】生成したＨ2 Ｏ2 をペルオキシダーゼの存
在下に測定することによる被検液中のＮＨ3 （アンモニ
ウムイオンも含む）デアミノ−ＮＡＤの測定 乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７） ピルビン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+ →Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ 過剰の乳酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤＨ共存下でＮＡＤ
Ｈの酸化によるＡ340の減少を測定 本発明においては、上記の例示した酵素反応系で消費あ
るいは生成されたＡＴＰ、ＮＨ3 を含有する反応系に限
らず、上記酵素反応系で用いた酵素活性測定、消費され
た基質または生成された生成物を定量するための反応液
も被検液として使用し得る。 【００４９】これらの酵素反応系におけるＡＴＰ、ＮＨ
3 の定量目的は酵素反応系における酵素の活性測定や用
いられる他の成分のいずれか１つの成分の測定のために
行われるものである。この酵素反応系においては、測定
すべき成分以外は試薬として一定量用いればよい。この
場合における測定されるべき被検液や試薬の量は測定す
べき目的や選択する条件によつて適宜設定変更すればよ
く、特に限定されるものではない。 【００５０】さらに本発明のＮＡＤ合成酵素を用いて生
成されたＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系として
は、例えばＮＡＤを消費して還元型ＮＡＤを生成する反
応を形成するデヒドロゲナーゼ（Ｅ1 ）およびその基質
（Ｓ1 ）による反応系や、ＮＡＤとＮＡＤＰの両方を補
酵素とすることのできるデヒドロゲナーゼ（Ｅ1 ）およ
びその基質（Ｓ1 ）による反応系を用いることができ
る。上記のデヒドロゲナーゼは特に限定されることはな
いが、少なくともＮＡＤを補酵素として消費するもので
あればよく、かつ過剰量用いる特定の基質に作用して還
元型ＮＡＤを生成すればデヒドロゲナーゼであればいか
なる起源の酵素であってもよい。 【００５１】これらの酵素およびその基質の例としては
「酵素ハンドブツク」に記載れている。例えば、ラクテ
ートデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７）お
よびＬ−ラクテート、グリセロールデヒドロゲナーゼ
（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）およびグリセロール、グリ
セロール−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ（Ｅ．
Ｃ．１．１．１．８）およびグリセロール−３−ホスフ
エート、グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．
１．４７）およびグルコース、マレートデヒドロゲナー
ゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）およびＬ−マレート、
グルタメイトデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．
２）およびＬ−グルタメイト、３−α−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．５０）
および３−α−ヒドロキシステロイドが挙げられる。 【００５２】これらの酸化還元反応に使用する酵素量
は、酵素力価、基質の種類および補酵素サイクリング率
によつて異なる。基質量は、１サイクル毎に１モル比の
基質を消費してなるもので、サイクリングする補酵素よ
り比較にならない程はるかに多いモル量が使用されるの
で、通常単位時間当たりのサイクル数および反応時間に
基いて決定すればよい。また、その酸化還元酵素の反応
速度が最大を示すような濃度以上であればよい。通常は
０．１ｍＭないし１００ｍＭ濃度範囲で存在し得る。 【００５３】還元型ＮＡＤを補酵素とする反応系として
は、少なくとも還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成す
る作用物質（Ｅ2 ）およびその基質（Ｓ2 ）の反応系が
挙げられ、その作用物質の反応系としては、少なくとも
還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成する酸化還元酵素
およびその基質の反応系や、電子伝達物質およびテトラ
ゾリウム塩の反応系が挙げられる。 【００５４】補酵素サイクリング反応系 （ａ）ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系； （ｂ）ＮＡＤＨを補酵素とする転移反応系； ＮＨ3 ：アンモニアの正１価のアンモニウムイオンをふ
がんする。 【００５５】Ｅ1 ：ＮＡＤおよびＳ1 を基質として消
費して、還元型ＮＡＤおよびＰ1を生成する反応を触媒
するデヒロゲナーゼ Ｅ2 ：還元型ＮＡＤおよびＳ2 を消費して、ＮＡＤお
よびＰ2 を生成する反応を触媒する作用物質 Ｓ1 ：Ｅ1 の還元型基質 Ｓ2 ：Ｅ2 の酸化型基質 Ｐ1 ：Ｓ1 の酸化生成物 Ｐ2 ：Ｓ2 の還元生成物 ＮＨ3 を利用する場合の反応系を式で示すと以下の通り
である。 【００５６】 【化１４】 【００５７】還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成する
酸化還元酵素としては、少なくとも還元型ＮＡＤを補酵
素とし、過剰量用いる特定の基質（Ｓ2 ）に作用してＮ
ＡＤおよびＳ2 の還元型生成物（Ｐ2 ）を生成するデヒ
ロゲナーゼ、または少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素と
し、チトクローム、ジスルフイド化合物、キノンおよび
その類縁体等を受容体とする還元型ＮＡＤ：受容体酸化
還元酵素であればそのいずれでも良く、その起源も限定
されることはない。これらの酵素およびその基質または
受容体の例としては、「酵素ハンドブツク」に記載され
ている。 【００５８】デヒドロゲナーゼおよびその基質の例とし
ては、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．
１．２７）およびピルビン酸、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ．１．１．１）およびアセトアルデヒド、グ
リセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．６）
およびジヒドロキシアセトンが挙げられる。またＮＡＤ
Ｈ：受容体酸化還元酵素としては、チトクロームｂ5 レ
ダクターゼ（ＥＣ．１．６．２．２）、ジアホラーゼ
（ＥＣ．１．６．４．３）などが挙げられる。受容体と
しては、メチレン・ブルー、フラビン類、キノン類、
２，６−ジクロロフエノールインドフエノールなどが挙
げられる。 【００５９】還元型ＮＡＤ：受容体酸化還元酵素および
受容体の組合せは、還元型ＮＡＤを補酵素としてなる酵
素および電子受容体となり得るものであれば特に限定さ
れない。好ましい組合せとしては、ジアホラーゼ（Ｅ
Ｃ．１．６．４．３）およびテトラゾリウム塩、および
メチレン・ブルー、ＮＡＤデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．
１．６．９９．３）およびチトクロームＣ等が挙げられ
る、使用濃度は通常０．０５〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で
存在し得る。テトラゾリウム塩の使用濃度は、テトラゾ
リウム塩および究極的に形成されるホルマザンの双方の
水溶性がむしろ限定されるが、通常は試薬１ｍｌ当たり
１μｇから１００μｇの温度範囲で存在し得る。 【００６０】電子伝達物質としては、還元型ＮＡＤをＮ
ＡＤに酸化する能力を有し、しかも補酵素サイクリング
反応に悪影響を及ぼさないような物質、例えばフエナシ
ンメタルサルフエート、メルドーラ・ブルー、ピロシア
ニン等が挙げられる。使用濃度は、サイクリング率に応
じて設定すればよいが、通常反応液Ｉ １ｍｌ当たり５
μｇ〜０．５ｍｌ濃度範囲で存在し得る。 【００６１】上記のサイクリング反応は、通常室温ない
し３７℃付近の温度、好ましくは３０〜３７℃の温度で
行われる。反応時間は、特に限定されるものでなく、通
常１分以上、好ましくは５分以上行えばよい。予定され
た時間の終わりで反応を迅速に停止するには、酸例えば
塩酸、リン酸などを添加することにより行われる。サイ
クリング反応を行つた後、このサイクリング反応におい
て消費または生成される部分を定量するのであるが、生
成する部分としてはＥ1 の還元型基質（Ｓ 1 ）の酸化生
成物（Ｐ1 ）またはＥ2 の酸化型基質（Ｓ2 ）の還元生
成物（Ｐ2）を対象とすればよく、消費される部分とし
てはＥ1 の還元型基質（Ｓ1 ）またはＥ2 の酸化型基質
（Ｓ2 ）を対象とすればよく、これらのＰ1 、Ｐ2 、Ｓ
1 、Ｓ2 のいずれか１つの成分の量を定量すればよい。
簡単には、基質の状態では無色であり、生成物の状態に
て呈色または蛍光を呈する吸光波長を変化する場合の生
成物の定量手段を用いることである。例えばテトラゾリ
ウム塩を基質（Ｓ2 ）として、生成するホルマザンを還
元生成物（Ｐ2 ）とせしめて、このホルマリンを比色定
量してなるものである。さらにフラビン類やキノン類を
基質（Ｓ2 ）として用いた場合には、それらの基質（Ｓ
2 ）の消費量をその特有の吸光波長に基いて吸光度測定
して定量すればよい。 【００６２】上記反応において、テトラゾリウム塩から
形成されるホルマザンの沈澱の防止を助けるために界面
活性剤を添加することが好ましい。界面活性剤として
は、トリトンＸ−１００、アデカトールＳＯ−１４５な
どの非イオン界面活性剤が挙げられる。使用濃度は試薬
に対し、０．０１〜３％の濃度範囲で存在し得る。この
界面活性剤の添加により、測定値の上昇とホルマザンの
色素の安定化をはかることができる。 【００６３】生じたホルマザン色素の比色定量は、ホル
マザンの特異的吸光波長にて吸光度（ＯＤ）を測定すれ
ばよく、例えば５００〜５５０ｎｍの波長により吸光度
を測定して、被測定物質の定量を行うことができる。本
発明によれば、エンド・ポイント法だけでなく、レイト
法、ドライケミカル法（フイルム法、固定化法）も可能
である。 【００６４】 【発明の実施態様】次いで、本発明の実施例を挙げて具
体的に述べるが、本発明はこれによつて何ら限定される
ものではない。 【００６５】 【参考例１】 製法 ５０リットル容ジャーにペプトン１％、グルコース０．
５％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．０５％、ＮａＣｌ ０．０５
％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％を含む液体培地
（ｐＨ７．６）４０リットルを仕込み、１２０℃、２０
分間滅菌後、上記と同一組成の培地で予備培養したバチ
ルス・ステアロサーモフイラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｈ−８０４の種
菌２００ｍｌを接種し、６０℃で１０時間、通気量４０
リットル／ｍｉｎ、攪拌速度１５０ｒ．ｐ．ｍ．で通気
培養した。培養後遠心分離にて集菌し、菌体を０．１％
リゾチームを含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）５００ｍｌに分散させ、３７℃で３０分間反応
を行い、溶菌した。 【００６６】この液を５０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間
遠心し、上清液４５０ｍｌを得た。この上清液に硫安を
添加し硫安分画（０．５〜０．７１飽和）を行い、この
沈澱を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液５０ｍｌに溶解（２／
Ｕ）し、この緩衝液５リットルに対して透析した。この
透析物中に生じた不溶物を遠心分離（１５０００ｒ．
ｐ．ｍ．、１０分間）にて除去した。上清液（２０Ｕ）
を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＤ
ＥＡＥ−セフアロースＣＬ−６Ｂカラム（２５×５ｃ
ｍ）にチャージし、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配
法にて溶出した。０．２５〜０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出
される画分を集め（８０ｍｌ、１６．５Ｕ）アミコン社
製セントリフローメンブランコーンＣＦ２５を用い濃縮
した後、セフアデツクスＧ−１００（３．６×８０ｃ
ｍ）にて精製を行い、その活性画分を集め、精製標品
（５０ｍｌ、１４Ｕ）とした。 【００６７】 【実施例１】 検体中のＡＴＰの測定 反応液Ｉ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．０５％ 牛血清アルブミン １ｍＭ デアミノ−ＮＡＤ ５０ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １００ｍＵ 本発明ＮＡＤ合成酵素／ｍｌ 反応液ＩＩ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０Ｕ ジアホラーゼ（旭化成社製、バチルス菌由来） ３％ エタノール １０Ｕ アルコールデヒドロゲナーゼ（東洋紡績社製、
イースト菌由来） ０．０２５％ ニトロテトラゾリウムブルー ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １５ｍＭ ＥＤＴＡ 反応液Ｉ ０．３ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温
後０、１０、２０、３０、４０μＭのＡＴＰ溶液をそれ
ぞれ５μｌ添加し、３７℃で１０分間反応した後、反応
液ＩＩを０．７ｍｌ添加し、３７℃で正確に５分間反応
したのち、０．１Ｎ ＨＣｌ ２．０ｍｌを加えて反応
を停止し、５５０ｎｍで吸光度測定した。その結果は、
図５に示す通りで良好な直線性が得られた。 【００６８】 【実施例２】 アンモニウムイオンの測定 実施例１に示した反応系Ｉ中の５０ｍＭ（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 の代わりに５ｍＭＡＴＰを添加した反応液に０、
５、１０、１５、２０μＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ 4 溶液を
５μｌ添加し、実施例２と同様の操作を行った。その結
果は、図６に示す通りで良好な直線性が得られた。 【００６９】 【実施例３】クレアチニンの測定 反応液Ｉ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＡＴＰ ０．０５％ 牛血清アルブミン １ｍＭ デアミノ−ＮＡＤ ２０Ｕ／ｍｌ クレアチニンデイミナーゼ（コダック社
製） １００ｍＵ／ｍｌ 本発明ＮＡＤ合成酵素 反応液Ｉ ０．３ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温
後１、２、３、４ｍｇ／ｄｌのクレアチニン溶液を１０
μｌ添加し、実施例２と同様の操作を行った。その結果
は、図７に示す通りで良好な直線性が得られた。 【００７０】 【実施例４】 アンモニウムイオンの測定法 ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＡＴＰ ０．０５％ 牛血清アルブミン １ｍＭ デアミノ−ＮＡＤ １００ｍＵ／ｍｌ 本発明ＮＡＤ合成酵素 上記反応液１ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温後
０、２５、５０、１００ｍＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 溶液
をそれぞれ１０μｌ添加し、３７℃で２０分間反応した
後に３４０ｎｍで吸光度測定した。その結果は、図８に
示す通りで良好な直線性が得られた。 【００７１】 【実施例５】 生成したＡＭＰの測定 反応液Ｉ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＡＴＰ ０．０５％ 牛血清アルブミン ０．０５％ トリトンＸ−１００ １ｍＭ デアミド−ＮＡＤ １０Ｕ／ｍｌ ミオキナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製 バチル
ス菌由来） １０Ｕ／ｍｌ ピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製
バチルス菌由来） １０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸 １００ｍＵ／ｍｌ 本発明ＮＡＤ合成酵素 反応液ＩＩ ５０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ８．０ １００ｍＵ／ｍｌ ピルビン酸オキシダーゼ（Ｓｉｇｍ
ａ社製 ベデイオコツカス菌由来） １００ｍＵ／ｍｌ ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社
製） ０．２％ フエノール ０．３％ ４−アミノアンチピリン 上記反応液Ｉ １ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温
後０、０．５、１．０、１．５、２０ｍＭの（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 溶液をそれぞれ１０μｌ添加し、３７℃で３０
分間反応した後に反応液ＩＩを０．１ｍｌ添加し、３７
℃、３０分間反応した後に５００ｎｍで吸光度測定し
た。その結果は、図９に示す通りで良好な直線性が得ら
れた。 【００７２】 【実施例６】 デアミド−ＮＡＤの測定法 反応液 ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．０５％ 牛血清アルブミン ５０ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｍＭ ＡＴＰ １００ｍＵ／ｍｌ 本発明ＮＡＤ合成酵素 ３％ エタノール １０Ｕ アルコールデヒドロゲナーゼ ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ 反応液１ｍｌを小試験管にとり、３７℃に加温後０、
２．５、５、１０ｍＭのデアミド−ＮＡＤ溶液をそれぞ
れ１０μｌ添加し、３７℃で３０分間反応した後に３４
０ｎｍで吸光度測定した。その結果は、図１０に示す通
りで良好な直線性が得られた。 【００７３】 【実施例７】 金属イオンの至適濃度 反応液Ｉ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＫＣｌ ０．０５％ 牛血清アルブミン ２ｍＭ ＡＴＰ ０．５ｍＭ デアミド−ＮＡＤ ２５ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 反応液ＩＩ ５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ １０Ｕ ジアホラーゼ１ｍｌ（旭化成社製 バチルス属
生産菌由来） ３％ エタノール １０Ｕ アルコールデヒドロゲナーゼ／ｍｌ（東洋紡績
社製 イースト菌由来） ０．０２５％ ＮＴＢ（ニトロテトラゾリウムブルー） ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名） １０ｍＭ ＥＤＴＡ 反応液ＩにそれぞれＭｇＣｌ2 ０．２５ｍＭ、０．５０
ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍ
Ｍ、ＭｎＣｌ2 ０．２５ｍＭ、０．５０ｍＭ、０．７５
ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ添加し、それぞ
れ、酵素活性測定法に従って活性を測定し、その相対活
性を、ＭｇＣｌ2 添加区を図１１、ＭｎＣｌ2 添加区を
図１２に示す。その結果、ＭｎＣｌ2 添加区においては
３ｍＭで至適濃度を示した。 【００７４】 【発明の効果】本発明は、本発明ＮＡＤ合成酵素を用い
て被検液中のＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよびアンモニ
アまたはアンモニウムイオンのいずれか１つの成分の定
量に利用できるもので、特に被検液中のアミノ酸の影響
を受けることなくアンモニア（アンモニウムイオンも含
む）の測定を可能ならしめるものである。かつ好ましい
態様としての本発明ＮＡＤ合成酵素の熱安定性において
６０℃まで安定であるとの耐熱性酵素である点からも前
記の各種の分析において有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明ＮＡＤ合成酵素の至適ｐＨ曲線である。
【図２】本発明ＮＡＤ合成酵素のｐＨ安定曲線である。
【図３】本発明ＮＡＤ合成酵素の熱安定曲線である。
【図４】本発明ＮＡＤ合成酵素の至適温度曲線である。
【図５】本発明におけるＡＴＰの定量曲線である。
【図６】５５０ｎｍの吸光度測定によるアンモニアの定
量曲線である。 【図７】クレアチニンの定量曲線である。 【図８】３４０ｎｍの吸光度測定によるアンモニアの定
量曲線である。 【図９】生成したＡＭＰを測定することによるアンモニ
アの定量曲線である。 【図１０】デアミド−ＮＡＤの定量曲線である。 【図１１】ＭｇＣｌ2 添加濃度に対する至適添加曲線で
ある。 【図１２】ＭｎＣｌ2 添加濃度に対する至適添加曲線で
ある。
量曲線である。 【図７】クレアチニンの定量曲線である。 【図８】３４０ｎｍの吸光度測定によるアンモニアの定
量曲線である。 【図９】生成したＡＭＰを測定することによるアンモニ
アの定量曲線である。 【図１０】デアミド−ＮＡＤの定量曲線である。 【図１１】ＭｇＣｌ2 添加濃度に対する至適添加曲線で
ある。 【図１２】ＭｎＣｌ2 添加濃度に対する至適添加曲線で
ある。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １． 被検液中のＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよびア
ンモニアまたはアンモニウムイオンのいずれか１つを測
定するに当たり、少なくともＭｇ++イオンまたはＭｎ++
イオンの存在下、下記の式（ａ）の酵素反応を触媒し、
Ｍｇ ++イオンの存在下、下記の式（ｂ）の酵素反応を触
媒せず、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオン
を基質として利用し、かつ少なくともグルタミンおよび
アスパラギンを基質として利用しないＮＡＤ合成酵素
を、被検液に作用せしめ、次いで反応において消費され
た成分または生成された成分を測定することを特徴とす
るＡＴＰ、デアミド−ＮＡＤおよびアンモニアまたはア
ンモニウムイオンのいずれか１つの成分を測定する被検
液中の成分の測定法。 【化１】 ２．生成された成分を測定することにおいて、生成した
ＮＡＤを測定してなる請求項１に記載の測定法。 ３．生成したＮＡＤの測定が、ＮＡＤを補酵素とする酸
化還元酵素およびその還元型基質の存在下反応せしめ、
生ずる還元型ＮＡＤを測定してなる請求項２に記載の測
定法。 ４．生成したＮＡＤを測定することにおいて、ＮＡＤを
補酵素とする酸化還元反応系と還元型ＮＡＤを補酵素と
する酸化還元反応系との組合せによつて補酵素サイクリ
ング反応を行い、そのサイクリング反応により消費また
は生成された成分を定量してなる請求項２に記載の測定
法。 ５．ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系が、ＮＡＤを
消費して還元型ＮＡＤを生成するデヒドロゲナーゼおよ
びその基質による酵素反応系である請求項４に記載の測
定法。 ６．デヒドロゲナーゼおよびその基質が、ラクテートデ
ヒドロゲナーゼおよびＬ−ラクテート、アルコールデヒ
ドロゲナーゼおよびエタノール、グリセロールデヒドロ
ゲナーゼおよびグリセロール、グリセロール−３−ホス
フエートデヒドロゲナーゼおよびグリセロール−３−ホ
スフエート、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコ
ース、マレートデヒドロゲナーゼおよびＬ−マレート、
グルタメートデヒドロゲナーゼおよびＬ−グルタメー
ト、３−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼお
よび３−α−ヒドロキシステロイドのいずれかである請
求項５に記載の測定法。 ７．還元型ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系が、還
元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成する酸化還元酵素お
よびその基質による酵素反応系である請求項４記載の測
定法。 ８．酸化還元酵素およびその基質が、ラクテートデヒド
ロゲナーゼおよびピルビン酸、アルコールデヒドロゲナ
ーゼおよびアセトアルデヒド、グリセロールデヒドロゲ
ナーゼおよびジヒドロキシアセトン、グリセロール−３
−ホスフエートデヒドロゲナーゼおよびジヒドロキシア
セトンホスフエート、マレートデヒドロゲナーゼおよび
オギザロ酢酸、３−α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼおよび３−ケトステロイドのいずれかである請
求項７に記載の測定法。 ９．酸化還元酵素およびその基質が、還元型ＮＡＤ：受
容体酸化還元酵素およびその受容体である請求項７に記
載の測定法。 １０．還元型ＮＡＤ：受容体酸化還元酵素およびその受
容体が還元型ＮＡＤデヒドロゲナーゼおよびフラビン
類、キノン類、２，６−ジクロロフエノールインドフエ
ノール、フエリシアン化塩、テトラゾリウム塩、チトク
ロームＣまたは酸素である請求項９に記載の測定法。 １１．酸化還元酵素およびその基質が、ジアホラーゼお
よびテトラゾリウム塩またはレザズリンである請求項７
に記載の測定法。 １２．還元型ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系が電
子伝達物質およびテトラゾリウム塩による反応系である
請求項４に記載の測定法。 １３．電子伝達物質がフエナジン−メタサルフエート、
メルドーラ・ブルーまたはピロシアニンである請求項１
２に記載の測定法。 １４．生成された成分を測定することにおいて、生成さ
れたＡＭＰを測定してなる請求項１に記載の測定法。 １５．ＡＭＰの測定が、ＡＴＰ存在下、アデニレイトキ
ナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナー
ゼ存在下、生じたピルビン酸を測定してなる請求項１４
に記載の測定法。 １６．ピルビン酸の測定が、ピルビン酸オキシダーゼを
作用せしめ、生じたＨ2 Ｏ2 を測定してなる請求項１５
に記載の測定法。 １７．ピルビン酸の測定が、ＮＡＤＨ存在下、乳酸デヒ
ドロゲナーゼを作用せしめ、減少するＮＡＤＨの量を測
定してなる請求項１５に記載の測定法。
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2678155B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002025262A1 (fr) | 2000-09-25 | 2002-03-28 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Electrode a enzyme |
-
1996
- 1996-07-29 JP JP8198737A patent/JP2678155B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08336397A (ja) | 1996-12-24 |
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