CN114634882A - 一种促进酵母生长和发酵的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进酵母生长和发酵的方法，包括促进酵母生长和细胞活性的方法以及促进酵母发酵性能的方法；其中，促进酵母生长和细胞活性的方法，包括以下步骤：步骤(1)配置培养基，添加小分子活性肽‑锌配合物；步骤(2)添加酵母菌种至培养基中培养；步骤(3)将培养后的菌悬液离心收集酵母泥，使用冰水悬浮法收集酵母菌体；本发明得出一种促进酵母生长和发酵的的方法，通过在增殖培养基或者发酵培养基中添加小分子活性肽‑锌配合物提高酵母的生长，活性和代谢能力，实现促进酵母生长代谢的目标。

Description

一种促进酵母生长和发酵的方法
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种促进酵母生长和发酵的方法。
背景技术
酵母是能发酵糖类的单细胞真菌，能够发酵糖类产生乙醇和二氧化碳，在啤酒，面包发酵行业得到广泛的应用。而在酵母生长过程中会营养物质的消耗，乙醇和二氧化碳等代谢产物的累积，使得酵母受到各种环境胁迫的影响，影响酵母的生长和代谢，不利于发酵工业的生产效率。酵母的增殖速度，代谢产物的速率和细胞活性对发酵过程中具有重要作用。目前常通过改善发酵条件，添加有效的氮源和碳源来提高酵母的生长和活性以期提高发酵能力。通过改善培养基的配方可以提高酵母的生长和细胞活性，代谢产生更多的乙醇和二氧化碳。
目前常用的营养添加剂有氮源，矿物元素和其他营养物质。常用的氮源添加物维多肽，多肽分子量给相对蛋白更小，溶解度更高，且具有一定抗氧化性，更有利于微生物的吸收和代谢，从而对微生物的生理进行调控作用。多肽作为有效的氮源，更有利于酵母吸收，小分子量的多肽可以提高酵母的生长和发酵速率。多肽的1-5％的多肽对酵母会有更好的促进作用，所需要的肽含量较高，成本相应增加。微量元素对微生物生长也具有重要的影响作用，钙离子，镁离子和锌离子等。微量元素不仅对酵母具有调控作用，而且酵母可以富集一部分的微量元素，通过微量酵母富集更有利于人体的吸收，具有两方面的好处。
目前常用的无机盐对价格低廉，但高浓度的微量元素对酵母具有毒害作用，不利于酵母的吸收。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种促进酵母生长和发酵的方法，以促酵母生长活性为目标，通过添加小分子的活性肽-锌配合物提高酵母的生长和代谢，从而提高酵母的增殖速率和发酵速率。
本发明的目的采用以下技术方案来实现：
第一方面，本发明公开了一种促进酵母生长和细胞活性的方法，包括以下步骤：
步骤(1)配置培养基，添加小分子活性肽-锌配合物；
步骤(2)添加酵母菌种至培养基中培养；
步骤(3)将培养后的菌悬液离心收集酵母泥，使用冰水悬浮法收集酵母菌体。
优选地，所述步骤(1)中，培养基的配方包括：葡萄糖、麦芽提取物、酵母提取物、蛋白胨和小分子活性肽-锌配合物。
优选地，所述步骤(1)中，将除小分子活性肽-锌配合物以外的成分进行配置并高温高压灭菌，小分子活性肽-锌配合物通过针式过滤器进行除菌，加入到培养基中。
优选地，所述步骤(2)中，加入的酵母菌种的OD660为0.04-0.05，培养温度为28℃，培养时间为96小时。
优选地，所述步骤(3)中，冰水悬浮法包括：取冰水倒入酵母泥中，搅拌使其重新悬浮，再次离心收集，弃上清液，重复两次后，得到酵母菌体。
第二方面，本发明公开了一种促进酵母发酵性能的方法，包括以下步骤：
步骤(4)配置麦芽糖培养基，并添加小分子活性肽-锌配合物；
步骤(5)调节pH，并恒温培养；
步骤(6)取培养后的培养基离心分离得到无细胞的发酵液，检测糖度和游离氨基氮的变化；接种步骤(4)制备的麦芽糖培养基与酵母菌种于坐式发酵管中，检测其产气量。
优选地，所述步骤(4)中，将麦芽糖浆用去离子水稀释至唐都为20°P，放置于121℃高压灭菌锅中灭菌15min，配制得到麦芽糖培养基。
优选地，所述步骤(4)中，在麦芽糖培养基中添加锌含量为20ug/mL的小分子活性肽-锌配合物。
优选地，所述步骤(5)中，调节pH6.5，在18℃恒温培养箱中培养6天。
优选地，所述步骤(6)中，加入的酵母菌种的OD660为0.04-0.05，发酵时间为72小时。
优选地，所述步骤(6)中，采用DNS测发酵液中的糖度，采用茚三酮法测定发酵液中的游离氨基氮的变化，采用坐式发酵管测定酵母的产气量。
优选地，所述小分子活性肽-锌配合物的制备过程为：
将花生粕用Alcalase、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行水解、超滤得到小分子活性大豆肽；将小分子活性大豆肽与硫酸锌溶液反应，透析离心得小分子活性肽-锌配合物。
优选地，所述小分子活性肽-锌配合物的具体反应步骤如下：
(1)取花生粕与蒸馏水按质量比1：10混合，按照花生粕质量0.5％的比例加入混合酶，混合酶包括质量比为1:1:1的Alcalase、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，在50℃条件下，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为8.0，酶解6h后，沸水浴10min，8000rpm离心20min取上清液，得到多肽溶液；
(2)取步骤(1)所得的多肽溶液进行超滤分离，采用3kDa的超滤膜进行超滤得到分子量小于3kDa的组分，冷冻干燥得到小分子活性肽固体粉末；
(3)取步骤(2)所得的小分子活性肽溶解于水溶液中，以肽锌质量比为4：1的比例与硫酸锌混合，在65℃，pH为5-6的条件下反应90min，反应结束后离心取上清液，用透析袋除去游离的锌离子，冷冻干燥得到固体粉末，即小分子活性肽-锌配合物。
本发明的有益效果为：
(1)本发明得出一种促进酵母生长和发酵的的方法，通过在增殖培养基或者发酵培养基中添加小分子活性肽-锌配合物提高酵母的生长，活性和代谢能力，实现促进酵母生长代谢的目标。
(2)本发明中肽含量低，因此成本低，小分子活性肽-锌配合物的作用强于目前常用的无机锌，对于工业化应用具有重要的意义。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1是本发明实施例1在7，14，21，24，40，48，60，72，96小时下的硫酸锌以及小分子活性肽-锌配合物浓度分别为5，10，20，40，60μg/ml下的吸光值；
图2是本发明实施例1添加小分子活性肽-锌配合物培养基与对照组的酵母生物量和活力值图；
图3是本发明实施例1添加小分子活性肽-锌配合物培养基与对照组的锌含量对比图；
图4是本发明实施例2培养得到的酵母的糖度与发酵时间的曲线；
图5是本发明实施例2培养得到的酵母的浓度与时间的曲线。
图6是本发明实施例2中不同方式制备的酵母的产气量对比图。
具体实施方式
为了更清楚的说明本发明，对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一种促进酵母生长和细胞活性的方法，包括以下步骤：
(1)小分子活性肽-锌配合物由本实验室制备而成，其分子量组成基本小于3kDa，锌配合率为14.13±0.582％，其DPPH抗氧化活性为83.16086±1.325％；
所述小分子活性肽-锌配合物的具体反应步骤如下：
S1.取花生粕与蒸馏水按质量比1：10混合，按照花生粕质量0.5％的比例加入混合酶，混合酶包括质量比为1:1:1的Alcalase、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，在50℃条件下，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为8.0，酶解6h后，沸水浴10min，8000rpm离心20min取上清液，得到多肽溶液；
S2.取多肽溶液进行超滤分离，采用3kDa的超滤膜进行超滤得到分子量小于3kDa的组分，冷冻干燥得到小分子活性肽固体粉末；
S3.取小分子活性肽溶解于水溶液中，以肽锌质量比为4：1的比例与硫酸锌混合，在65℃，pH为5-6的条件下反应90min，反应结束后离心取上清液，用透析袋除去游离的锌离子，冷冻干燥得到固体粉末，即小分子活性肽-锌配合物。
(2)取1％葡萄糖、0.3％麦芽提取物、0.3％酵母提取物和0.5％蛋白胨为原料，用去离子水进行搅拌混合溶解并高温灭菌，采用0.45微米的针式过滤器进行除菌，在培养基中添加10-80ug/mL小分子活性肽-锌配合物；
(3)取步骤(2)中的培养基，添加菌种为OD660为0.04-0.05，在28度，培养96小时；
(4)取步骤(3)中培养时间为7，14，21，24，40，48，60，72，96h的菌悬液，使用紫外分光光度计测定吸光值(见图1)；
(5)取步骤(4)中锌添加量为20ug/mL的肽-锌配合物得到的发酵后的菌悬液，使用离心机离心(3000rpm/min)收集酵母泥，取100ml的4℃冰水倒入酵母泥中，搅拌使其重新悬浮，再次离心收集，弃上清，重复两次得到菌体；
(6)取步骤(5)得到的酵母泥若干至50ml去离子水中，放入转子低速搅拌，插入pH计电极连续测定pH值。10min时记录(pH10)，同时加入葡萄糖(20％)2.5ml。继续搅拌10min，再次记录pH值(pH20)。并计算酵母活力(GIPE值)＝pH10-20，得到各种多肽配合物的酵母活力值图(见图2)；
(7)取步骤(5)得到菌体于称重瓶中，烘干至恒重，得到细胞的干重量(见图2)；
(8)取步骤(5)得到酵母泥1g于消化管中，用50％的硝酸加热消化至澄清透明，加入25ml水，0.8ml的指示剂，在沸水中加热16分钟，然后放入冰水中冷却。稀释酵母消化液，取25mL的样品溶液，加入5mLpH8.7的缓冲溶液，添加0.8mL 0.03％5-Br-PADAP,2mL20％的表面活性剂OP，在紫外分光光度计下(波长570mm)测定吸光值。通过标曲计算锌含量(见图3)；
(9)取步骤(5)得到的菌体于缓冲溶液中，采用细胞破碎法，离心得到细胞的粗酶液，采用酶联免疫法测定酵母细胞内的乙醇脱氢酶，Cu-Zn SOD酶和羧肽酶活力，见下表：
Figure BDA0003565459010000051
上表中能够看出，上述步骤的方法培养得到酵母在生长和活性都要一定的提高，在OD660上和细胞干重上有所增加。在细胞活性，细胞内酶活性和细胞内锌含量都有显著提高。
实施例2
一种促进酵母发酵性能的方法，包括以下步骤：
(1)将麦芽糖浆用去离子水稀释至20°P，放置高压灭菌锅中灭菌(121℃、15min)配制发酵液。采用0.45微米的针式过滤器进行除菌，在培养基中添加锌含量为20ug/mL的小分子活性肽-锌配合物
(2)取步骤(1)中的培养基，调节pH6.5，在18℃恒温培养箱中培养6天。
(3)取步骤(2)中培养时间为1，2，3，4，5，6天的菌悬液，用3000转离心力进行离心得到无细胞的发酵液；
(4)取步骤(3)中得到的发酵后的发酵液，用DNS法测定发酵液中的糖含量，取1ml稀释后的样品溶液加入15ml的试管内，加入2.0ml的3,5-二硝基水杨酸(DNS试剂)，沸水煮沸2min，冷却后加水至溶液为15ml。使用紫外分光光度计(波长540mm)测量样品溶液的吸光度，并绘制吸光值与发酵时间的曲线；(见图4)
(5)取步骤(3)中得到的发酵后的发酵液，取发酵液稀释100-200倍，取2mL样液，1mL发色剂，加玻璃珠，盖上螺帽，沸水浴16分钟，20度水浴20分钟，加入6mL稀释剂，充分混匀，用紫外分光光度计在570nm处测吸光值；(见图5)
(6)取步骤(1)中制备的培养液，接种酵母菌种于坐式发酵管中，发酵72小时，读取液面刻度，得到酵母的产气量；(见图6)
从图4～6能够看出，上述步骤得到培养的酵母的在发酵能力上得到一定的提高，糖含量消耗和游离氨基氮消耗量更多，二氧化碳产量增加。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种促进酵母生长和细胞活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)、配置培养基，添加小分子活性肽-锌配合物；
步骤(2)、添加酵母菌种至培养基中培养；
步骤(3)、将培养后的菌悬液离心收集酵母泥，使用冰水悬浮法收集酵母菌体。
2.一种促进酵母发酵性能的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(4)、配置麦芽糖培养基，并添加小分子活性肽-锌配合物；
步骤(5)、调节pH，并恒温培养；
步骤(6)、取培养后的培养基离心分离得到无细胞的发酵液，检测糖度和游离氨基氮的变化；接种步骤(4)制备的麦芽糖培养基与酵母菌种于坐式发酵管中，检测其产气量。
3.根据权利要求1所述的一种促进酵母生长和细胞活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：所述小分子活性肽-锌配合物的制备是将花生粕用Alcalase、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行水解、超滤得到小分子活性大豆肽；将小分子活性大豆肽与硫酸锌溶液反应，透析离心得小分子活性肽-锌配合物。
4.根据权利要求1所述的一种促进酵母生长和细胞活性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，培养基的配方包括：葡萄糖、麦芽提取物、酵母提取物、蛋白胨和小分子活性肽-锌配合物。
5.根据权利要求1所述的一种促进酵母生长和细胞活性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将除小分子活性肽-锌配合物以外的成分进行配置并高温高压灭菌，小分子活性肽-锌配合物通过针式过滤器进行除菌，加入到培养基中。
6.根据权利要求1所述的一种促进酵母生长和细胞活性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，加入的酵母菌种的OD660为0.04-0.05，培养温度为28℃，培养时间为96小时。
7.根据权利要求1所述的一种促进酵母生长和细胞活性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，冰水悬浮法包括：取冰水倒入酵母泥中，搅拌使其重新悬浮，再次离心收集，弃上清液，重复两次后，得到酵母菌体。
8.根据权利要求2所述的一种促进酵母发酵性能的方法，其特征在于，所述小分子活性肽-锌配合物的制备是将花生粕用Alcalase、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行水解、超滤得到小分子活性大豆肽；将小分子活性大豆肽与硫酸锌溶液反应，透析离心得小分子活性肽-锌配合物。
9.根据权利要求2所述的一种促进酵母发酵性能的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，将麦芽糖浆用去离子水稀释至糖度为20°P，放置于121℃高压灭菌锅中灭菌15min，配制得到麦芽糖培养基。
10.根据权利要求2所述的一种促进酵母发酵性能的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，在麦芽糖培养基中添加锌含量为20ug/mL的小分子活性肽-锌配合物。
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