CN114739936A - 一种酶法快速检测2’-岩藻糖基乳糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酶法快速检测2’‑岩藻糖基乳糖的方法，属于食品检测技术领域。本发明将不同浓度的2’‑岩藻糖基乳糖标准品与α1,2‑岩藻糖苷酶在磷酸缓冲液中反应后，加入L‑岩藻糖脱氢酶和NADP+，在340 nm下测量溶液的吸光度，得到2’‑岩藻糖基乳糖浓度和吸光度的标准曲线；按照上述方法测量待测样品吸光度，根据标准曲线，得出样品中2’‑岩藻糖基乳糖的含量。本申请的检测方法使得所有2’‑岩藻糖基乳糖能够同步进行转化，提高检测的准确性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及一种酶法快速检测2’-岩藻糖基乳糖的方法。
背景技术
母乳低聚糖是母乳中仅次于乳糖和脂质的物质，在母乳中的含量约为15%。现有的研究表明，母乳低聚糖对新生儿有许多重要的影响：①母乳低聚糖可以防止病原体附着在婴儿粘膜表面，降低病毒、细菌和原生动物寄生虫感染的风险；②母乳低聚糖可以降低婴儿腹泻的频率；③母乳低聚糖可以为婴儿提供大脑发育和认知的必需营养素。
2’-岩藻糖基乳糖是众多母乳低聚糖中结构最简单但含量最丰富的一种。研究表明，2’-岩藻糖基乳糖的含量变化影响母乳对婴儿的有益作用，低2’-岩藻糖基乳糖含量的母乳会导致婴儿更容易发生腹泻。因此，检测各种样本中2’-岩藻糖基乳糖的含量是非常重要的，同时对2’-岩藻糖基乳糖的检测在其工业生产中也有重要意义。
目前，2’-岩藻糖基乳糖的定量测定方法有高效液相色谱法、超高效液相色谱法-荧光检测法(UHPLC-FLD)、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)、多孔石墨化碳液相色谱-质谱/质谱(PCG-LC-MS/MS)、毛细管电泳-电喷雾电离-质谱/质谱(CE-ESI-MS/MS)、高效阴离子交换色谱-脉冲电化学检测法(HPAEC-PAD)等。而上述检测方法均使用精密仪器设备，成本较高，并且检测步骤复杂，所用时间长。因此，需要提供一种简单、快速检测2’-岩藻糖基乳糖的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种酶法快速检测2’-岩藻糖基乳糖的方法，具有操作简单，灵敏度高、准确率高的特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种酶法快速检测2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括以下步骤：配置不同浓度的2’-岩藻糖基乳糖标准品，将所述标准品与α1,2-岩藻糖苷酶在磷酸缓冲液中反应后，加入L-岩藻糖脱氢酶和NADP+，在340 nm下测量溶液的吸光度，得到2’-岩藻糖基乳糖浓度和吸光度的标准曲线；按照上述方法测量待测样品在340 nm的吸光度，根据所述标准曲线，得出样品中2’-岩藻糖基乳糖的含量。
优选的，所述α1,2-岩藻糖苷酶的终浓度为0.2~0.8 mg/mL。
优选的，所述磷酸缓冲液的pH值为6.5~7.5。
优选的，所述标准品与α1,2-岩藻糖苷酶反应的温度为35~40℃，时间为50~70min。
优选的，所述L-岩藻糖脱氢酶的终浓度为0.2~0.8 mg/mL。
优选的，所述NADP+的终浓度为10~20mM。
优选的，所述α1,2-岩藻糖苷酶和所述L-岩藻糖脱氢酶的制备方法包括：将α1,2-岩藻糖苷酶和L-岩藻糖脱氢酶基因序列分别整合至表达载体pET-30a(+)中，转化至大肠杆菌中得到BL21star-α1,2-FUC和BL21star-FucDH重组菌；分别培养所述重组菌表达所述α1,2-岩藻糖苷酶和L-岩藻糖脱氢酶。
优选的，所述培养过程中，当培养液OD600达到0.5时，添加0.05~0.13 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，BL21star-α1,2-FUC重组菌于18~22℃诱导3~5h，BL21star-FucDH重组菌于14~17℃诱导10~13h。
优选的，所述待测样品包括奶粉、液态奶、发酵液、洗脱液。
本发明还提供了一种快速检测2’-岩藻糖基乳糖的试剂盒，包括α1,2-岩藻糖苷酶、L-岩藻糖脱氢酶、NADP+、磷酸缓冲液和2’-岩藻糖基乳糖标准品。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明采用分步酶解的方法对2’-岩藻糖基乳糖进行分解，先加入α1,2-岩藻糖苷酶，将2’-岩藻糖基乳糖裂解为D-乳糖和L-岩藻糖，加入L-岩藻糖脱氢酶后，L-岩藻糖在NADP+存在下被氧化为L-岩藻糖-1,5-lac-tone，形成还原的NADPH，生成的NADPH与L-岩藻糖的量是化学计量的，并且可以测量为在340 nm处吸光度的增加，根据已知浓度2’-岩藻糖基乳糖标准品和340 nm吸光度得到标准曲线。样品采用本发明分步酶解的方法可得到340nm吸光度，根据标准曲线可得到样品中2’-岩藻糖基乳糖的含量。本发明的检测方法使得所有2’-岩藻糖基乳糖能够同步进行转化，使得准确性和灵敏度更高。
附图说明
图1为实施例1中α1,2-岩藻糖苷酶和L-岩藻糖脱氢酶的SDS-PAGE结果；其中1为FucDH上清，2为FucDH沉淀，3为α1,2-FUC上清，4为α1,2-FUC沉淀，M为Maker；
图2为本发明测量2’-岩藻糖基乳糖的标准曲线；
图3为一锅法测量2’-岩藻糖基乳糖的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种酶法快速检测2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括以下步骤：配置不同浓度的2’-岩藻糖基乳糖标准品，将所述标准品与α1,2-岩藻糖苷酶在磷酸缓冲液中反应后，加入L-岩藻糖脱氢酶和NADP+，在340 nm下测量溶液的吸光度，得到2’-岩藻糖基乳糖浓度和吸光度的标准曲线；按照上述方法测量待测样品在340 nm的吸光度，根据所述标准曲线，得出样品中2’-岩藻糖基乳糖的含量。
在本发明中，所述α1,2-岩藻糖苷酶的终浓度优选为0.2~0.8mg/mL，更优选为0.5mg/mL；所述磷酸缓冲液的pH值优选为6.5~7.5，更优选为7.0；所述标准品与α1,2-岩藻糖苷酶反应的温度优选为35~40℃，更优选为37℃，时间优选为50~70min，更优选为60min；所述L-岩藻糖脱氢酶的终浓度优选为0.2~0.8 mg/mL，更优选为0.5 mg/mL；所述NADP+的终浓度优选为10~20mM，更优选为15mM。上述所涉及的浓度为在溶液中的最终浓度。
本发明优选在加入L-岩藻糖脱氢酶和NADP+反应5~10min后测量340 nm下的吸光度，能降低NADPH分解对结果造成的影响，使得准确性和灵敏度更高。
在本发明中，对所述α1,2-岩藻糖苷酶和所述L-岩藻糖脱氢酶的来源没有特殊限定，采用本领域市售产品即可。作为一种可实施方式，所述α1,2-岩藻糖苷酶和所述L-岩藻糖脱氢酶的制备方法包括：将α1,2-岩藻糖苷酶和L-岩藻糖脱氢酶基因序列分别整合至表达载体pET-30a(+)中，转化至大肠杆菌中得到BL21star-α1,2-FUC和BL21star-FucDH重组菌；分别培养所述重组菌表达所述α1,2-岩藻糖苷酶和L-岩藻糖脱氢酶。
在本发明中，所述培养过程中，优选当培养液OD600优选达到0.5时，添加0.05~0.13 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，BL21star-α1,2-FUC重组菌优选于18~22℃诱导3~5h，更优选于20℃诱导4h，BL21star-FucDH重组菌优选于14~17℃诱导10~13h，更优选于16℃诱导12h。所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的添加量更优选为0.1 mM。
在本发明中，所述待测样品优选包括奶粉、液态奶、发酵液、洗脱液。本发明优选对待测样品进行稀释，使样品中2’-岩藻糖基乳糖的浓度优选达到0.1 mM ~10 mM。
本发明还提供了一种快速检测2’-岩藻糖基乳糖的试剂盒，包括α1,2-岩藻糖苷酶、L-岩藻糖脱氢酶、NADP+、磷酸缓冲液和2’-岩藻糖基乳糖标准品。
在本发明中，所述α1,2-岩藻糖苷酶使用时的最终浓度优选为0.2~0.8 mg/mL，更优选为0.5 mg/mL，所述L-岩藻糖脱氢酶使用的最终浓度优选为0.2~0.8 mg/mL，更优选为0.5 mg/mL，所述NADP+的使用最终浓度优选为10~20mM，更优选为15mM，所述磷酸缓冲液的pH值优选为6.5~7.5，更优选为7.0。
本发明对未提及原料的来源没有特殊限定，采用本领域市售商品即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在下文中，2’-FL为2’-岩藻糖基乳糖，α1,2-FUC为α1,2-岩藻糖苷酶，FucDH为L-岩藻糖脱氢酶。
实施例1
α1,2-FUC和FucDH的制备
（1）将α1,2-FUC(GenBank: CAYP010000040.1)和FucDH(GenBank: CP026511.1)的序列整合到pET-30a(+)表达载体(安诺伦，麦迪逊市，威斯康星州，美国，货号69909-3CN)上T7启动子下游，得到pET-30a（+）-α1,2-FUC和pET-30a（+）-FucDH质粒，分别转化至大肠杆菌中得到BL21star-α1,2-FUC和BL21star-FucDH重组菌。
（2）将BL21star-α1,2-FUC和BL21star-FucDH重组菌在Luria贝尔塔尼(LB)肉汤(1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠)或补充适当抗生素(50μg/ml)的琼脂中于37°C下生长。
（3）经测序证实后，在T7启动子控制下，将每个含有插入的α 1，2-FUC或FucDH基因的重组质粒转化到大肠杆菌BL21star(DE3)化学平衡细胞中。从含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB琼脂平板上挑选转化体，并在含有50 mL含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培养基中于37℃以200 rpm振荡培养。
（4）当培养基OD600达到接近0.5时，添加0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，BL21star-α1,2-FUC重组菌于20℃诱导4h，BL21star-FucDH重组菌于16℃诱导12h。离心收集细胞，测定其浓度，通过稀释将浓度调节至7的OD600（OD600 of 7）。
（5）将细胞重新悬浮在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，使用超声波处理器破碎(在冰上1s ON/3s OFF共1 min)，然后收集总蛋白部分。以13000 rpm转速在4°C下离心20 min后，分别收集上清液(可溶性部分)和沉淀(不溶性部分)，将上清液分离得到α1,2-FUC和FucDH。通过SDS-PAGE和western blotting评估收集的α1,2-FUC和FucDH。
由图1可知，α1,2-FUC和FucDH都在工程菌中得到了表达，并且具有较高的表达量。并且本发明的方法相比现有制备α1,2-FUC和FucDH的方法，提取方法更容易，并能提高对2’-FL含量的检测效果。
实施例2
分步酶解标准曲线的绘制
（1）配置浓度为0、1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM的2’-FL标准品。
（2）将2’-FL标准品溶液与α1,2-FUC在磷酸缓冲液（pH 7.0）混合，于37℃下反应60min，具体用量如表1所示。α1,2-FUC的最终浓度为0.2mg/mL。
表1 分步法α1,2-FUC的反应混合物组分
（3）加入50ul FucDH（FucDH终浓度为0.2mg/mL）和20ul浓度15mM的NADP+，于37℃条件下继续反应5-10min，立刻使用酶标仪(SpectraMax M2；森尼韦尔市，加利福尼亚州，美国)在340 nm下测量吸光度，结果如表2所示。
表2 分步法检测2’-FL标准品浓度的吸光度结果
根据表2的结果，绘制、得到标准曲线：y=0.3393x+0.5752，R2=0.998，其中，x为2’-FL浓度，y为吸光度。
对比例1
一锅法酶解标准曲线的绘制
（1）配置浓度为0、1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM的2’-FL标准品。
（2）将2’-FL标准品溶液与α1,2-FUC、FucDH、NADP+、磷酸缓冲液（pH 7.0）混合，于37℃下反应60min，具体用量如表3所示。
表3 一锅法反应混合物组分
（3）在340 nm下测量吸光度，吸光度结果如表4所示。
表4 一锅法检测2’-FL标准品浓度的吸光度结果
根据表4的结果，绘制、得到标准曲线：y=0.2624x+0.5491，R2=0.9677，其中，x为2’-FL浓度，y为吸光度。
根据分步法、一锅法得到的标准曲线可知，本发明分步酶解得到的标准曲线相对于一锅法拟合优度、灵敏度更高。
实验例1
模拟发酵液中2’-FL浓度的测定
在模拟发酵液（LB培养基）（稀释倍数：200微升检测反应液中加60微升）中添加含量已知的2’-FL，分别采用实施例1步骤（2）-（3）和对比例1步骤（2）-（3）的反应方法，测量在340 nm下的吸光度，通过各自的标准曲线，计算2’-FL的浓度，具体结果见表5。
表5 模拟发酵液中的2’-FL浓度的结果
根据表5可知，本发明分步酶解相对于一锅法检测模拟发酵液中2’-FL浓度的偏差更小，准确度更高。
实验例2
模拟洗脱液中2’-FL浓度的测定
在模拟洗脱液（10%的乙醇中含有1mM-1000mM的盐酸或者硫酸）（稀释倍数：200微升检测反应液中加60微升）中添加已知含量的2’-FL，分别采用实施例1步骤（2）-（3）和对比例1步骤（2）-（3）的反应方法，测量在340 nm下的吸光度，通过各自的标准曲线，计算2’-FL的浓度，具体结果见表6。
表6 模拟洗脱液中的2’-FL浓度的结果
由表6可知，本发明分步酶解相对于一锅法检测模拟洗脱液中2’-FL浓度的偏差更小，准确度更高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种酶法快速检测2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
配置不同浓度的2’-岩藻糖基乳糖标准品，将所述标准品与α1,2-岩藻糖苷酶在磷酸缓冲液中反应后，加入L-岩藻糖脱氢酶和NADP+，在340 nm下测量溶液的吸光度，得到2’-岩藻糖基乳糖浓度和吸光度的标准曲线；
按照上述方法测量待测样品在340 nm的吸光度，根据所述标准曲线，得出样品中2’-岩藻糖基乳糖的含量；
所述待测样品包括奶粉、液态奶、发酵液、洗脱液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α1,2-岩藻糖苷酶的终浓度为0.2~0.8mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的pH值为6.5~7.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准品与α1,2-岩藻糖苷酶反应的温度为35~40℃，时间为50~70min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-岩藻糖脱氢酶的终浓度为0.2~0.8mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NADP+的终浓度为10~20mM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α1,2-岩藻糖苷酶和所述L-岩藻糖脱氢酶的制备方法包括：
将α1,2-岩藻糖苷酶和L-岩藻糖脱氢酶基因序列分别整合至表达载体pET-30a(+)中，转化至大肠杆菌中得到BL21star-α1,2-FUC和BL21star-FucDH重组菌；分别培养所述重组菌表达所述α1,2-岩藻糖苷酶和L-岩藻糖脱氢酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养过程中，当培养液OD600达到0.5时，添加0.05~0.13 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，BL21star-α1,2-FUC重组菌于18~22℃诱导3~5h，BL21star-FucDH重组菌于14~17℃诱导10~13h。
9.一种快速检测2’-岩藻糖基乳糖的试剂盒，其特征在于，包括α1,2-岩藻糖苷酶、L-岩藻糖脱氢酶、NADP+、磷酸缓冲液和2’-岩藻糖基乳糖标准品。
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| US5260197A (en) * | 1988-09-21 | 1993-11-09 | Noda Institute For Scientific Research | L-fucose dehydrogenase, a process for production thereof, quantitative assay for L-fucose using said enzyme and a kit for quantitative assay |
| CN108531467A (zh) * | 2017-03-03 | 2018-09-14 | 复旦大学 | 一种核心岩藻糖苷酶及其制备和应用 |
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2022
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Patent Citations (2)
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